全 文 ：粉刺侧孢霉产木质素过氧化物酶酶活
性与 pH 值的关系*
丁佐龙 高 慧 (安徽农业大学林产工业研究所, 合肥 230036)
摘要 研究了粉刺侧孢霉 ( Phaner ochaete chrysospor ium) 在以微晶纤维素为 C 源时, 木
素过氧化酶与 pH 值的关系. 试验采用 37~ 39!C 下液体振荡培养, 藜芦醇为产酶诱导剂,
测试不同起始 pH 值所得木素过氧化物酶活性. 结果表明, 起始 pH 值 6. 0 所得酶活最高
达 0. 126 U∀ml- 1, 说明以微晶纤维素代替葡萄糖为 C 源, 其最佳 pH 值相对较高. 菌丝球
直径与酶活呈正相关.
关键词 粉刺侧孢霉 微晶纤维素 木质素过氧化物酶 pH 值
Relationship between lignin peroxidase activity of Phanerochaete chrysosporium and pH value.
Ding Zuolong and Gao Hui( Anhui Agr icultural Univer sity , H ef ei 230036) . Chin. J . A pp l.
Ecol . , 1997, 8( 5) : 527~ 530.
Phaner ochatet chr ysosp orium was liquidcultur ed with avicel as carbon source and with veratric
alcohol as enzymeinducing agent. Determinations of its lignin perox idase activity at different
initial pH values showed that the highest enzyme activity was obtained at pH 6. 0, indicating
that the optimum pH value was relatively higher w hen avicel w as used to subst itute g lucose as a
carbon source. The enzyme activity had a positiv e r elationship with the diameter of hyphal pel
let.
Key words Phanerochaete chry sospor ium , Avicel, L ignin perox idase, pH value.
本实验系于 1995 年作者在英国格林威治大学 P.
Harvey 研究小组学习期间完成.
* 中英友好奖学金资助项目.
1997年 7月 21日收稿, 8月 28日接受.
1 引 言
粉刺侧孢霉( Phanerochaete chrysosp o
r ium )及其所产木素过氧化物酶在处理偶
氮染料[ 1] 及其它工业废液中氯酚化合
物[ 3] ,在环保领域具有潜在应用前景. 然
而,由于对这种酶产生特性了解尚不全面,
阻碍着工业用途的实现, 因为至今的产酶
研究仅限于使用葡萄糖这类单糖作为 C
源,且均于营养控制下进行,没有更全面地
反映粉刺侧孢霉这类白腐菌产木素过氧化
物酶的微生物生态. 以天然底物纤维素代
替葡萄糖充当 C 源将会涉及纤维素酶如
CMC酶等的作用,而且能有利于揭示无营
养控制下木素过氧化物酶产生机理的数
据. 因此, 本研究从探索微晶纤维素为 C
源时,培养基起始 pH 值与酶活性的关系
方面着手,研究粉刺侧孢霉产木素过氧化
物酶的生态条件.
2 材料与方法
2. 1 菌种及接种孢子的制备
本试验采用木质素过氧化酶产酶研究专用
的粉刺侧孢霉菌种 Phaner ochaete chr ysosp orium
PC26 PRL , 购自英联邦真菌博物馆.原菌株移接
到麦芽汁琼脂培养上, 于 30 # 下培养 2 周后即得
生长良好的孢子. 取得接种孢子方法: 注入少量
蒸溜水(经灭菌)于培养瓶中并振荡得孢子悬浮
液, 4 层纱布过滤, 得孢子悬浮液. 培养基接种时,
按液体培养基提供孢子 1 ∃ 107 个∀ml- 1的要求,
应 用 生 态 学 报 1997 年 10 月 第 8 卷 第 5 期
CH INESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Oct. 1997, 8( 5)%527~ 530
确定注入孢子悬浮液的量.
2. 2 培养基成份
2. 2. 1 培养基成份 (每升培养基含) 酒石酸铵
1. 876 g、酒石酸钠 2. 30 g、酒石酸 1. 50 g、磷酸二
氢钾 2. 0 g、氯化钙 0. 108 g、MgSO4∀7H2O 0. 50
g、FeSO4∀7H2O 0. 018 g、维生素B1 0. 001 g ;基本
盐溶液 (或称微量元素溶液) 10 ml; 微晶纤维素
( avicel) 4 g.
2. 2. 2 基本盐溶液组成 (每升含) MgSO4∀7H2O
3. 0 g、MnSO4∀H2O 0. 50 g、NaCl 1. 00 g、FeSO4∀
7H2O 0. 10 g、CoSO 4 0. 10 g、ZnSO4 0. 10 g、CuSO4
∀5H2O 0. 1 g、AlK( SO4 ) 2 0. 01 g、H3BO 3 0. 01 g、
NaMoO4 0. 01 g及亚氮基三乙酸盐 1. 50 g .
2. 3 其它生态条件
2. 3. 1 培养基不同起始 pH 值的配制 于 18 只 1
L 三角烧瓶中, 分别注入 300 ml培养基, 每 3 个
烧瓶中的培养基使用 1 种 pH 值, 用 HCI 溶液及
NaOH 溶液调配 pH 值为 4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0
和 6. 5的培养基.
2. 3. 2 诱导剂的加入 在培养基灭菌前, 按每
300 ml培养基加入 0. 3 ml 0. 5 mo l藜芦醇添加诱
导剂.
2. 3. 3 培养条件 培养基灭菌接种后, 即刻置于
125 rpm 振荡培养,设定温度 37~ 39!C.
2. 3. 4 酶活等测试样品提取 自接种后第二天
(培养的第一天)开始起, 每天抽取 5 ml培养液,
先测酶活, 然后冷冻保存其余样品作集中测其葡
萄糖含量、NH+4 浓度及 pH 值用.
2. 4 分析方法
2. 4. 1 木质素过氧化酶酶活测定 根据 Kirk 木
素过氧化物酶活性测定方法[ 5] , 针对底物藜芦醇
氧化最佳 pH 值[ 4] ,将原方法中 pH 值调至 2. 75.
先配制 pH 2. 75 的 H3PO4K 2HPO4 缓冲溶
液,再按 95% 缓冲溶液+ 5% 20 m mol藜芦醇溶
液的比例( V / V )配制混合溶液备用.
1 ml比色皿中加入上述混合溶液及待测样
品共 1 ml, 其中样品(培养液或称粗酶液)量一般
取 200~ 5l(视酶活高低确定) . 以 20l 20 m mol
H2O 2溶液启动反应.于 310 nm 波长,测定吸光度
变化, 依据变化曲线计算样品酶活. 一个酶活单
位为每分钟氧化得到 1 mol藜芦醛所需酶量.
2. 4. 2 葡萄糖含量测定 以 D- 葡萄糖为标准
样, 用 DNS 法测定 .
2. 4. 3 菌丝球数量及直径测定 取 1 ml培养基
(先摇匀菌丝球) , 置于显微镜下测定菌丝球数目
及直径.
3 结果与分析
3. 1 木质素过氧化酶酶活
起始 pH 在 4. 5~ 6. 0的培养, 均于第
三天开始能测定到酶活, 但 pH 值 4. 0及
6. 0的在第四天才开始能测定到酶活, 相
对推迟了一天. 所有起始 pH 值的培养都
在第六天达到最高酶活, 但起始 pH 值为
6. 0 的培养液酶活最高; pH 5. 5 的稍次
之,也达 0. 122 U∀ml- 1(见表 1) .
表 1 不同起始 pH值培养基所获酶活( U∀ml- 1)
Table 1 Lip activity under di fferent initial pH values of
medium
培养时间
Culturat ion
t im e( d)
pH
4. 0 4. 5 5. 0 5. 5 6. 0 6. 5
1 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
4 0 0. 033 0. 033 0. 011 0. 011 0
6 0. 025 0. 021 0. 064 0. 122 0. 126 0. 106
7 0 0. 028 0. 046 0. 061 0. 043 0. 076
8 0. 009 0. 041 0. 031 0. 057 0. 038 0. 073
10 0 0. 069 0. 035 0. 046 0. 043 0. 035
本试验中,第六天酶活达最高,但很快
就开始降低.这一现象在以葡萄糖等 C源
产酶研究中,多次被证明是一普遍现象.这
里发现,以微晶纤维素为 C 源的木质素过
氧化物酶生产,同样不能避免这一现象.
酶活与 pH 值及时间的关系的数学模
型为:
Y = 14. 975P- 3. 39 9∀ e- 2. 713∃10- 3 ∀ p 2( t- 6) 2 ( 1)
式中, Y 为酶活, t 为天数, p 为 pH 值. F
= 3. 3701, F 0. 05( 2, 51) = 3. 19< 3. 37.
所得回归方程表明差异显著.因此,微
晶纤维素作 C 源, 液体振荡培养粉刺侧孢
霉,培养基起始 pH 值对产木质素过氧化
物酶影响较显著, 且以 pH 值 6. 0的产酶
528 应 用 生 态 学 报 8 卷
效果最佳, 这与过去研究的(以葡萄糖为 C
源) 最佳产酶 pH 值为略高于 4. 5 的结
论[ 2]有较大区别.
3. 2 菌丝球的形成
本试验中, 最低及最高起始 pH 值菌
丝球的形成明显迟缓,从表 1中各起始 pH
值的菌丝球直径、数目与酶活高低的联系
比较来看, 菌丝球大而少时( pH= 6时)酶
活较高.
菌丝球直径与 pH 值及时间的回归方
程为:
Y = 1. 649 + 1. 006 lnpt ( 2)
式中, P 为 pH 值, t为天数, Y 为菌丝球.
对方程( 2)进行显著性检验:
t= 5. 7134
取 a= 0. 05, t a/ 2( n- 2) = t 0. 025( 28) =
2. 0484< 5. 7134
所得回归方程差异显著.
表 2 不同起始 pH值培养条件下菌丝球数量及直径
Table 2 Numbers and diameters of pellets under different initial pH values
pH
第二天 Day 2
数 量
Number
( ind.∀ml- 1)
平均直径
Average
diameter
( mm)
第三天 Day 3
数 量
Number
( ind.∀ml- 1)
平均直径
Average
diameter
(mm)
第四天 Day 4
数 量
Number
( ind.∀ml- 1)
平均直径
Average
diameter
( mm)
第七天 Day 7
数 量
Number
( ind.∀ml- 1)
平均直径
Average
diameter
( mm)
第九天 Day 9
数 量
Number
( ind. ∀ml- 1)
平均直径
Average
diameter
( mm)
4. 0 0 0 0 20 1. 5 & 0. 1 13 1. 3 & 0. 2
4. 5 10 1. 0 & 0. 1 29 1. 2 & 0. 2 28 1. 7 & 0. 2 22 2. 0 & 0. 2 19 2. 0 & 0. 2
5. 0 16 1. 3 & 0. 1 16 1. 6 & 0. 2 25 1. 7 & 0. 2 19 1. 85 & 0. 1 20 1. 9 & 0. 3
5. 5 17 1. 1 & 0. 1 17 1. 5 & 0. 1 29 1. 7 & 0. 3 19 1. 8 & 0. 1 20 2. 3 & 0. 3
6. 0 19 0. 9 & 0. 1 11 2. 2 & 0. 2 17 2. 0 & 0. 3 13 2. 3 & 0. 2 16 2. 4 & 0. 2
6. 5 0 0 17 2. 0 & 0. 2 13 2. 7 & 0. 3 19 2. 4 & 0. 2
因此, 粉刺侧孢霉以微晶纤维素为 C
源培养, pH 值对菌丝球大小有直接影响,
对照表 1中酶活及表 2 中菌丝球直径大
小,显示菌丝球大小与酶活值呈正相关.
3. 3 NH+4 浓度的变化
自接种后, NH+4 的浓度即持续下降,
各不同起始 pH 值培养基中的 NH+4 的浓
度都以相似趋势下降,直至第三天才停止.
接着从第三天到第九天之前, NH+4 浓度又
缓慢回升到 15~ 18m mol,即从第三天起,
NH+4 的浓度开始回升.这种 NH +4 浓度变
化趋势与菌丝生长及产酶相符合, 在接种
前三天菌丝快速生长消耗大量 NH+4 ,自开
始出现酶活后, NH+4 浓度又逐渐回升, 其
原因还不清楚. NH+4 浓度变化见图 1.
第三天各 NH +4 浓度相对于各自起始
浓度均明显下降, 而以 pH 值 6. 0 的下降
最明显,表明此 NH+4 浓度下降越明显, 第
六天酶活越高.
3. 4 pH 值变化趋势
培养基 pH 值在产酶培养的整个过程
中,有比较相似的变化趋势(不同起始 pH
值之间) .
从接种之日到产酶开始日(第三天) ,
培养基 pH 值都相对于起始 pH 值有一定
程度的下降, 自第三天或第四天起有一定
程度的回升.到第九天,起始 pH 值为 5. 0、
5. 5、6. 0和 6. 5的变化到 pH 值 5. 0~ 6. 0
图 1 不同起始 pH 值的培养基中 NH +4 浓度的变化
Fig. 3 Change of culture NH+4 concent rat ion under diff erent
init ial pH values.
1. pH4, 2. pH4. 5, 3. pH4, 4. pH5. 5, 5. pH6, 6. pH6. 5.
5295 期 丁佐龙等:粉刺侧孢霉产木质素过氧化物酶酶活性与 pH 值的关系
之间(图 2) . 对于起始 pH 值 4. 0及 4. 5的
培养基整个过程中 pH 值变化很小, 而变
化最大的是起始 pH 值 6. 0, 次之为 pH 值
5. 5,分别下降 0. 18及 0. 57.可见 NH+4 浓
度下降越明显, pH 下降也越多, 菌丝形成
越理想,所得酶活则越高.
图 2 培养基 pH 值变化
Fig. 2 pH of culture with diff erent init ial pH values.
培养基 pH 值变化趋势, NH +4 浓度变
化及产酶过程,从真菌生理学角度看是相
互吻合的.自接种至出现酶活前这期间,是
菌丝快速生长及菌丝球形成阶段. 菌丝快
速生长,快速消耗NH+4 (充当 N2源) ,使之
在培养基中浓度明显下降.同时由于 NH +4
浓度下降打破液体培养基的酸碱平衡, 酸
性增强, pH 值下降. 出现酶活后, pH 值开
始一定程度的回升, 这可能是由于开始产
酶后, 菌丝开始分泌少量碱性物质, 导致
pH 值提高.
总之, 粉刺侧孢霉以微晶纤维素为 C
源,产木素过氧化物酶, 起始 pH 值是关键
的生态条件之一,在本试验的 pH 值 4. 0~
6. 5 范围内, pH 值 6. 0 培养的 NH +4 浓度
及 pH 值下降最多, 菌丝生长及菌丝球形
成最为理想,所获酶活最高,可见是菌丝分
泌木素过氧化物酶培养基最佳起始酸度.
致谢 承李增智教授审阅并提出修改意见.
参考文献
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~ 2284.
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