全 文 ：浙江产车前 ( Pla ntago asiatica)种群遗传分化的
主坐标分析 3
郭水良1 3 3 　张东旭1 　曹　同2
(1 浙江师范大学生命与环境科学学院 ,金华 321004 ;2 中国科学院沈阳应用生态研究所 , 沈阳 110016)
【摘要】　运用 18 个有效的 10mer2寡核苷酸引物对浙江产车前 ( Plantago asiatica)的 8 个种群基因组 DNA
进行了 PCR 扩增 ,共检测到 186 个位点 ,其中多态位点 125 个 ,占 68. 70 %. 应用 Jaccard 公式计算了 8 个
种群在 125 个位点上的相似性. 以此为基础 ,应用主坐标排序 ,作出了 8 个种群遗传分化的三维排序图. 结
果表明 ,8 个种群的遗传分化与地理位置、海拔高度有联系.
关键词 　车前 　种群 　随机扩增多态性 DNA 　主坐标分析
文章编号 　1001 - 9332 (2002) 10 - 1283 - 04 　中图分类号 　Q945 , S718. 55 　文献标识码 　A
Principal axes analyses on population genetic differentiation of Plantago asiatica in Zhejiang. GUO Shuil2
iang1 , ZHAN G Dongxu1 ,CAO Tong2 (1 College of L if e and Envi ronment Sciences , Zhejiang Norm al U niversi2
ty , Jinhua ,321004 ;2 Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang 110016 ) . 2Chin.
J . A ppl . Ecol . ,2002 ,13 (10) :1283～1286.
Eight populations of Plantago asiatica collected from Zhejiang were analyzed using random amplified polymor2
phic DNA (RAPD) . Eighteen of the 60 random primers were selected. 186 bands were amplified by the 18
primers ,and 68. 70 % of them were polymorphic. Jaccard coefficient was applied to compare the genetic of these
eight populations based on the RAPD data. Three2dimensional ordination plot of the eight populations based on
the Jaccard coefficient was constructed by using principal axes analysis ( PAA) . The results showed that the ge2
netic differentiation of eight populations could be explained to a certain extent by their geographical location and
altitude .
Key words 　Plantago asiatica , Populations , RAPD , Principal axes analysis.
3 国家教育部高等学校骨干教师资助计划项目 (No. 1821) .3 3 通讯联系人.
2001 - 08 - 23 收稿 ,2002 - 02 - 17 接受.
1 　引 　　言
车前 ( Plantago asiatica) 历来被列为中药中的
上品 ,全草及种子入药 ,有补肝、利水、清热明目、祛
痰的作用 ,在治疗便秘、慢性气管炎、细菌性痢疾等
方面有疗效. 关于车前的研究 ,主要集中于形态解剖
学、生理学和生态学等方面[5 ] ,用 RAPD 方法对车
前种群遗传分化进行研究 ,国内尚未有报道. 本项研
究的目的 ,在于探讨不同产地的车前的遗传分化特
点 ,分析它们与环境因素间的关系 ,从而为更好地开
发利用车前植物资源提供基础资料.
车前属 ( Plantago L . ) 是世界性分布的植物 ,
Wollf 等 [3 ]应用分子标记区分出了大车前 ( Plantago
m ajor)在荷兰和苏格兰的不同亚种 ,在车前属植物
中 ,繁育系统不同 ,其种内的变异式样也有明显差
异. Wollf 等 [4 ]研究了不同繁育系统的车前属植物在
微卫星 DNA 上的变异特点 ,发现自花传粉程度高
的大车前具有低的种群内变异和高的种群间变异 ,
而异交程度高的长叶车前 ( P. lanceolate) 具有高的
种群内变异和中等程度的种群间变异 , Plantago
coronopus 具有混合的交配系统 ,其种群内和种群间
的遗传变异式样正好处于大车前和长叶车前两者之
间. Sawada 等[2 ]研究了车前 ( P. asiatica) 种群在气
候梯度上的生态型分化 ,目前尚无关于该种植物遗
传分化方面的研究报道.
关于种群遗传分化的研究 ,国内外已有众多的
报道[1 ,8 ] . 但人们对 RAPD 所获得的数据一般应用
聚类树的形式进行表达 ,本文提出应用基于 Jaccard
相似系数的主坐标排序 ( Principal Axes Analysis ,
PAA)来分析 RAPD 数据 ,以反映不同种群间的遗
传差异 ,这方面的工作也将丰富生态遗传学的研究
方法.
2 　材料与方法
211 　植物材料
　　8 个种群均采自野外 ,在每个种群中随机选取 6～12 个
植株 ,用冰袋保鲜带回实验室后提取 DNA. 种群 1、2 采自浙
中金华市郊 ,其中种群 1 取自于浙江师范大学校园 ,种群 2
产于金华北效罗店乡田埂 ;种群 3、4、5 采自浙东天台山 ,三
应 用 生 态 学 报 　2002 年 10 月 　第 13 卷 　第 10 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Oct . 2002 ,13 (10)∶1283～1286
者分布地段的海拔分别为 130、890 和 1040m ,种群 3 位于竹
林下 , 环境比较郁闭 , 伴生植物以鸭儿芹 ( Cryptotaenia
japonica)为主 ,种群 4 和 5 环境郁闭度大 ,比较潮湿. 种群 6、
7 和 8 采自浙西天目山的低海拔处 ,海拔 430～435m ,其中 6
号种群所处地段比较郁闭 ,伴生杂草中以鸭儿芹为主 ,土质
比较硬实 ,7 号种群位于林缘 ,伴生植物以莎草科种类为主 ,
比较开阔 ,种群 8 处于公路边 ,土质硬 ,伴生植物较少.
212 　总 DNA 的提取
DNA 提取方法参考 SDS 法 [7 ] ,按以下步骤进行 : (1) 分
别用清水和蒸馏水洗净叶片 ,用无菌吸水纸吸干 ; (2) 称取
0. 5～1. 0 g 叶片 ,剪碎后在液氮中迅速研磨成细粉末状 ,分
装至 1. 5ml 离心管中. 加入 600μl 提取液 (100mmol·L - 1
Tris - HCl p H 8. 0 ,0. 05 mmol·L - 1 EDTA p H8. 0 , 500mmol·
L - 1 NaCl ,100mmol·L - 1β2巯基乙醇 ,3 %SDS ,剧烈振荡混
匀 ,65 ℃水浴保温 30min ; (3)加入等体积 5mol·L - 1醋酸钾 ,
混匀后冰浴 20min. 4 ℃条件下 12000rpm 离心 20min ; (4) 将
上清液转入新离心管中 ,加 0. 6 体积异丙醇 ,混匀后置于 -
20 ℃保温 30min. 4 ℃条件下 12000rpm 离心 10min ; (5) 弃去
上清液 ,沉淀溶于适量 TE中. (常温 ,20min 左右) ; (6) 酚∶氯
仿 :异戊醇 (25∶24∶1) 和氯仿∶异戊醇 (24∶1) 各抽提一次 ;
(7) 取上清液 ,加入 0. 2 体积的醋酸钠 (0. 3mol·L - 1) 和 0. 6
体积的异丙醇 ,轻轻混匀后 , 4 ℃条件下 12000rpm 离心
10min ; (8) 弃去上清液 ,沉淀经 50～100μl 70 %乙醇清洗 ,
室温干燥 ; (9) 溶于适量 (50～100μl) TE 中 ,低温 ( - 20 ℃)
保存备用.
213 　DNA 浓度和质量的检测
　　总 DNA 纯度和质量的检验采用凝胶电泳检验和紫外吸
收检验 (用 752 分光光度计测定提取总 DNA 样品 OD260 、
OD280 、OD310值. 以 OD260/ OD280值估测其纯度 ,按下式计算
样品浓度 :
　　样品浓度 (μg·μl - 1) = 50 ×(OD260 - OD310) ×稀释倍数.
214 　引物及其筛选
　　本试验所用引物购自上海华美生物工程公司 ,包括 2
组、12 组和 22 组共 60 个引物 , 分别记为 MQ8021 至
MQ8040 ,MQ8221 至 MQ8240 ,MQ8421 至 MQ8440. 任取一
个模板 ,对所有引物进行 PCR 扩增 ,根据扩增条带数的多少
对引物作初步筛选 ,筛选原则是扩增条带数多且条带清晰的
引物.
215 　RAPD 扩增反应
　　总体积 25μl ,其中 1. 0 mmol·L - 1 MgCl2 ;100μmol·L - 1
dN TP ;引物 20ng ; Taq 酶 1U , 约 20～25ng 总 DNA ,PCR 反
应缓冲液、dN TP 及 Taq 酶均为上海华美生物工程公司的产
品.整个 PCR 程序 :94. 0 ℃预变性 4min ,PCR 循环 35 次 ,每
循环 94. 0 ℃变性 1min ,35. 0 ℃退火 1min ,72. 0 ℃延伸 2min.
最后一个循环结束后在 72. 0 ℃延伸 5min.
　　PCR 产物用含有 0. 5μg·ml - 1溴化乙锭 ( EB) 的 1. 4 %琼
脂糖凝胶电泳检验. 以 1 ×TBE 为电极缓冲液 ,电压为 3～
4V·cm - 1 ,稳压电泳 2h. 电泳结果在紫外透射仪上观察、记
录、拍照. 照相机配红色滤光片. 数据处理 : PCR 扩增反应重
复一次 ,选取可重复的 DNA 带 (包括强带和弱带)记录.
216 　数据处理
　　每个样品的扩增带按“有”或“无”记录 ,“有”赋值为 1 ,
“无”赋值为 0 ,得到 8 个种群位点数据. 种群间遗传上的相
似系数按 Jaccard 公式计算 :
　　S ij = a/ ( a + b + c)
式中 , S ij为 i , j 两个种群在遗传上的相似系数 ,其中 a 为 i ,
j 两个种群共有带数 , b 为 i 种群有而 j 种群没有的带数 , c
为 j 种群有而 i 种群没有的带数. 根据 Dij = 1 - S ij公式 ,计
算相异系数 (反映种群间的遗传分化程度) ,再以 Dij为指标 ,
应用主坐排序 ( PAA)对种群的遗传分化进行三维图示 ,并探
讨它们与地理等环境因素间的关系. 主坐标排序应用钟扬
等[6 ]编的计算程序.
3 　结果与分析
311 　扩增结果
　　DNA 紫外分光光度计测定的结果表明 , 8 个
DNA 样本 OD260/ OD280值在 1. 4～1. 7 之间 ,均可用
做 PARD 分析 ,用 0. 7 %琼脂糖凝胶电泳对 8 个
DNA 样本进行检测 ,部分样本有少许降解. 共选用
60 个引物进行 PCR 扩增 ,大部分引物有扩增产物
产生 ,其多态性随引物的不同而表现出差异 ,其中
18 个能够产生清晰并呈现多态性条带的引物 ,用它
们对 8 份材料进行 RAPD 扩增 ,并对这 18 个引物的
扩增结果进行统计分析 (表 1) . 在供试材料中共扩
增到 186 条带 ,引物的扩增带数在 3～15 条之间 ,平
表 1 　车前 8 个种群 RAPD 所用引物及其扩增结果
Table 1 Primers used for RAPD and amplif ied bands of eight popula2
tions of Plantago asiatica
引物
Primers
序列
Sequence (5′- 3′)
扩增得到的
位点数 Amp
lified band
number
多态位点数
Polymor2
phism band
number
多态位点
比率 Propor2
tion of
polymorp2
hic band ( %)
MQ8022 GTCGTCGTCT 10 5 50. 00
MQ8024 ACGGGACCTG 10 5 50. 00
MQ8027 GTGGCCGATG 9 6 66. 67
MQ8032 GGCGAGTGTG 15 13 86. 67
MQ8034 GTCGGTTGTC 15 5 33. 33
MQ8039 AGTCCGCCTG 8 7 87. 50
MQ8040 ACGGAAGTGG 12 8 66. 67
MQ8226 GGGAACCCGT 12 7 58. 33
MQ8231 GTCCATGCAG 12 9 75. 00
MQ8234 AGCCGGGTAA 11 9 81. 82
MQ8237 TCAGCACAGG 8 6 75. 00
MQ8238 TGTCCTGCGT 5 2 40. 00
MQ8425 ACGGAGCTGA 12 9 75. 00
MQ8431 GACGCCTCCA 3 3 100. 00
MQ8432 CAGCTCCTGT 13 9 69. 23
MQ8433 GAGTCGGCTG 13 7 53. 85
MQ8439 AGTAGGGCCT 7 6 85. 71
MQ8440 GTGAACGCTC 11 9 81. 82
总计 Total 186 125
平均 Average 10. 33 6. 94 68. 70
4821 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷
表 2 　18 个引物对车前 8 个种群 DNA扩增所得的多态性位点
Table 2 Polymorphic bands of eight populations of Plantago asiatica amplif ied by 18 primers
引物
Primers
位点
Bands
种群 Populations
1 2 3 4 5 6 7 8
引物
Primers
位点
Bands
种群 Populations
1 2 3 4 5 6 7 8
MQ8022 P1 1 1 1 0 1 1 1 0 MQ8234 P1 0 1 0 0 1 0 0 1
P2 1 1 1 0 0 1 1 0 P2 1 1 1 0 0 1 0 0
P3 1 1 1 0 0 1 1 0 P3 0 0 0 0 1 0 0 0
P4 0 0 1 0 0 1 0 0 P4 0 0 0 0 1 0 1 1
P5 0 0 0 0 0 0 1 0 P5 1 1 1 0 0 1 1 0
MQ8024 P1 0 0 0 1 1 0 0 1 P6 0 0 0 1 0 0 1 0
P2 0 0 0 1 1 0 0 1 P7 1 1 0 1 1 1 1 1
P3 0 0 0 0 0 1 1 1 P8 1 1 0 1 1 1 1 1
P4 1 1 1 0 0 1 1 0 P9 0 0 0 1 0 1 0 1
P5 1 1 1 0 0 1 0 0 MQ8237 P1 0 0 0 1 1 0 1 1
MQ8027 P1 1 1 0 0 1 1 1 1 P2 1 1 0 0 0 0 0 0
P2 0 1 0 0 0 0 0 1 P3 1 1 1 0 0 1 0 0
P3 1 1 1 1 1 1 0 0 P4 1 1 1 0 0 1 0 0
P4 1 0 0 0 1 0 0 0 P5 1 1 0 0 0 1 1 1
P5 0 0 0 1 1 0 1 1 P6 0 0 0 0 0 1 0 0
P6 0 0 0 0 0 0 1 1 MQ8238 P1 0 0 0 0 0 1 0 0
MQ8032 P1 0 0 0 0 0 0 0 1 P2 1 1 1 1 0 1 0 0
P2 0 0 0 0 0 0 0 1 MQ8425 P1 1 1 0 0 0 1 0 0
P3 0 0 0 0 0 0 0 1 P2 0 1 0 0 0 0 0 0
P4 1 1 1 0 0 1 0 1 P3 1 1 1 0 0 0 0 0
P5 0 0 0 1 1 0 0 0 P4 1 1 1 0 0 1 1 1
P6 1 1 0 0 1 1 1 0 P5 1 1 0 0 0 0 1 1
P7 0 0 0 0 0 1 0 1 P6 1 1 1 0 0 1 1 1
P8 0 0 0 1 0 0 0 1 P7 0 0 0 0 0 0 1 1
P9 0 0 0 0 1 1 1 1 P8 0 0 0 0 0 0 1 1
P10 1 1 0 1 1 1 0 1 P9 1 1 1 0 0 1 1 1
P11 0 0 0 1 0 0 0 1 MQ8431 P1 1 1 1 1 1 1 0 0
P12 0 0 0 1 0 1 1 1 P2 0 1 0 1 1 1 1 1
P13 0 0 0 1 0 0 0 1 P3 0 0 0 1 1 0 0 0
MQ8034 P1 0 0 0 0 0 1 1 1 MQ8432 P1 0 0 0 0 1 1 0 1
P2 0 1 1 1 1 0 0 0 P2 0 0 0 0 1 0 0 0
P3 1 1 1 1 0 1 0 1 P3 0 1 0 0 0 1 0 0
P4 0 1 0 1 0 1 0 1 P4 0 0 1 0 1 1 0 1
P5 1 1 0 1 0 1 0 1 P5 0 0 1 0 1 1 0 1
MQ8039 P1 0 1 0 1 1 1 1 1 P6 0 0 1 0 1 1 1 1
P2 0 1 1 0 0 1 1 1 P7 0 0 0 1 0 0 0 1
P3 0 1 1 0 1 1 1 1 P8 0 0 1 0 1 1 1 1
P4 0 1 1 0 1 1 1 1 P9 0 0 0 1 1 0 1 1
P5 0 1 1 1 1 1 1 1 MQ8433 P1 1 1 0 1 1 1 1 0
P6 0 1 1 0 1 1 0 1 P2 0 0 0 0 0 1 0 0
P7 0 0 0 0 1 1 0 1 P3 0 0 0 0 0 0 1 0
MQ8040 P1 0 0 1 0 1 1 1 1 P4 0 0 0 0 1 0 0 0
P2 1 1 1 0 0 1 0 0 P5 0 0 0 0 1 1 0 0
P3 0 1 0 0 1 1 1 1 P6 0 0 0 1 0 0 0 0
P4 0 0 0 0 1 1 1 1 P7 0 0 0 1 0 0 0 0
P5 1 1 0 1 0 1 0 0 MQ8439 P1 1 1 1 0 0 0 0 0
P6 0 0 0 1 1 1 1 1 P2 0 0 0 1 1 1 1 1
P7 0 1 0 1 0 1 1 1 P3 0 0 0 1 0 1 1 1
P8 1 1 0 1 0 0 0 0 P4 0 0 0 0 0 0 1 0
MQ8226 P1 1 1 1 1 0 0 1 1 P5 0 0 0 1 0 1 1 1
P2 1 0 0 0 0 0 0 0 P6 0 0 0 1 0 1 1 1
P3 0 0 1 1 1 0 1 1 MQ8440 P1 1 1 1 0 0 1 1 1
P4 0 1 1 1 1 0 1 1 P2 1 1 1 0 0 1 0 1
P5 1 1 1 0 1 0 1 1 P3 0 0 0 1 1 0 1 1
P6 1 1 1 0 0 0 0 0 P4 0 0 1 0 1 0 0 0
P7 1 1 0 1 0 0 1 1 P5 0 1 1 1 1 1 1 1
MQ8231 P1 1 1 1 1 1 1 1 0 P6 0 0 1 0 0 0 0 0
P2 1 1 1 1 1 1 1 0 P7 0 0 0 1 1 1 1 1
P3 0 1 0 1 1 1 0 0 P8 0 1 0 1 1 0 1 1
P4 1 1 1 1 1 1 0 0 P9 0 0 0 1 0 0 0 1
P5 0 1 0 0 0 1 0 0
P6 0 0 0 1 0 1 0 0
P7 1 0 0 1 1 1 0 0
P8 0 0 0 1 0 0 0 0
P9 0 0 0 1 0 0 0 0
均每个引物扩增的 DNA 带数为 10. 33 条 ;其中 125
条带具有遗传多态性 ,约占总数的 67. 80 % ,每个引
物可扩增的多态带不等 ,从 2 条到 13 条变化 ,平均
为 6. 94 条 (表 1) ,表明不同产地的车前种群之间具
582110 期 　　　　　　　　　　　　　郭水良等 :浙江产车前种群遗传分化的主坐标分析 　　　　　　
有较高的遗传变异. 图 1 为 MQ8022、MQ8234 引物
对车前 8 个种群样本的的扩增结果. 由图 1 可见 ,产
生的 DNA 片段主要分布在 0. 56～2. 027 Kbp 区域 ,
少数片段小于 0. 56 Kbp .
312 　种群遗传分化的主坐标排序和主成分分析
　　由于单态位点的数据对种群的遗传分化没有影
响 ,根据表 2 数据 ,按 Jaccard 公式计算 8 个种群的
遗传相似系数 ,将之转化为相异系数后 ,应用主坐标
排序得到 8 个种群遗传分化的三维排序图 (图 2) .
　　种群间的 RAPD 片段共享度能够在一定程度
上反映种群间 DNA 的差异 ,主坐标排序应用了以
RAPD 数据计算而得到的 Jaccard 相似系数 ,因此 ,
图 2 中的位置关系能够反映出它们在遗传上的相似
性 ,在排序图上 ,种群的位置越近 ,则它们的遗传组
成越相似. 从图 2 可以发现 , 8 个种群存在一定的遗
传分化 ,其中种群 1、2 分别取自金华市郊 (浙江中
部) ,两者海拔较低 ,生境比较开阔 ,伴生较密的其它
杂草 ,从地理位置上讲 ,8 个种群中 ,1、2 号种群的地
理位置是最接近的 ,这两个种群在排序图上的位置
也非常近 ;6、7、8 号 3 个种群均取自浙江西天目山 ,
它们几乎分布在同一海拔高度 ,都位于公路两侧 ,水
平位置上距离也大致在 2km 左右 ,相对于其它 5 个
种群 ,这 3 个种群在地理位置上比较接近. 从排序图
上可以发现 ,它们的遗传相似性较高. 3、4、5 种群均
取自浙东天台山 ,分布的海拔覆高度有较大差异 ,分
别为 130、890 和 1040m ,相互间的距离也较大 ,在排
序图种群3、4、5的位置相对比较远 ,表明它们间的
图 1 　由 MQ8022 (a)和 MQ8234 (b)扩增产生的 DNA 指纹图谱
Fig. 1 DNA fingerprints amplified by primer MQ8022 (a) and MQ8234
(b) Sample 1～8 were listed in table 1 , M is the standard molecular
weight of Lambda DNA / Hind Ⅲ+ EcoR Ⅰ) .
图 2 　基于 RAPD 分析数据的 8 个种群遗传分化 PAA 三维排序图
Fig. 2 PAA three2dimensional ordination plot of eight populations based
on the RAPD data.
遗传分化较大 ,但与种群组 1、2 和种群组 6、7、8 相
比 ,排序图上 3、4、5 种群间的距离还是比较接近 ,能
够自成为一组. 5 号种群所处的海拔最高 ,该种群与
其它种群的遗传差异最大. 从图 2 可以发现 ,地理分
布上的差异明显地影响到车前 8 个种群遗传上的分
化 ,两者具有明显的对应性 ,其次 ,种群在海拔高度
上的差异也会影响它们的遗传分化.
参考文献
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tionship of Roegneria. Acta Bot S in (植物学报) ,41 (10) :1076～
1081 (in Chinese)
作者简介 　郭水良 ,男 ,1964 年生 ,博士后 ,研究员 ,从事植
物分类与生态学研究 ,发表论文 60 余篇. E2mail : guoshuil2
iang @163. com
6821 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷