全 文 ：丹麦森林土壤反硝化作用的动力学分析 3
于克伟　陈冠雄　(中国科学院沈阳应用生态研究所 , 沈阳 110015)
Sten Struwe 　Annelise Kj«ller 　(哥本哈根大学基础微生物系 , D K21307 丹麦)
【摘要】　本项研究将乙炔和氯霉素抑制技术结合起来 ,对丹麦一森林土壤的反硝化作用
进行了研究 ,并考察温度对其还原酶活性的影响. 反硝化还原酶活性和合成过程受 O2 的
抑制 ,厌氧培养时 ,需要一定时间消耗系统中残余的 O2 来解除这种抑制作用. 在无抗生素
抑制蛋白质合成时 ,硝酸还原酶只有少量合成 ,而 N2O 还原酶却显著地诱导产生. 这一结
果对土壤吸收 N2O 能力的研究具有重要意义. 在各处理下 ,系统中未发生亚硝酸盐的明
显积累 ,表明亚硝酸还原酶活性大于硝酸还原酶. 外加葡萄糖加速了反硝化作用 ,并能促
进酶的合成和消除还原过程中的电子竞争. 供试土壤表现出很强的厌氧呼吸作用 ,并受外
加 C 源的促进. 反硝化作用的活化能低于土壤厌氧呼吸的活化能 ,因此反硝化作用的 Q10
值较低 ,CO2 和 N2O 的产生比例随温度升高而加大.
关键词 　反硝化作用 　N2O 还原 　动力学 　活化能
Dynamics of denitrif ication potential in a Danish forest soil. Yu Kewei , Chen Guanxiong
( Institute of A pplied Ecology , Academia S inica , S henyang 110015) ,Sten Struwe and An2
nelise Kj«ller ( U niversity of Copenhagen , D K21307 Denm ark ) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,
1998 ,9 (2) :163～167.
The denitrification potential of a Danish forest soil is studied by the combination of acetylene
and chloramphenicol inhibition techniques , and the effect of temperature on its related reduction
enzyme activities is investigated. The activities and synthesis of reduction enzymes are inhibited
by oxygen. It takes some time to consume the O2 left in an anaerobic incubation to release this
inhibition. When protein synthesis is not inhibited by antibiotic , nitrate reductase is synthesized
slightly , while N2O reductase is significantly induced , which is of significance to study the N2O
absorbing capacity of soil. Nitrite is not considerably accumulated in all treatments , indicating
that the activity of nitrite reductase is higher than nitrate reductase. Denitrification is stimulat2
ed by adding glucose , while the synthesis of enzymes and the releasing of electron competitions
in the reduction processes are probably promoted as well. There shows a strong anaerobic respi2
ration in the sampled soil , which is stimulated by C source addition. The activation energy for
denitrification is lower than that for anaerobic respiration , therefore , the Q10 value for denitrifi2
cation is lower , and the ratio between CO2 and N2O evolution is higher with temperature.
Key words 　Denitrification , N2O reduction , Dynamics , Activation energy.
　　3 中国2丹麦科技合作 DANIDA (1995～1996) 资助
项目.
　　1997 - 08 - 14 收稿 ,1997 - 10 - 23 接受.
1 　引 　　言
　　反硝化作用是土壤 N 循环的重要过
程 ,其中间产物 N2O 可间接 (通过形成 NO
和 NO2) 破坏同温层臭氧层[2 ] ,促进酸雨
形成 (通过形成 HNO3) [8 ]和直接参与减少
地表红外辐射损失[11 ] ,加剧全球温室效
应 ,因此其研究受到世界各国的广泛重视.
反硝化作用还是已知唯一清除 N2O 的生
物学机制 ,其研究对土壤吸收大气 N2O 能
力的评估具有重要意义. 目前广泛采用
Tiedje 等建立的淤浆方法 ,将乙炔和氯霉
应 用 生 态 学 报 　1998 年 4 月 　第 9 卷 　第 2 期 　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Apr. 1998 ,9 (2)∶163～167
素抑制技术结合起来[10 ] ,考察反硝化还原
酶活性. 乙炔 (10 %)能有效地抑制 N2O 还
原酶的活性. 氯霉素可抑制微生物合成新
酶 ,但不影响已存在酶的活性 ,这样可保持
培养期间系统中初始酶的数量与活性.
　　反硝化还原酶的活性和合成过程受
O2 的抑制 ,目前研究一方面多集中于测定
厌氧培养时反硝化还原酶活性的表达 ,而
对其酶合成状况知之甚少 ;另一方面多集
中测定硝酸还原酶活性 ,考察 N2O 产生速
率 ,缺乏对 N2O 还原酶活性的研究. 本项
研究着重考察外加 C 源和不同温度对反
硝化还原酶活性的影响 ,以及抗生素不存
在情况下反硝化还原酶的合成状况 ,同时
讨论了土壤的厌氧呼吸作用. 其结果有助
于认识反硝化作用的机理和其调控因子的
作用.
2 　材料与方法
2. 1 　采样地点与样品处理
　　供试土壤采自云杉山毛榉混交林 (丹麦
Sor«,1996 年 4 月) . 除去土壤表面枯枝落叶层 ,
采集 0～20cm 上层土壤. 在实验室内室温下风干
24h ,过 2mm 筛后储存在 5 ℃的冰箱内. 处理后土
壤硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐含量依次为 16. 41、
0. 01和 3. 85μgN·g - 1土 ,在水和 0. 1mol KCl 溶液
(1∶2)中 p H 分别为 5. 93 和 5. 30 ,土壤含水量为
10. 4 %.
2. 2 　土壤淤浆制备与实验设计
　　称取 10g 处理后土壤样品于 120ml 培养瓶
中 ,加入 20ml 蒸馏水摇匀制成土壤淤浆. 土壤反
硝化作用强度通过测定乙炔抑制下系统中 N2O
的产生速率确定 ,与无乙炔抑制时 N2O 产生速率
比较 ,分析 N2O 还原酶活性. 实验处理包括 :对照
( Ⅰ,CK) 、外加氯霉素 ( Ⅱ,CHL) 或葡萄糖 ( Ⅲ,
GLU) ,分别在有无 C2 H2 情况下培养. 为使各种
处理下瓶内气相体积相同便于计算 ,对照瓶中加
20ml 蒸馏水 ,氯霉素或葡萄糖处理瓶中加 19ml
蒸馏水 ,再加 1ml 葡萄糖或氯霉素溶液. 葡萄糖
和氯霉素的最终浓度分别为 740 和 110μg·g - 1
土. 处理后的瓶上加盖橡皮塞 ,抽真空 5min ,再充
入纯 N2 使淤浆体系为厌氧状态. 之后 ,C2 H2 处理
瓶中注入 10ml 纯 C2 H2 . 所有处理均设 4 个重复 ,
将其分成 2 组 (每组 2 个重复) ,分别在 12 ℃和
25 ℃下培养以考察温度对反硝化作用的影响. 考
虑到温度对生化反应速率的影响 ,在高温时培养
时间较短. 培养期间每次用注射器抽取 4. 5ml 瓶
内气体样品注入 3ml 真空瓶 (venoject ,比利时产)
中 ,用于分析 N2O 和 CO2 浓度.
2. 3 　分析和计算方法
　　采用惠普 5890 气相色谱仪分析 ,并用标气
标定气样中 N2O 和 CO2 浓度. 色谱仪运行条件
为 : ECD 检测器、分离柱和进样口温度分别为
325 ℃、40 ℃和 120 ℃,分离柱长 1. 5m ,填充 80～
100 目 Hayesape ,载气流速为 20ml N2·min - 1 . 土
壤无机氮经 0. 1mol KCl 抽提后 ,用 Aquatec (瑞典
产)流动注射定氮系统分析 ,p H 值用 Radiometer
p H计 (丹麦产) 测量. 实验结果的计算和统计分
析均在 Microsoft Excel 5. 0 软件下进行. 文中土
重以干重计.
3 　结果与讨论
3 . 1 　反硝化作用的动态变化
　　反硝化还原酶在土壤中普遍存在 ,但
在有氧条件下其酶活性和合成过程受到抑
制. 厌氧培养时需要一定时间解除这种抑
制[7 ] ,因此各处理下反硝化过程初期都表
现出一定程度的“延迟”,这一时期用于消
耗系统中残余的 O2 ,温度升高可缩短延迟
时间. 当 N2O 还原酶活性受 C2 H2 抑制时 ,
反硝化过程的终产物是 N2O. 在对照和加
抗生素处理中 , C2 H2 抑制条件下 N2O 累
积在培养前期呈零级反应动力学 ,后期呈
一级反应动力学 (图 1) ,表明硝酸还原酶
的 Km 值 (米氏方程 V = V max [ S ]/ ( Km
+ [ S ])中)大大低于样品中硝酸盐背景浓
度. 培养前期 ,反应速率几乎不受底物浓度
的影响 ;培养后期 ,由于底物浓度的下降 ,
反应速率因此而改变. 厌氧条件下 ,反硝化
还原酶合成过程的抑制状态得到解除 ,但
461 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　9 卷
图 1 　乙炔抑制下 N2O 的累积 ( ±标准偏差)
Fig. 1 N2O accumulation with C2H2 inhibition (Standard de2
viation) .
可用抗生素抑制新酶的合成. 然而结果表
明 ,对照和抗生素处理中的 N2O 累积曲线
没有显著差异 ,表明硝酸还原酶在培养期
间没有明显的合成. 外加葡萄糖时 , N2O
累积曲线则明显不同 ,反硝化速率大大加
快 ,这是由于电子供体的增加对反硝化作
用促进的结果 ,也可能还包括葡萄糖促进
酶合成的原因. 培养期间没有检测到亚硝
酸盐的大量累积 ,表明亚硝酸还原酶活性
大于硝酸还原酶.
　　无 C2 H2 存在时 ,N2O 还原酶活性得
到表达 ,此时系统中 N2O 累积是 N2O 产
生与还原过程的动态结果. 当酶的合成受
抗生素抑制时 ,N2O 累积近似线性 ,表明
N2O 还原酶活性恒定不变 ;对照和加葡萄
糖处理中 ,N2O 累积到一定浓度时则达到
平衡 ,甚至开始下降 (图 2) ,表明若无抗生
素抑制 ,培养期间 N2O 还原酶将显著合
成. 外加 C 源可缩短达到平衡所需时间 ,
并表现出较强的 N2O 还原趋势. 虽然森林
土壤中 C 源充分 ,不是反硝化作用的限制
因子 ,但反硝化过程中的电子竞争依然存
在. 外加 C 源有助于缓解电子竞争 ,利于
N2O 的还原 ,在硝酸盐和亚硝酸盐浓度较
低时更为明显.
图 2 　无乙炔抑制下 N2O 的累积 ( ±标准偏差)
Fig. 2 N2O accumulation without C2H2 inhibition (Standard
deviation) .
　　土壤不仅是 N2O 的一个释放源 ,还可
能是吸收 N2O 的汇[1 ,3 ,5 ] . 反硝化作用是
目前已知唯一清除 N2O 的生物机制 ,其吸
收能力取决于 N2O 还原酶的数量与活性 ,
但至今对土壤吸收 N2O 的能力的评估依
然存在很大程度的不确定性[6 ] . 上述结果
对土壤吸收 N2O 能力的研究具有重要意
义. 虽然森林土壤原始 N2O 还原酶活性较
低 ,但持续厌氧条件有助于 N2O 还原酶的
合成 ,外加电子供体可提高 N2O 还原酶的
活性.
　　厌氧条件下 ,土壤中依次进行的是金
属离子 ( Mn4 + 、Fe3 + ) 、氮氧化物等的还原
过程[9 ] ,这些厌氧呼吸过程以有机碳为电
5612 期 　　　　　　　　　于克伟等 :丹麦森林土壤反硝化作用的动力学分析 　　　　
子供体 ,并将其氧化成 CO2 . 本实验所有处
理中 CO2 累积在培养期间均呈零级反应
动力学 (图未列出) ,表明供试森林土壤有
机物充分 ,并且在厌氧培养条件下 ,土壤微
生物种群数量变化不大.
3 . 2 　N2O 和 CO2 产生速率及比例
　　温度显著影响反硝化和厌氧呼吸速
率 ,因此 25 ℃培养下反应速率远远大于
12 ℃培养下的结果. 同一温度下 ,对照和加
抗生素处理中 , C2 H2 抑制条件下的 N2O
和 CO2 产生速率没有显著差异 ,表明硝酸
还原酶活性几乎不变 ,这与培养期间 N2O
累积行为一致 (图 1) . 由于 N2O 还原酶的
合成发生在反硝化过程的“延迟”期之后 ,
无 C2 H2 抑制 N2O 还原酶活性时 ,N2O 和
CO2 产生速率也相近. 外加 C 源 ( GL U) 明
显加速了反硝化和厌氧呼吸过程. 有研究
表明 ,外加氯霉素可促进 N2O 和 CO2 的产
生 ,因为当蛋白质合成受抑制时 , C 源转
移用于反硝化作用和呼吸过程[4 ] . 由于本
实验所用森林土壤 C 源充分 ,因此未显示
出这种影响 ;选用氯霉素浓度较低 ,减少了
氯霉素可能存在的副作用. 同时 ,实验中未
观察到 C2 H2 对厌氧呼吸过程的显著影响
(表 1) .
　　培养过程中CO2和N2 O产生速率差
表 1 　不同处理下 N2O 和 CO2 的产生速率 3
Table 1 N2O and CO2 production rates in different treatments
无 Without C2H2
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
有 With C2H2
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
N2O 产生速率 12 ℃ 0. 03 0. 02 0. 08 0. 05 0. 04 0. 09
N2O production rates 25 ℃ 0. 15 0. 12 0. 19 0. 18 0. 17 0. 32
(μg N g - 1 soil h - 1)
CO2 产生速率 12 ℃ 0. 38 0. 36 0. 77 0. 37 0. 35 0. 68
CO2 production rates 25 ℃ 1. 60 1. 50 2. 89 1. 47 1. 49 3. 03
(μg C g - 1 soil h - 1)3 N2O 和 CO2 产生速率由培养第一天结果线性回归计算而得.
N2O and CO2 production rates are calculated based on the linear regressions of the first day’s incubations. Ⅰ. 对照 CK , Ⅱ. 氯
霉素 CHL , Ⅲ. 葡萄糖 GLU. 下同 The same below.
异较大 (以产物 C/ N 比表示) ,虽然培养温
度提高有效地加速了这两种过程 ,但 CO2
和 N2O 产生速率之比在温度较高时较高
(表 2) ,表明厌氧呼吸过程比反硝化作用
对温度更敏感 . 外加厌氧呼吸和反硝化作
表 2 　不同处理下 C/ N产生比例 3
Table 2 Evolution ratio of C/ N in different treatments
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
12 ℃ 7. 55 8. 21 8. 00
25 ℃ 8. 17 9. 93 9. 473 由表 1 无 C2H2 时 CO2 产生速率和 C2H2 抑制下 N2O
产生速率之比计算而得.
Calculated according to table 1 by the ratio between CO2
productions in the treatments without C2H2 and N2O pro2
ductions with C2H2 inhibition.
用底物 ,如葡萄糖和硝酸盐 ,可显著改变其
反应速率 ,但并不能改变二者对温度的相
对敏感性. 两种气体产生比例在有抗生素
抑制处理中最大 ,若没有抗生素抑制酶的
合成和微生物数量的增加 ,反硝化作用强
度的增加要高于厌氧呼吸作用的加强 ,使
CO2 和 N2O 产生比例变小 ,这一现象在温
度较高时较为明显.
3 . 3 　反硝化作用和厌氧呼吸的活化能和
Q10值
　　大多数化学和生物反应速率受温度的
影响都可由 Arrhenius 方程计算 :
　　　K = Ae
- E
R T
式中 , K 为反应速率 , A 为系数 , R 为气体
常数 (8. 31J mol - 1·K - 1 ) , T 为绝对温度
( K) , E 为反应活化能 ( kJ mol - 1) . 反硝化
作用活化能由 C2 H2 抑制下两种温度培养
中 N2O 产生速率计算确定 ,厌氧呼吸作用
的活化能则采用无 C2 H2 抑制下 CO2 的产
生速率 ,以避免 C2 H2 对呼吸作用的可能
661 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　9 卷
影响. 温度每增加 10 ℃反应速率增加的倍
数即所谓 Q10值 ,按下式计算 :
Q10 =
K ( t + 10)
Kt
= Ae
- E
R ( T + 10)　　/ Ae
- E
R T　= e
10 E
R T ( T + 10)
结果表明反硝化作用活化能[12 ]低于厌氧
呼吸的活化能 ,因此反硝化作用的 Q10值
也较低 (表3) ,这与不同温度培养下CO2
表 3 　反硝化作用和厌氧呼吸的表观活化能和 Q10值
Table 3 Apparent activation energies for denitrif ication
and anaerobic respiration and the Q10 values
活化能 Activation energy
( KJ mol - 1)
De Ar
Q10值 3
Q10 Value
De Ar
Ⅰ 70. 68 78. 67 2. 75 3. 08
Ⅱ 67. 87 78. 28 2. 64 3. 06
Ⅲ 72. 01 71. 92 2. 80 2. 803 按温度由 12 ℃升高到 22 ℃计算. Calculated based on
temperarure increased from 12 ℃to 22 ℃.
De.反硝化作用 Denitrification , Ar. 厌氧呼吸 Anaerobic
respiration.
和 N2O 产生比例的结果一致 (表 2) . 抗生
素加入与否没有明显改变反硝化作用和厌
氧呼吸的活化能 ,表明不同温度下 CO2 和
N2O 产生速率的差异主要是由于温度对
反应速率的影响 ,而不是由于微生物种群
和酶数量的变化. 葡萄糖作为反硝化作用
的电子供体和厌氧呼吸的底物 ,对反硝化
作用和厌氧呼吸活化能的测定都产生了一
定的影响 ,葡萄糖也可能促进系统中酶的
合成和增加微生物数量.
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