全 文 ：杭 州 师 院 学 报 ( 自 然 科 学 版 )
1 98 3年 第 一 期
蚕 砂 中氨 基酸 的 薄层 层 析
王永祥 陆未平 孙 波
我国幅员辽阔 , 可养蚕的地区很多 , 每年有大量蚕砂 (即蚕粪 )没有被充分利用 , 一些利
用蚕砂作原料的叶绿素厂其废蚕砂的处理也是一个问题 。 为了能更好地综合利用蚕砂 , 要对
它先作成分分析 , 这方面的工作已有报导 , 结论是含粗蛋白质 1 4%左右 。 我们的工作就是用
薄层层析法对它的氨基酸组分进行分析 , 以便为综合利用提供线索 。
原 理
微晶纤维素薄层层析就是在一平滑的玻璃板上均匀地涂一层厚约 o . 2 5m m 的微晶纤维素
作为吸附剂 , 然后在薄板上进行层析 。 其中吸附在纤维素上的水是固定相 , 层析所用的溶剂
就是流动相 。 由于被分离的氨基酸在固定相和流动相中的分配系数不同 , 故在流动相中移动
速度也不 同 , 就 一可以将各氨基酸加以分离 , 分离后的每个氨基酸其 R ;值各有不 同 。 为了使分
离效果更好 , 往往采用双向层析法 , 即在薄板上直的层析一次后再横的层析一次 , 二次所用
的展开剂不同 , 则 R f值差别更大 。 然后用显色剂使斑点显色 , 且与标准氨基酸比较 , 即可得
出结论 。
二 、 仪 器
1
. 层析缸 ( 圆形 ) : 直径 18 c m
2
. 玻璃板 : 1 2c m X 1 2c m
3
. 微量注射器
魂. 喷雾器 (医用喉头喷雾器 )
5
. 电吹风
6
. 培养皿
7
. 克氏微量定氮仪
8
.
p l l金卜D D S一〕
9
。 离子交换树脂 (7 井型 )及离子交换柱 (直径加 m , 一长2处 11) 。
1 0
. 水解衍乙。
·
2 0
.
三 、 试 剂 配 制
1
. 粘 结 荆 :
0
.
3%聚乙烯醇溶液 - -一称取 3 克聚乙烯醇于 I 0 0 0ml 重蒸水中 , 加热溶解 , 若有少量不溶物 , 待溶液冷却后滤去 [ “ j[ ` 〕。
2
. 展 开 剂 :
层析溶剂 工 : 叔丁醇 : 甲乙酮 : 氨 : 水 二 5 : 3 , 1 , 1
层析溶剂 五 : 异丙醇 : 甲酸 (0 . 8 8) ,水 = 2 0 , 1 , 5
注意: 层析溶剂需新鲜配制 , 不能久放 。 否则由于溶剂的挥发及醋化反应的发生等因素 ,
会影响分离效果 。
3
. 显 色 剂 :
( 1) 0
.
5%茹三酮丙酮溶液 : 称取 2 。 5 克荀三酮 , 溶于 50 0 1无水丙酮中 ,存放于棕色试
剂瓶中 。
( 2) 1% 引噪醒溶液 : 称取 1 克叫噪醒溶于 10 ml 无水 乙醇及 10 ln 冰乙酸中 , 呵噪醒显
色会产生黄底色 , 经过试验我们采用了以下方法褪色 。
褪色剂 〔“ , : 在 30 0 m l 3 0 “ 一 50 “ 的温水中 , 按次序加入 1 克对甲基氨基苯酚 , 待完全溶解
后加入 1 克四硼酸钠 , 加水定容到 50 0耐 , 贮于棕色瓶中 , 并保持在阴凉处 。
临用前将以上褪色剂原液与 0 . 5% C O jC Z水溶液以功 : 1 ( V / V )混合 。
4
.
l m g /m l 标准橄基酸混合液 :
分别称取各种氨基酸 l o m g 混合后用 10 m l 功 % 异丙醇溶解 , 若有个另lJ氨基酸不溶 , 则可
加几滴 6N H CI 使溶解。
四 , 、 样品的制备
( 1) 实验前先用克氏定氮法测定蚕砂中的蛋 白质含量 (约为 1选%左右 ) , 然后按 “ 蛋 白质 :
6 N H CI 二 1 : 3 ” ( V /V )的比例将蚕砂及 6 N H CI 置于水解管中 , 抽真空封 口 , 置于 1 10 “ 烘箱中水
解 2选小时 , 然后将水解液置于小烧杯中 , 水浴蒸去H CI , 再用 10 ;百异丙醇溶解 , 过滤取清液 。
经我们多次实验发现 , 蚕砂中含有大量的无机盐 , 这些金属离子的存在会直接影响分离
效果 。 为此 , 我们采用 7 32 型阳离子交换树脂对样品进行脱盐 、 纯化 〔` 了。
( 2) 为了避免无机盐的干扰 , 还可采用先提取蚕砂中的蛋白质 , 然后根据 “ 蛋白质 : 6 N H CI
二 :1 3 ” ( V /V )的比例将蛋 白质与 H CI 置于封管中水解的方法 。 蛋 白质提取方法如下 :
将干燥的蚕砂用 O . 4 N N a O H在 5 0℃水浴上萃取 7 一 8 小时 , 过滤 , 滤液用 O . 4 N H CI 调
至 p H 3 . 4 (经实验测定蚕砂的等电点为 3 . 4) , 即有沉淀析出 。 然后用无离子水洗涤至无 lC 一 。
将沉淀用C o CI : 真空干燥二天 。 即得蛋白质固体 。
五 、 薄 板 制 备
称取经 3 0 目筛孔过筛的微晶纤维素粉 1. 5克 , 加入 7 . 5 m l 0 . 3% 聚乙烯醇溶液 , 充分调
匀后铺入 12 x 1 c2 m 2 的玻板上 。 若在匀浆过程中有气泡产生可加数滴酒精消除 。 铺好的薄板
放于水平板上过夜晾干 。 若空气湿度大 , 可把薄板放入 80 ℃烘箱中烘 10 分钟 , 取出在大气中
平衡一段时间 , 即可使用 〔 2了。
六 、 操 作 方 法
1
. 点 样 :
用微量注射器分别吸取标准氨基酸混合液及蚕砂水解液各 8一 10 ul , 分别点加在距薄板左
下角各 cI m处 , 边点边用电吹风吹干 , 使点的直径不大于 2一 3m m 。
2
. 展 开
我们采用双向上行法在密闭的圆形标准缸中进行展开 。 展开开始前缸内空气不需被溶剂
蒸气所饱和 , 但为了防止边缘现象 , 可在容器的壁上挂几张浸满展开剂的滤纸 , 将薄板浸入
层析溶剂 工: 〔叔丁醇 : 甲乙酮 : 氨 : 水 = 5 , 3 , 1 : 1〕。 注意薄板浸入溶剂高度不得超 过 底 边 的
o
.
cs m
, 溶剂沿着薄板向上移动 , 一直到溶剂前缘到达薄板顶端为止 。 取出薄板 、 吹 干 。 接
着以同法进行第二向层析 〔异丙醇 : 甲酸 : 水 = 20 : 1 : 5〕。
3
. 显 色 :
氨基酸层析显色目前较多使用的是苟三酮显色法 。 方法是用喷雾器在薄板上均匀地喷射
。 . 5%荀三酮溶液 , 热风吹千 , 氨基酸斑点呈兰紫色 , 仅脯氨酸斑点为黄色 。
另外 , 还可采用吼噪醒显色法汇5 〕。 方法同上 , 显色后不同的氨基酸会显示不同颜色的斑
点 。 但同时会产生黄色底色 。 为此 , 我们用了褪色剂喷射在黄底色上 , 底色立即褪为无色 。
七 、 结 果
1
. 我们先比较了单一氨基酸和标准氨基酸混合液层析图谱上各斑点的颜色和 R : 值 , 将
标准氨基酸混合液中各氨基酸位置加 以一一确定 。
2
. 我们采用对照蚕砂的层析图谱与标准氨基酸混合液层析图谱的方法 , 确证在蚕砂中主
要含有以下十二种氨基酸 。
压苯丙氨酸 亮氨酸 苏氨酸 脯氨酸
蛋氨酸 丝氨酸 甘氨酸 天 门冬氨酸
精氨酸 丙氨酸 赖氨酸 谷氨酸
3
. 本实验采用蛋 白质酸性水解法 , 故色氨酸已被破坏 。 为此 , 我们又采用了碱性 水 解
法 , 用 N a 0 H 和明胶在封闭玻管中对样品水解 2 小时 , 然后用对二甲基氨基苯甲醛 试 剂 检
验 〔` 了。 发现未变兰色 , 证明蚕砂及废蚕砂中不含色氨酸 。
4
. 本实验中我们还对提取叶绿素后的废蚕砂进行了分析 。 分析 的结果与蚕砂相一致 , 只
丫
即协小
沙
。 . 一。象
O
。
图一 十七种标准氛基酸混合液 色层 图谱
1
. 日一苯丙氨酸 2. 亮氨酸 3. 色氨酸 4. 苏氨酸
5
. 领氨酸 6. 蛋氨酸 7. 酪氨酸 8. 脯氨酸
9
. 丙氨酸 10 . 丝氨酸 1 1. 甘氨酸 12 . 经脯氨酸
1 3
. 精氨酸 1 4. 组氨酸 15 . 天冬氨酸 16 . 赖氨酸
1了 谷氨酸
图二 蚕砂 中氛基酸 色层图谱
1
. 日一苯 丙氨酸 2. 亮氨酸 3. 苏氨酸
4
. 蛋氨酸 5. 脯氨酸 6. 丙氨酸
了. 甘氨酸 8. 丝氨酸 9. 精氨酸
10
, 天冬氨酸 1 1 . 赖氨酸 12 . 谷氮放
是含量相对比蚕砂 中少些 , 故尔斑点较淡 。
八 、 讨 论
1
. 关于样品的制备问题 , 我们试验发现 , 如果直接将样品水解 、 点样 、 展开 , 则会造成
斑点严重的连续拖尾现象。 为此 , 我们分别采用了 “ 样品水解 十 树脂脱盐 ” 和 “ 提取蛋 白质 后
再水解 ”这二个方法 。 我们发现用树脂脱盐方法操作较为简单 , 但分离效果不如后者好 , 而蛋
白质水解虽然需要时间较长 (约需四夭 ) , 但可得到比较圆而集中的斑点 , 效果 良好 。
2
. 在实验中我们还发现 : 制板的好坏是层析结果成败的一个重要因素 。 若微晶纤 维 素
粉粗细不等 , 会使制成的薄板松而粗糙 , 造成斑点扩散 。 故一定要用经 3 0 目过筛的粉末。 另
外 , 薄板的含水量过低 , 溶剂展开过快等均会造成斑点拖尾现象 , 故要严格控制 。
3
. 我们比较了二种氨基酸显色法 , 发现各有利弊 。 苟三酮显色灵敏度高 , 斑点清晰 , 但
同时杂质的干扰也较灵敏 , 尤其在空气中有游离氨存在时会使薄板底色泛红 ; 另外较难从斑
点的颜色来区分氨基酸的种类 ; 再有 , 荀三酮放置一段时间后常会带微红色 。 叫噪醒显色的
优点是不同氨基酸斑点显色不 同 , 可以简便确定氨基酸的种类 。 另外 , 杂质及空气中游离氨
对它的影响较小 , 其缺点是显色的灵敏度太低 。
参 考 文 献
〔 1〕 潘家秀等编著 : 蛋 自质化学研究技术 科学出版社 19 6 2
〔 2〕 游树鹏编 : 植物组织培养与植物激素实验指导 杭大生物系 1 9 8 2
〔 3〕 植物生理学通讯 滩 1 P 3 5一 3 8 ( 1 9 7 9 )
〔 4」 生物化学和生物物理进展 掩 6 P 7 3一 7 5 ( 1 9了g )
仁5〕 E . v T r u t e r , T h i牡 F i l m Ch r o m a t o gr a p h y ( 2 0 63 )