全 文 ：3 6 4 病毒学朵 志 4 , 1 9 8 8
V i r o l o g i e
a S i n i e a
长叶车前花叶病毒上海分离株
单克隆抗体的制备及其免疫学特性
I 单克隆抗体制备 、 亚类测定及免疫沉淀反应
涂正金 于善谦 张若平 王鸣歧
( 复旦大学生 物系 , 上海 )
提 要
采用杂交瘤技术 , 以长叶车前花叶病毒上海分离株 ( R M V s h ) 为抗 原免疫 B A L B c/
小鼠 , 取脾脏细胞与骨髓瘤 S P 2/ 0 细胞融合 , 经筛选克隆 , 共获得 1 112 、 7 1妞 、 10 H I 、
1 1 H 2
、
12 H 3
、
1 7H 6
、
2 9H 1 7 株分泌 R M v s h 单克隆抗体的杂交瘤细胞 株 。 以双抗夹心
E L I S A 方法测定亚类 ; I H 2属 I g G 了, 7 H I属 I g G Z b , 其余均为 I g C , 。 7 个杂 交 瘤 植入 鼠
体内均产生腹水 。 在免疫双扩散反应中 I H 2 、 1 2 H 3 能与 R M v s h 产生免疫沉 淀线 , 而其
余 S 个单克隆抗体均不能与 R M V s h 产生沉淀线 。 制备的单克隆抗体可用 于病毒病害的诊
断鉴定 , 也可用于进一步分析病毒的抗原特性 。
K “ h le r & M il o et i n 〔`〕 建立的杂交瘤技术使免疫学获得 了突破性进展 。 由于用该技
术获得的单克隆抗体具有特异性高 、 标准性强及杂交瘤细胞可 以长期保存等优点 ,从而在
生物学和医学研究等许多领域中得到 日益广泛的应用 。 在植物病毒研究方面 , 近几年巳
有 30 余种病毒 制备了单克隆抗体 ` 2 〕 , 并广 泛地应用于病毒分子生物学研究 〔 3 一 ` 〕 , 病毒
株系的分析 〔 5 〕及病泰病害的诊断鉴定上 。 长叶车前花 叶 病毒 ( iR b gr “ 5 0 M o s a ic iV lrt ”
简称 R M V 或 H R V ) 是烟草花叶病毒群的一个成员 , 有 许多株系 , 流行范 围广 泛 , 特
别是在十字花科等蔬菜上造成严重的危害。 因此建立灵敏 、 高特异性的病毒检测 、 分析
方法对 R M v 及其有关株系进行 比较研究有重要的理论与实际意义 。 本文将分几部分报
道长叶车前花叶病毒上海分离株单克隆抗体的研制及其在株系鉴别 、 病毒抗原结构特性
分析等方面的研究结果 。
材 料 与 方 法
一 、 病毒来源及纯化 长叶车前 花叶病 毒上 海 分离株 是木 室 自青菜 ( B 7’a s 。` 。
c 无公n e s i s ) 上分离得到的 〔 7 , 。 病毒 以三 生烟 ( N 艺e o t i a n a t o b a e c o m e v . S a m s u n ) 进
行繁殖 。 纯化方法同文献 〔“ 〕。
本文于 工9 87年 9月 2日收到 。
脚 .学杂 志 4, 1 9 8 8
V i r o l o g i 亡一 S i n i e a
3 6 5
二 、 小鼠免疫 选用重约 1 8 9的健康雄性 B A L B c/ 小鼠 , 每次腹腔与皮下注射病毒
抗原约 5 0 群 g 。 第一次用完全佐剂 , 第二次用不完全佐剂 , 间隔二周 。 第三次注射于融
合前 3一 4 天进行 , 由尾静脉注入 1 0 0对 g / 5 0川 的抗原溶液 。
三 、 细胞培养与细胞融合 小鼠骨髓瘤细胞选用 S P Z / o , 细胞培养液为含 15 %小牛
血清 ( 天津生化希1!品厂 ) 的 R p M I 1 6 4 0 ( G I B C o ) 。 免疫小鼠的脾脏细胞与 S p Z / o 细胞
的融合及选择按 巳报道的方法 〔 5〕进行 。 融合剂为 50 % 聚乙二醇 ( M . W . l 0 0 0 , M e r ck ) 。
四 、 杂交瘤的筛选 、 克隆和小鼠腹水的制备 采用间接酶联免疫 吸附法 ( E IL S A )
筛选杂交瘤 〔` 〕: ① 于 40 孔聚苯乙烯板 (天津有机玻璃制品厂 ) 中加入 0 . 肠 m “ l / L N “ : C O 3
缓冲液 P H g . 6 , 每孔 1 0 川 , 37 ℃ 处理 2 小 时 ; ② 用洗 涤液 ( o . 0 1 m “ l/ L 磷酸缓 冲液
p H 7
.
4 含 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 ) 吸洗 4 次后 , 各孔加入以 0 . o l m o l / L 磷酸缓冲液 p H s . o 稀
释成 2 0产 g / m l的R M v s h抗原溶液 1 0 0召 l , 3 7 oC 反应 2小时 ; ③洗涤 4 次 , 用 0 . 2 5 % 牛血
清白蛋 白溶液加满各孔 ,封 闭反应 2 小时 ; ④洗涤 4 次后 , 加入 10 0川 杂交瘤细胞培养上
清液为待 测样品 , 反应同样时间 ; ⑤洗涤 4 次 , 加入 1 : 1 0 0 0稀释的碱性磷酸醋酶联羊
抗 鼠 Ig G ( S i g m a ) , 反应 2 小时 ; ⑥洗涤后 , 加入 l m g / m l 的对硝基酚磷酸钠 ( S i g m a )
底物溶液 10 0川 , 37 ℃反应 3 小时 , 3 m o l/ L N “ o H 1 0 川 终止酶反应 , 酶标比 色仪测定在
4 o s n m 波长下的读数。 反应较强的孔中杂交瘤细胞用有限稀释法 〔 , 〕进行克隆 , 培养与筛
选方法同前 。 选出的单个克隆细胞进行扩大培养或第二次克隆 。 获得的阳性杂交瘤细胞
株悬浮于含 10 % 的二 甲亚飒 ( D M S o ) 完全培养液中 , 液氮中 长期保存 , 并按常规方法
制备小 鼠腹水 。
五 、 单克隆抗体亚类的测定 约 10 ” 个杂交瘤细胞以 4 m l 无血清 R P M I 1 6 4 0 培 养
液培养 3 天 , 收集上清液作为不含其它杂蛋白的单克隆抗体液用于抗体亚类的测定 。 亚类
测定方法采用双抗 夹心 E IL S A 法 : 聚苯 乙烯板先分另l]以 1 : 1 0 稀释的羊抗 鼠烤 G 的抗
血清 (上海市放射免疫研究所 , 多抗 , 正对照 )及其亚类抗血清 ( 上海生物制品研究所 )
包被 ; 杂交瘤细胞无血清培养液作为抗原加入 ; 酶联羊抗鼠 I g G 作为第二抗体 ; 其它反
应 条件同前 。 以 0 . o l m o l / L磷酸缓冲液 P H 7 . 0 含。 . 15 m “ 1/ L N “ 1C ( P B S ) 及鼠多克隆抗
体作对照 。
六 、 免疫双扩散反应 1 % 琼脂糖以 P B S 配制 。 用浓度为 1 . 20 m g加 1 的病毒抗原
与小鼠腹水进行免疫双扩散反应 , 24 小时后观察结果 , 并以氨基黑 10 B 染色 。
七 、 感染性的 中和试验 纯化的 R M v “ h 50 召 g加 l 与等体积的不 同稀释度的 单 克
隆抗体腹水混和 , 37 ℃ 反应 2小时 , 4 ℃放置过 夜 。 以半叶法磨擦接种于心叶烟 ( N ic ot -
艺a n a 9 1: t艺n o s a ) 上 , 4 天后作枯斑汁数 。 以 p B S 作对照 。
八 、 用单克隆抗体诊断感染植物 R M V s h 感染的三生烟 , 于 o . Zm “ l/ L P B P H 7 . 0中
研磨 , 低速 离心 , 上清液经 60 ℃处理 0 . 5 小时 。 用单克隆抗体 10 H I 以间接 E IL S A 方法测、
定汁液反应 。 以 单克隆抗体 I H 2 、 1 2 H 3测定对汁液的免疫双扩散反应 。 同时均以健三生
烟汁液作对照 。
3 6 6 病毒学杂志 4 , 19 8 ,
V i r o l o g i e a S i n i e a
结 果
一 、 杂交瘤细胞株的建立 :
R M V , h 免疫 B A L B c/ 小鼠脾脏细胞与骨髓瘤 S P Z o/ 细胞在聚乙二醇作用下融合 。
经 H A T 培养液选择性培养 , 3 ~ 5 天可 见杂交瘤细胞开始生长繁殖 , 而对照 的 S ZP o/ 细
胞大量萎缩死亡 。 7 天后杂交瘤细胞可长成较大的细胞群落 , 更换 H T 培养液 。 14 天后
长成肉眼可 见的细胞群落 。 间接 E LI S A 方法筛选抗体阳性孔 。 四次融合及 抗体阳 性孔
率如表 1所示 。 抗体活性较高的阳性杂交瘤用有限稀释法克隆 , 间接 E LI S A 复筛 。 最
后分别从 7个孔中分离得到 7 株分泌 R M V s h 单克隆抗体的杂 交瘤细胞株 , 分 别命 名
为 : I H 2 、 7 H I 、 1 0 H I 、 1 1 H 2 、 12 H 3 、 1 7 H 6 、 2 9 H I 。 经体外长期传代 , 反复冻融均稳
定地保持分泌单克隆抗体的能力。
T a b
表 1 杂交瘤及抗体阳性孔率
.
p e r e e n t a g e o f t h
e w e l l e o n t a i n i n g h y b
r i d o m a 3
a n d a n t i b o d y
一
s e e r e t i n g h y b r i d o m a s
.
融 合、 八 杂 交 瘤 孔 数 及 阳 性 孔 率
瘤细胞数 脾细胞数次 数 总 数 杂 交 瘤 阳性杂交瘤
3
.
45 x 1 0 7 6 7 X 10 8 3 1 8
9 5 X 1 0 3 1 8
80 X 1 0 7
2
.
] 0 义 1 0 8
8 3 0 X I O 7 3 1 8
25 X 1 0 7 6 0 5 X 10 2 3 8
1 9 8 ( 6 2
.
3肠 )
6 2 ( 19
.
5肠 )
2 6 8 ( 5 4
.
3肠 )
2 0 1 ( 8 4
.
5肠 )
4 5 ( 2 2
`
7肠 )
3 6 ( 5 8
.
2务 )
4 6 ( 17
.
2肠 )
5 4 ( 2 6
.
9肠 )
二 、 单克隆抗体亚类的测定 :
双抗夹心 E LI S A 方法测定单克隆抗体亚类反应的结果见表 2 。 对于每一种单克隆抗
表 2 双抗夹心 E L IS A 方 法测定单克隆抗休亚类
T a b 2 D
c t e e t i o n o f t h e s u b c l a 已 9 o f z n o n o e l o n a l a n t i b o d y
b y d o u b l e a n t i b o d y s a n d w 主e h E L I S A
亚 类 1 H Z 了H l 1 OH I l 工H Z
扎0z八Uonl八JOǎU即01 g G i
! g G Z 。
1 g G
: 西
I g G 3
0 0 3 6 O
_
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0 0 2 4 0 0 0 () 0 0 0 0 O
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.
0 0 0 0
.
0 9 3 O
.
O I G 0 13
0 2 0 5 0
.
0 0 0 0
.
0 3 5 0 0 0 0
1 2 H 3
0
.
1 0 9
0
.
0 0 0
0
.
0 0 0
0 0 0 0
1 7 H 6 29 H l P B S M P
e二
0 0 0 0 0
_
8 7 0
0 0 0 0 0
.
2 80
0 0 0 0 0 82 1
0 0 1 4 0
.
6 4 5
I g G 0
.
0 8 5 0
.
0 9 3 0
.
2 0 4 0
.
2 2 0 0
.
1 3 2 0
.
1 6 6 0
,
1 2 4 0
.
00 0 65 0
. P B S : 磷酸缓冲液 , ” M P 。 : 鼠多克隆抗体 .
体在四种亚类抗血清包被的孔中只有一个阳性反应孔 。 以包含各个亚类的羊抗鼠 gI G 测
定同样也是阳性反应 。 因此确定单克隆抗体 I H 2属 gI G 3 , 7 H I 属 gI G ; 、 , 其余 5 个单克
病毒学杂志 4 , 1 0 5 5
V l r o l o g i o a s 玉皿 i o a 3 6 7
隆抗体均属 gI G : 亚类。 对照中 , 磷酸缓冲液无反应 , 鼠多克隆抗体都 有较 强的反应 。
三 、 单克隆抗体免疫沉淀反应特性
7 种单克隆抗体对抗原 R M vs h 免疫双扩散反应结
果如图 i 所示 。 其中 I H2 、 12 H 3 能与 R M v s h 反应形成
免疫沉淀线 , 而单隆抗体 7 H I 、 l o H I 、 1 1 H 2 、 1 7 H 6 、
2 9 H I 均不能与 R M v s h 反应形成免疫沉淀线 。
四 、 单克隆抗体对病毒感染的中和作用
单克隆抗体 I H 2 、 10 H I 、 2 9H I 对病毒感染 的中和
试验结果 见表 3 。 I H2 在 10 一 , 浓度时能完全 中和 病毒
的感染 , 但中和能力随稀释度 的增 大而减 弱 。 10 H .I
2 9 H I 在 1 0 一 ` 浓度时仅能部分中和病毒感染 , 在 1 0 ” 稀
释度以上基本无中和作用 。
l 单克隆抗体又士抗原 的
免疫扩散反应
R M v , h
,
( l )
: I R 2
,
( 2 )
:
( 3 )
: 1 0蛋1 1 , ( 4 ) : 1 I H Z
,
12 H 3
,
( 6 )
: 1 7 H 6
,
(了) :
I m 血 u n o d玉f f u s i o n r e a e -
t i o n o f m o n o e l o n a l
a n t i b o d y w i t h a n t i g e n
.
图勺州。g2·gl
F
表 3 单克隆抗休对病毒感染的中和作用
T 扭 b 3 N e u t r a l 玉: a t i o n o f 场 e i n f e o t i v i t y o f R M v s h
b y m o n o e l o n a l a n t i b o d了 .
单克隆抗体 稀 释 度
10 一 1 1 0 一 2 1 0 一 S 1 0 一 4 10 - P B S
I H 2 0
.
0 19
,
2 1 5
.
2
1 OH I 5
0
.
5
5
.
0
20
.
2
2 5
.
3 3 0
.
5 2 6
.
7
2 9 H I 6
,
3 1 8
.
3
1 5
.
2
1 5 8
14
。
8 15
.
5 3 5
.
3 5
.
5
五 、 单克隆抗体检测 R M v , h 感染植物
n`的O叶0
0
.
0
图 2
F i名 2
8 0 0 4 0 0 2 0 0
稀释度 D i l u t i o n
单克隆抗体 10 H I间接 E L sI A法检测
植物中病毒
1
.
R M V 止 感染植物 , 2 . 健康植物
D e t e e t i o n o f , i r u , i n t五 e P l a n r
b y m
o n o e l o n a l a n t i b a d了 i n
1 n d i
了 e o t E L I S A
l
:
R M V s h i o f e e 之e d P l a 皿 t ,
2
:
H e a l t h p l a n t
.
图 3 单克隆抗体对植物汁液的免
疫扩散反应
( z )
: I H 2
,
( 2 )
: x Z H 3 ,
( H )
: 健植株 , ( I ) : R M v s 五感染植株
F 19 3 I m 功 往 n o d i f f u s i o n r e a e t i o n
0 f m o n o e l o n a l a n t主b o d y w 主t 五
P l a n t 吕 a P .
( H )
:
H e a l t 五 p l a n t ,
( J )
:
R M y
:
h i n f e o t e d P l a n t
.
3 6 8 病毒学杂志
V i
r o l o g i e a
4
5 i
19 8 8
n l e扭
以间接 E IL SA 方法测定单克隆抗体 10 H I 对植物汁液的反 应结果 如图 2所示 。 感
染的三生烟呈现很强的反应 , 稀释到 1 : 3 2 0 0 时仍有较明显 的阳性反应 。 而健 烟 无反
应 。 同样 以 I H Z、 12 H 3 对两种汁液作双扩散反应 , 结果病毒感染 的汁液 有免疫 沉淀线
出现 。 而健 汁液无反应 ( 见图 3 ) 。
讨 论
采用杂交瘤技术建立了 7 株分泌长叶车前花叶病毒上海分离株单克隆抗体的杂交瘤
细胞株 。 这 7 个细胞株分泌的单克隆 抗体经 测定分属于 I g G 3 、 枯G Z。 和 gI G : 亚类 。 测
定亚类所用的双抗夹心 E LI S A 方法较常规所用的免疫双扩散法 〔’ 。 ,敏感 , 比文献报道的
间接 E LI S A 方法 〔` 。 〕简单 。 羊抗鼠 I g G及其亚类抗血清国内有商品供应 , 并能稀释至少
10 0 倍使用 。 杂交瘤细胞株的无血清培养液不 需要一浓缩 , 而且用量也少 。 因 此该方法适
用于抗体亚类的快速分析 , 结果可靠 。
在制备的 7种单克隆抗体中 , 仅 I H 2 、 12 H 3能与抗原在琼脂双扩散中反应形成免疫
沉淀线 , 同样 I H 2 也能中和病毒 , 使其失去感染性。 其余 5 种单克隆抗体均不 能与抗原
反应形成免疫沉淀线 , 同样 10 H I 、 2 9 H I 也不表现完全的中和病毒感染作用 。 这可能是
因为抗原决定簇不在病毒外壳蛋 白表面所致 。 制备的单克隆抗体能特异地检测病株汁液
的带毒情况 , 为单克隆抗体在病毒病的快速鉴定中的应用提供了条件 。 关于在病毒抗原
结构分析方面的研究结果将另文报道 。
参 考 文 献
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V ir o lo l ge a
4
, 1 9已它
5 i n i e a
3 6 9
P r e p a r a t i o n a n d lm m u n o lo g i e a l P r o P白r t ie s o f
M o n o e lo n a l A n t ibo d i e s t o R ibg r a s s
M o s a ie V i r u s ( R MV sh )
P r e p a r a t i o n o f M
o n o c l o n a l A n t i b o d i e s , S u b e l a s s e s
D e t e r m i n a t i o n a n d I m m u n o P r e e i P i t i n R e a e t i o , i
T u Z h e n g 一 j i n Y u S il
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U s i n g h y b r i d o m a t e e h n i q u e s
, s e v e n h y b r i d o m a e e l l l i n e s : I H z , 了H l ,
1 0 H I , 1 1 H 2
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1 2 H 3
,
1 7 H 6 , 2 9 H I , s e c r e t i n g m o n o e l o n a l a n t i b o d i e s t o S h a n g h a i
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a n t i b o d y s a n d w i e h E L I S A
.
I H 2 , 7 H I a n d o t h e
r m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s b e l o n g
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n e d w h e n t h e s e h y b r i d o m a e e l l s w e r e i n i
e e t e d t o B A L B /
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.
A P r e e i P i t i n
1 i n e w a s f o r m e d w h e n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s I H 2 , 1 2 H 3 r e a e t e d w i t h t h e a n
-
t i g e n o f R M v s h i
n a g a r o s e m e d i u m b y d
o u b l e i m m u n o P r e e i P i t i n 一 b u t n o
P r e e i P i t i n l i a e w a s f o r m e d w i t l o t h e r f i v e m o n o e l o n a l a n t i b o d i e s
.
M o n o e l o n a l
a n t i b o d i e s p
r e p a r e d h e r e e o u l d b e u s e d i n t h e d i a g n o s i s o f i n f e e t e d P l a n t s
a n d t h e a n a l y s i s o f t h e a n t i g e n i e P r o P e r t i e s o f t h e v i r u s
.