全 文 ：磷酸缓冲液对植物脂质过氧化的影响及
其与亚硫酸伤害的关系*
韩 阳 刘荣坤 (辽宁大学生物系,沈阳 110036)
摘要 以亚硫酸模式处理不同类型植物, 从脂质过氧化方面探讨了磷酸缓冲液的防护
作用.结果表明, 植物经磷酸缓冲液处理后, 对亚硫酸伤害具有明显的防护作用. 磷酸缓冲
液可稳定细胞膜结构,降低 MDA 含量, 增强叶绿素 ! ! ! 蛋白质的结合度, 且与低浓度亚
硫酸对 SOD活性呈协同效应. 磷酸缓冲液的防护作用因植物种类而异. 同一污染环境下,
MDA 含量高, 叶绿素结合度低者效应显著.在测试植物中, 银杏> 连翘> 小麦苗.
关键词 磷酸缓冲液 亚硫酸伤害 脂质过氧化 叶绿素结合度
Effect of phosphate buf fer on membrane lipid peroxidation of plants and its relation to sul
phurous acid harm.Han Yang and Liu Rongkun ( L iaoning Univer sity , Shenyang 110036) .
Chin . J . A pp l . Ecol . , 1998, 9( 2) : 201~ 205.
Three kinds of plant treated with sulphurous acid were used to study the prot ective function of
phosphate buffer in respect of membrane lipid peroxidation. The r esult shows t hat after the
plants were sprayed w ith phosphate buffer , they had an obvious protectiv e function to the harm
caused by sulphurous acid. The phosphate buffer could stabilize the cell membrane structur e,
decrease the content of M DA , and increase t he degree of chlorophyllpro tein binding. It also
had a coordinated effect on SOD activity w ith sulphurous acid at low concentration. T he protec
tive effect of phosphate buffer w as different with plant species. In the same polluted environ
ment , the plants with high MDA concentr ation and low chlorophyll binding degree had greater
protect ive function, and the effect order of tested plants w as Ginkgo biloba> For sy thia suspen
sa > T r iticum aestivum .
Key words Phosphate buffer, Sulphurous acid harm, Membrane lipid peroxidation, Chloro
phy ll binding degree.
* 沈阳市科委重点资助项目( 96- 50) .
1998- 01- 14收稿, 1998- 02- 09接受.
1 引 言
大气 SO2 对植物造成伤害已成世界
性问题,因而寻找提高植物抗性,减轻或消
除 SO2损害的有效途径已被国内外环境
生物学者普遍关注∀2, 9, 11, 12#. 刘荣坤等∀2, 3#
报道用 1/ 15mol∃L - 1, pH6. 4 的磷酸缓冲
液处理小麦苗, 可稳定细胞膜结构, 减少
K+ 渗漏, 并能提高保护酶活性, 增强酶谱
带,对减轻 SO2 伤害具有明显的防护作
用. 前述研究多采用一年生植物, 而对受
SO2 伤害的多年生木本植物报道较少; 已
知 SO2 进入植物细胞主要是通过亚硫酸
(HSO-3 或 SO2-3 )启动自由基进行过氧化
伤害∀12#,而亚硫酸的直接影响与磷酸缓冲
液的关系也未见阐述. 本文采用不同类型
的植物,按亚硫酸模式处理,从脂质过氧化
方面探讨磷酸缓冲液的影响,为进一步揭
示磷酸缓冲液对植物 SO2 的防护效应及
其适用范围提供科学依据.
应 用 生 态 学 报 1998 年 4 月 第 9 卷 第 2 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Apr. 1998, 9( 2)%201~ 205
2 材料与方法
21 材料
供试材料为小麦 ( T riticum aestivum )、连翘
( Forsythia susp ensa )、银杏 ( Ginkgo biloba ) . 小麦
种子经 1%安替福民消毒, 浸种后播于覆有多层
纱布的磁盘中水培, 达 3 片叶苗高约 13cm 进行
实验; 树木则采取树冠外围的当年生健康枝条,
置于盛有自来水的烧杯中待测.
22 磷酸缓冲液处理
小麦苗按文献∀3#的方法进行; 树木则每日
9: 00 向叶面喷洒 0 4mol∃L- 1 , pH6 4 的磷酸缓
冲液.每日处理 1 次, 连续 3 次.
23 亚硫酸处理
按通用的方法∀4, 5, 9#, 叶片流水洗净、晾干、剪
成 1cm 长叶段, 称取 1g, 浸于浓度为 0、5、20、50、
100mmol∃L - 1的 NaHSO3 溶液中, 静浸 2h 后取出
测定.
24 粗酶提取液制备
将叶片加入预冷的 005mol∃L- 1 , pH7 8 磷
酸缓冲液(含 0 2mmol∃L - 1EDTANa2, 5% PVP )
及少许石英砂,冰浴中研磨, 匀浆于 13000 & g 下
冷冻离心 20min, 上清液用于 SOD 活性及 MDA
含量测定.
25 SOD(超氧物歧化酶)活性测定
按文献∀1#方法进行.
26 MDA(丙二醛)含量测定
以 MDA为脂质过氧化指标, 按 MDA与硫代
巴比妥酸的定量方法测定 MDA含量∀8#.
27 质膜透性测定
用 DDS1 型电导仪测定渗出电解质的电导
率作为膜透性指标. 叶片渗出物电导率= 浸泡材
料的溶液电导率- 空白溶液电导率.
28 叶绿素结合度测定
参考波钦诺克的方法∀13#, 用非极性石油醚溶
剂仅提取因类囊体膜伤害而游离的叶绿素; 用含
有 04%乙醇的石油醚, 可提取包括与蛋白质结
合不牢固的叶绿素部分; 用含有 0 8% 乙醇的石
油醚,可提取包括与蛋白质结合牢固性中等的叶
绿素部分;用 80%丙酮提取包含结合牢固的所有
叶绿素. 按 Arnon 法∀14#计算叶绿素组成含量. 按
下式计算叶绿素结合度( Y ) : Y%= (未被浸提的
叶绿素浓度/总叶绿素浓度) & 100%
3 研究结果
31 磷酸缓冲液对植物脂质过氧化的防
护作用
311 亚硫酸对脂质过氧化的影响 从图
1看出,小麦苗 MDA 含量与电解质渗漏均
依亚硫酸浓度的增高而增加,其相关系数
( r)分别为 0835 和 0911( P< 001) , 伤
害规律明显; MDA含量与电解质渗漏间关
系尤为密切 ( r = 0948) , 具有很高的一致
性;而 SOD 活性依亚硫酸浓度增加而减
小,呈密切的负相关变化( r = - 0942) .在
低浓度亚硫酸条件下( 5mmol∃L - 1NaHSO3
以下) , SOD活性增加了 167% ,可能低浓
度亚硫酸对 SOD活性略有促进,至少不具
伤害.不同植物因生理生态特性有别,脂质
过氧化程度也不一样, 在同一亚硫酸浓度
下的 MDA 含量, 以银杏较高, 连翘次之,
小麦最低,但三者依亚硫酸浓度的变化规
律却基本相似.
图 1 NaHSO 3对植物 SOD、MDA 及电解质渗漏的影响
Fig. 1 Effect of NaHSO 3 on plants SOD, MDA and elec
t rolytic leakage.
∋ .小麦 T ri ti cum aesti v um , ( .连翘 Forsy thia suspen
sa, ) .银杏 Ginkgo biloba .下同 The same below .
312 磷酸缓冲液对脂质过氧化的防护作
202 应 用 生 态 学 报 9 卷
用 表 1中小麦苗, 以未喷磷酸缓冲液(简
称∗磷液+) + 0mmol∃L- 1NaHSO3 处理作
对照, 对于仅喷洒磷液者 SOD 活性增加
1208%, 相应的 MDA 含量与电解质渗漏
分别减少 338%和 3125% , 表明磷酸缓
冲液具有增加 SOD活性、稳定膜结构的功
能.仅用低浓度亚硫酸 ( 5mmol∃L - 1NaH
SO3)溶液处理者, SOD活性增加 167% ,
喷洒磷液后骤增至 1455% , 较之分别用
磷液与低浓度亚硫酸处理的单独效应之和
表 1 磷酸缓冲液对小麦苗 SOD、MDA和电解质渗漏的防护作用
Table 1 Protective function of phosphate buffer to SOD、MDA and electrolytic leakage of wheat seedlings
NaHSO 3 浓度
NaHSO 3
concentrat ion
( mmol∃L- 1)
SOD活性
SOD activity( U∃g- 1FW)
喷洒
Sprayed
未喷
Not sprayed
差值
Difference
MDA含量
Content of MDA(mmol∃g- 1FW)
喷洒
Sprayed
未喷
Not sprayed
差值
Dif ference
电解质渗漏
Electrolyt ic leakage(s∃cm- 1 & 103)
喷洒
Sprayed
未喷
Not sprayed
差值
Difference
0 186. 31 16623 12. 08 12. 50 15. 50 - 3. 00 1. 10 1. 60 - 0. 50
5 190. 41 169. 00 21. 41 14. 78 15. 84 - 1. 47 1. 24 1. 75 - 0. 51
10 181. 47 160. 27 21. 20 16. 83 19. 31 - 2. 48 1. 64 2. 50 - 0. 86
20 159. 05 143. 33 15. 72 17. 33 20. 04 - 2. 71 2. 25 2. 75 - 0. 50
50 124. 31 118. 15 6. 16 19. 88 22. 06 - 2. 18 2. 74 3. 10 - 0. 36
100 83. 64 80. 47 3. 17 24. 11 25. 42 - 1. 31 2. 98 3. 41 - 0. 43
高出 08%, 呈现协同促进作用.
由图 2看出,不同植物在同一亚硫酸
浓度下,喷洒磷液的 MDA 含量明显低于
未喷者,其中银杏降幅最大,连翘和小麦次
之.一般为未喷磷酸缓冲液植物的 MDA
含量越高,喷洒后防护效应也越显著.
图 2 磷酸缓冲液对不同植物脂质过氧化的防护作用
Fig. 2 Protective funct ion of phosphate buf fer to membrane
lipid peroxidat ion.
, 未喷磷液 Not sprayed, ! 喷洒磷液 Sprayed.
32 磷酸缓冲液对植物叶绿素结合度的
防护作用
321亚硫酸对叶绿素结合度的影响 由
表 2得知,供试植物的叶绿素及其组成的
结合度,在同一提取液下,依亚硫酸浓度增
加而减少; 在特定亚硫酸浓度下(同一环
境) ,又依提取液中极性溶液比例的增加而
减小,表明游离的、结合不稳定的、乃至牢
固性中等的叶绿素增多,可被逐步提取,使
结合稳定的叶绿素部分减少.在同一环境
下,不同植物的叶绿素结合度也有差异,结
合度大者抗性强,小者抗性弱,其抗性序列
为小麦> 连翘> 银杏, 为前述的伤害结论
提供了佐证.
322 磷酸缓冲液对叶绿素结合度的防护
作用 图 3表明, 未经亚硫酸处理的 3种
植物喷洒磷酸缓冲液后叶绿素结合度增高
476~ 600%,与其减轻膜质过氧化,稳定
膜结构,使游离叶绿素减少有关.在本研究
条件下,随亚硫酸处理浓度增加,游离或与
蛋白质结合不稳定的叶绿素增多,磷酸缓
冲液的防护幅度也随之增大; 在 50mmol∃
L
- 1处理浓度下, 小麦苗、连翘和银杏的叶
绿素结合度分别增加 943%、1354%和
2312% ,其增加率与前述树种抗性有关,
抗性强者增加率小,敏感者增加率大.
2032 期 韩 阳等:磷酸缓冲液对植物脂质过氧化的影响及其与亚硫酸伤害的关系
表 2 亚硫酸对叶绿素- 蛋白质结合度的影响*
Table 2 Effect of sulphurous acid on chlorophyll- protein binding degree
乙醇含量
Alcohol content
( % )
NaHSO 3 浓度
NaHSO 3
concent rat ion
( mmol∃L- 1)
叶绿素 a
Chlorophyll a
∋ ( )
叶绿素 b
Chlorophyll b
∋ ( )
总叶绿素
T otal chlorophyll
∋ ( )
0 0 96. 33 92. 00 84. 94 97. 44 95. 69 99. 25 96. 47 93. 86 90. 43
5 95. 45 90. 64 72. 11 96. 34 93. 81 98. 40 94. 77 91. 93 88. 39
10 84. 15 70. 11 92. 03 93. 86 87. 33 79. 84
50 89. 78 79. 30 63. 82 96. 03 87. 07 90. 16 91. 00 82. 08 73. 39
100 86. 71 90. 21 82. 00
0. 4 0 89. 77 89. 80 83. 38 94. 84 94. 31 99. 00 88. 20 92. 06 89. 38
5 86. 13 87. 64 75. 64 90. 34 91. 25 97. 25 83. 20 89. 12 83. 99
10 80. 99 63. 58 90. 35 91. 62 84. 11 74. 60
50 79. 17 75. 69 55. 43 86. 22 79. 24 83. 71 81. 72 77. 22 67. 85
100 70. 67 70. 33 73. 50
0. 8 0 75. 13 86. 91 77. 74
5 73. 05 80. 57 74. 10
10
50 67. 01 79. 16 66. 40
100 61. 11 64. 22 64. 00
* 叶绿素结合度( % ) = (未被浸提的叶绿素浓度/总叶绿素浓度) & 100% .
∋ .小麦 Tr it icum aest i v um , ( .连翘 Forsythia suspensa , ) .银杏 Ginkgo biloba.
图 3 磷酸缓冲液对叶绿素结合度的防护作用
Fig. 3 Protect ive funct ion of phosphate buf fer to chlorophyll
- protein binding degree.
4 讨 论
刘荣坤∀2, 3#首次报道了磷酸缓冲液对
小麦苗的 SO2 伤害具有防护作用, 其机理
与诱导保护酶系活性、增强酶谱带有关.已
知 SO2进入植物细胞主要是通过亚硫酸
启动自由基进行伤害, 本文直接按亚硫酸
模式处理证实, 喷洒磷酸缓冲液的植物,
SOD活性增强,以清除亚硫酸在体内氧化
过程中产生的活性氧,使脂质过氧化减轻,
为磷酸缓冲液对 SO2 伤害的防护作用提
供了直接佐证. 据 Hampp 和 Ziegler∀17#、
Mettler 和 Leonard∀18, 19#研究, 在质膜上存
在着转移亚硫酸离子或磷酸离子的载体,
由于亚硫酸离子和磷酸离子二者在结构上
相似,具有竞争性拮抗作用,因而在外施磷
液、增加磷酸离子浓度的情况下,可抑制亚
硫酸离子的吸收和转运. 这也可能是磷酸
缓冲液对植物亚硫酸伤害具有防护作用的
又一原因.
本文研究磷酸缓冲液不仅对小麦,对
木本植物的连翘和银杏也具有防护作用,
为磷酸缓冲液在其他农作物及绿化树木上
的广泛应用提供了初步实验依据.由于不
同植物的代谢类型不同, 磷酸缓冲液的最
佳处理浓度也有区别,有待深入研究.
大气 SO2 对叶绿素的伤害早已为研
究者所证实∀6, 15, 16#, 其机理被认为是 O∃2
使类囊体膜脂质过氧化,片层结构破坏,色
素从蛋白复合体中游离而被漂白化. O∃2 对
叶绿素的伤害具有特异性∀7#. 因此, 磷酸
缓冲液增强 SOD活性、清除 O∃2,减轻膜质
过氧化是提高叶绿素结合度的重要原因.
采用叶绿素结合度这一相对指标,可排除
204 应 用 生 态 学 报 9 卷
个体植物叶绿素含量差异的影响, 有利于
比较,更适于在环境监测或抗性植物选择
中应用.
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