全 文 ：兰花菌根菌分泌物成分的初步分析 3
吴静萍　钱　吉 3 3 　郑师章　(复旦大学生命科学学院环境与资源生物学系 , 上海 200433)
【摘要】　通过对福建密花石斛 ( Dendrobium densif lorum) 菌根进行分离、纯化并回接、鉴定得到镰孢菌属
( Fusarium sp . )菌 1 株. 对根菌培养液和菌丝抽提物进行分析 ,发现分泌物中含有 B 族维生素的 B2 、B6 和
Bc (叶酸) ,菌丝内含有维生素 B2 、B6 ,并发现兰花根菌菌丝内含有并向外分泌植物激素 ———赤霉素.
关键词 　兰花 　菌根菌 　分泌物 　抽提物
文章编号 　1001 - 9332 (2002) 07 - 0845 - 04 　中图分类号 　Q936 　文献标识码 　A
A preliminary study on ingredient of secretion from fungi of orchid mycorrhiza. WU Jingping , Q IAN Ji ,
ZHEN G Shizhang ( Depart ment of Envi ronment and Resource Biology , School of L ive Sciences , Fudan U ni2
versity , S hanghai 200433) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2002 ,13 (7) :845～848.
Fusarium sp . , which was not reported before in orchid mycorrhiza research , was isolated from the roots of
Dendrobium desif lorum from Fujian Province by routine work of purification and identification. The results
showed that the secretion contained Vitamin B2 , B6 , and folic acid , and mycelia contained Vitamin B2 and B6 .
It was also found that the mycelia of orchid mycorrhizal fungi contained and secreted gibberellin.
Key words 　Orchid , Mycorrhiza , Secretion , Extraction.
3 国家自然科学基金资助项目 (3950002) .3 3 通讯联系人.
2000 - 02 - 01 收稿 ,2002 - 04 - 04 接受.
1 　引 　　言
兰科植物中有许多药用植物和珍贵花卉 ,在扩
大栽培中 ,将试管苗移入自然界时 ,成活率低 ,且生
长缓慢 ,难于大面积推广 ,其主要原因在于兰花在短
期内无法与相关的真菌形成菌根[3 , 8 ] . 因此 ,搞清兰
花根菌对兰花的营养作用 ,对于摸索出一条兰花的
快速繁殖途径十分重要[16 ] . 关于菌根菌和共生 ,国
内外学者已作了大量研究 ,包括对植物种子萌发、生
长发育、营养代谢等影响[1 ,2 ,11 ,14 ,18 ] . 本研究通过构
建兰花与根菌间的实验系统 , 对兰花菌根菌培养液
和菌丝抽提物进行了初步分析 ,为进一步探讨两者
的种间关系以及兰花与根菌的相互作用机制 , 推进
兰花的工厂化生产提供科学基础.
2 　材料与方法
211 　实验材料
植物材料密花石斛 ( Dem drobium densif lorum ) ,采自福
建植物园.
212 　方法
21211 菌根菌分离纯化 　截取密花石斛的根 ,清水洗净根上
泥沙 ,在 0. 5 %升汞溶液中浸泡 2～3min ,无菌水冲洗 4～5
次 ,无菌条件下截断 ,每段 1cm 左右. 将这些小段接到马铃
薯培养基上 ,于 28 ℃闭光保存至分离体长出菌丝 ,取菌落边
缘部分转到另一盛马铃薯培养基的培养皿中. 重复取菌落边
缘部分进行纯化 ,再接到试管中保存 ,供鉴定.
21212 菌种鉴定 　观察菌丝和大小孢子 ,并进行回接试验 ,
经徒手切片镜检确证 [17 ] .
21213 密花石斛菌丝体 　接少量菌到盛 50ml 不含维生素
BD 的 MS培养液的 250ml 锥形瓶中 ,28 ℃,100 转·min - 1 ,闭
光培养 5d ,4 层纱布过滤 ,分别收集菌培养液及菌丝体. 菌丝
体中加入的水 ,超声波破碎 3min ,再加入适量 0. 2mol·L - 1的
H2 SO4 ,沸水浴抽提 30min ,不时摇动 ,冷却 ,过滤 ,收集滤液.
21214 维生素 B1 [5 ]测定 　将菌培养液和菌丝抽提液各 30ml
置于人造沸石盐基交换管中纯化、沸水浴中浓缩至 5ml 左
右.以无菌培养液为空白对照 ,加入维生素 B1 的标准对照 ,
在激发波长为 400nm 处进行荧光检测.
21215 维生素 B2 测定 　将菌培养液和菌丝抽提液各 10ml ,
每样 2 份 ,加入冰醋酸 1ml , KMnO4 0. 1ml 溶液混匀 ,搁置
10min ,再加入 0. 1ml 3 % H2O2 溶液. 一份用 1mol ·L - 1
NaOH调 p H ≥11 , 以无菌培养液为空白对照 ,加入维生素
B2 的为标准对照 ,在激发波长为 435nm 处测其荧光.
21216 维生素 B6 测定 　将菌培养液和菌丝抽提液各 10ml ,
用 1mol·L - 1 NaOH 调 p H 为 7. 4 ,加 0. 5ml 100μg·ml - 1 KCN
溶液 ,50 ℃水浴中加热 25min ,冷却 ,用 1mol·L - 1 HCl 调 p H
为 3. 8 ,以无菌培养液为空白对照 ,加入维生素 B6 的为标准
对照 ,在激发波长为 325nm 处测其荧光.
21217 维生素 B12测定 　将菌培养液和菌丝抽提液各 10ml ,
以无菌培养液为空白对照 ,加入维生素 B12的为标准对照 ,在
应 用 生 态 学 报 　2002 年 7 月 　第 13 卷 　第 7 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,J ul. 2002 ,13 (7)∶845～848
图 1 　维生素 B1、B2、B6、B12和 Bc 的荧光检测扫描图
Fig. 1 Fluorescent scan result of vitamin B1 , B2 ,B6 , B12 and Bc.
a1 :含 VitmB1的标准液 Standard ( with VitmB1) ,a2 :不含 VitmB1 的空白液 Blank ( without VitmB1) , b1 :含 VitmB2 的标准液 Standard ( with
VitmB2) ,b2 :不含 VitmB2 的空白液 Blank (without VitmB2) ,c1 :含 VitmB6 的标准液 Standard (with VitmB6) ,c2 :不含 VitmB6 的空白液 Blank
(without VitmB6) ,d1 :含 VitmB12的标准液 Standard (with VitmB12) ,d2 :不含 VitmB12的空白液Blank (without VitmB12) ,e1 :含 VitmBc 的标准液
Standard (with VitmBc) ,e2 :不含 VitmBc 的空白液 Blank (without VitmBc) . Ⅰ1 抽提物 Extract , Ⅱ1 分泌物 Secretion. 下同 The same below.
648 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷
激发波长为 275nm 处测其荧光.
21218 维生素 Bc (叶酸)测定 　将菌培养液和菌丝抽提液各
10ml ,以无菌培养液为空白对照 ,加入维生素 Bc ,为标准对
照 ,在激发波长为 365nm 处测其荧光.
21219 赤霉素的测定 　菌培养液和菌丝抽提液获取同前. 另
取抽提的菌丝体液和菌培养液各约 30ml ,用冰醋酸调 p H 值
至 7 左右 ,加入 20ml 乙酸乙酯 ,充分振荡后分层 ,吸取上层
液蒸干. 以 MS空白培养液为空白对照 ,加入赤霉素水溶液
为标准对照 ,在激发波长为 400nm 处进行荧光检测.
212110 检测仪器 　所用检测仪器均为日立 M850 荧光光度
计.
3 　结果与分析
311 　根菌鉴定
经回接实验并切片镜检 ,初步鉴定为半知菌亚
门 ( B asi diom coti m a) 瘤座孢科 ( Tuberculariaceae)
镰孢菌属 ( Fusari um sp . )的真菌[15 ] .
312 　根菌培养液和菌丝抽提物组分分析
由图 1 可见 ,在培养液及其抽提物中都没有检
测到维生素 B1 、B12 ,说明其既不分泌也不含有维生
素 B1 、B12 ;在培养液及其抽提物中都检测到维生素
B2 、B6 ,说明其既分泌又含有维生素 B2 和 B6 ;在培
养液中检测到维生素 Bc (叶酸) ,但是在其抽提物中
却没有检测到说明其能分泌但不含有维生素 Bc .
313 　根菌培养液和菌丝抽提物的赤霉素检测
由图 2 可见 ,菌培养液和菌抽提物中均含有赤
霉素 ,说明该菌既分泌又含有赤霉素. 运用积分法 ,
菌培养液和菌丝抽提物的赤霉素浓度含量经初步计
算 ,为 80～200mg·kg - 1 ,培养液中的浓度比抽提物
中的浓度含量高.
图 2 　赤霉素的荧光检测扫描图
Fig. 2 Fluorescent scan result of gibberellins.
a :含赤霉素的标准液 Standard (with gibberellins) .
4 　讨 　　论
本实验从福建密花石斛根中分离得到的菌根菌
是镰孢菌 ( Fusari um sp . ) 属的一个种 ,而不同于前
人在兰花共生菌根菌中分离得到的伏革菌属 ( Cor2
t ici um ) 、密 环 菌 属 ( A rm illaria ) 、层 孔 菌 属
( Fomes) 、疫霉菌属 ( Phytophthora) 、刺革菌属 ( Hy2
menocbaete) 等菌 ,其中绝大部分是丝核菌属 ( Rhi2
zoctonia) [3 ] , 从而为兰花根菌种类增加了一个新的
内容.
维生素对兰科植物的正常生长发育起着很大的
作用 ,但并非所有的必需维生素兰科植物都能自身
合成. 自 Cappelletti (1947) 首次报道春兰根菌 ( Cor2
t ici um catonii ) 能提供维生素 B1 给兰花后 ,已从兰
花根菌纯培养液中 ,多次分离得到维生素 B1 、维生
素 B1 的前体和烟酸等[10 ] . 由此 , 许多研究人员认
为兰花根菌能为兰花提供维生素 ,尤其是 B 族维生
素.本研究在密花石斛根菌 ( Fusari um sp . ) 的培养
液和菌丝体内均没有检测到维生素 B1 ,但是在其培
养液内明显检测到了维生素 B2 、B6 、Bc (叶酸) ,在其
菌丝体内检测到了维生素 B2 和 B6 ,表明该菌不分
泌维生素 B1 ,但是分泌维生素 B2 、B6 、Bc ,体内不含
有维生素 B1 ,但含有维生素 B2 和 B6 . 这些物质在兰
花根菌的分泌物和抽提物中是第一次检测到. 在这
3 个维生素中 ,B6 为植物体本身不能合成 ,但对兰花
的种子发芽和苗的生长具有良好的促进作用. B2 和
Bc 虽为植物本身能合成 ,但作为辅酶 ,它们一样有
利于苗的正常生长. 本结果丰富了兰花根菌为兰花
提供 B 族维生素的内容 ,并为根菌提供维生素给兰
花的理论再次提供了依据.
适当浓度的赤霉素能促进石斛根的生长. 本研
究结果表明 ,密花石斛菌根菌2镰孢菌体内含有且向
7487 期 　　　　　　　　　　　　　　吴静萍等 :兰花菌根菌分泌物成分的初步分析 　　　　　　　　
外分泌赤霉素类的植物激素 ,虽然植物共生的镰孢
属真菌分泌赤霉素已有很多报道 ,但主要集中在谷
物[6 ] 、玉米[12 ] 、燕麦[13 ]和豆类[7 ] ,而在兰花根菌研
究中尚未见报道. 实验结果表明 , 从根菌分泌物和
抽提物中分离得到的赤霉素 ,在浓度为 0. 5、5、50mg
·kg - 1时可促进兰花苗生根、长根和苗生长 ,显著提
高兰花苗生物量、含 N 量、含 P 量 ,并能在短期内使
兰花硝酸还原酶的活性恢复并达到最大.
此外 , 由于根菌分泌物和抽提物中所含有的成
分不完全相同 , 因此根菌分泌物和抽提物对兰花幼
苗生长和生理代谢的影响具有一定的差异. 总之 ,在
兰花及其菌根菌的相互营养关系中 ,除普遍认为的
菌根菌能将植物所需要的无机物和有机物从土壤中
吸收后再转移给兰花外 ,菌根菌还能为兰花提供维
生素 B1 、维生素 B6 的前体 PABA、氨基酸 ,以及植物
激素 ,从而能使兰花从其共生菌上受益[9 ] .
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作者简介 　吴静萍 ,女 ,1973 年生 ,硕士研究生. 主要从事种
间关系研究 ,发表论文多篇.
848 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷