全 文 ：大叶藤黄叶片角质层的酶分离技术＊
王博轶　冯玉龙＊＊
(中国科学院西双版纳热带植物园昆明分部 , 昆明 650223)
摘　要　角质层运输特征的研究在生态学 、环境和农用化学等方面都具有非常重要的意义 , 完
好地分离角质层是进行这方面研究的前提。本文以生长在西双版纳热带雨林中的大叶藤黄为
材料 ,探讨了角质层的酶分离技术。结果表明 , 30 ℃时用 2%(w/v), pH 3.0的果胶酶和纤维素
酶溶液浸泡大叶藤黄叶圆片 9 h ,叶圆片边缘角质层分离 , 浸泡 5 d 可分离到完整的角质层 , 角
质层在硼酸盐缓冲液(0.01 mo l·L-1 , pH 9.0)中充分浸泡数日去除石炭酸 , 空气中干燥 , 室温下
于聚乙烯的盒子保存备用。
关键词　角质层 , 酶分离 ,大叶藤黄 , 西双版纳
中图分类号　Q945　　　文献标识码　A　　　文章编号　1000-4890(2004)03-0141-03
Enzymatic isolation of leaf cuticles of Garcinia xanthochymus.WANG Boy i , FENG Yulong(K un-
ming Dev ision , X ishuangbanna Tropical Botanical Garden , Chinese Academy of Sciences , Kunming
650223 , China).Chinese Journal of Ecology , 2004 , 23(3):141 ～ 143.
Investiga tion of cuticular transport physiology is of great importance for ecological , environmental and
agrochemical research.I solation of intact cuticles is a crucial prerequisite for these studies.Relative
studies have no t been seen in our country.The method of enzymatic isolation of cuticles w as described
in this paper.
Key words　plant cuticle , enzymatic isolation , Garcinia xanthochymus , Xishangbanna.
＊中国科学院“百人计划”资助项目。
＊＊通讯作者
收稿日期:2003-03-19　　改回日期:2003-05-06
1　引　言
角质层是植物叶表面由角质和蜡质组成的膜状
结构 ,并由果胶质连结 ,覆盖在表皮细胞外表面的细
胞壁上 ,对植物起着机械防护和失水保护的作用 。
角质层运输特征的研究在生态学 、环境和农用化学
等方面都具有非常重要的意义 。对生长在大气环境
中的植物来讲 ,角质层是一个防止非可控的水分丢
失的屏障[ 4] 。在水分胁迫条件下 ,气孔将会关闭 ,
角质层蒸腾的速度决定了植物丢失到大气中的水分
的量 。角质层的透性可以影响植物对雾露水 、农药 、
微肥等的吸收。喷雾到叶片表面的农用化学品必须
要穿过角质层才能到达它的作用位点[ 1] 。在生态
毒物学方面 ,为了估算沉积在叶片表面的环境中有
毒的化学物最终的吸入量 ,测量角质层的通透性是
很有必要的[ 9] 。而要研究角质层的这些特征 ,完好
地分离角质层是重要的前提。为探讨全球环境变化
导致的雾露水减少对该区生态系统结构 、功能等的
影响 ,作者研究西双版纳地区热带植物对雾露水吸
收能力的差异 ,分离了大量植物的角质层 ,本文介绍
角质层的酶分离方法 ,快速 、灵敏且操作简单 。
2　材料与方法
以生长在西双版纳沟谷林中的大叶藤黄
(Garcinia xanthochymus)为材料。试验时取相近环
境中相近年龄的成熟叶片 ,用打孔器打孔得到直径
15 mm 的叶圆片 ,随机分组 ,每组 20片 。进行如下
处理:(1)不同酶浓度处理:以 0.01 mol·L-1柠檬酸
盐缓冲溶液(pH 3.0)配成 0.5%、1%、2%、3%、
5%、8%(w/v)的果胶酶与纤维素酶溶液 , 30℃下浸
泡叶圆片;(2)不同 pH 值处理:分别以 0.01 mol·
L -1 、PH 为 3.0 、3.5 、4.0 、4.5 、5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、
7.0的柠檬酸盐缓冲溶液配成 2%(w/v)的果胶酶
与纤维素酶溶液 , 30 ℃下浸泡叶圆片;(3)不同温度
处理:以 0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲溶液(pH 3.0)
配成 2%(w/v)的果胶酶与纤维素酶溶液 ,分别于
15 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃下浸泡叶圆片。每一处理3
个重复 ,各参数均以平均值加减 1个标准误差表示 ,
用 t 检验不同处理之间的差异 , P <0.05 ,差异显
著 。本文以用解剖镊子能剥离开叶圆片边缘角质层
生态学杂志 Chinese Journal of Ecology　2004 , 23(3):141～ 143　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　
DOI :10.13292/j.1000-4890.2004.0099
(而不是角质层完全分离脱落)为标准判断角质层分
离与否。
3　结果与分析
在酶浓度为 2%(w/v)、pH 3.0 、温度为 30 ℃的
条件下 ,叶圆片刚刚浸泡时浮于溶液表面 ,溶液慢慢
由叶圆片四周向中间渗透 ,可观察到四周颜色变深 ,
中间较浅 。随着溶液的渗透 ,叶圆片逐渐下沉变软 ,
浸没于溶液当中 。约 9小时后 , 20个叶圆片边缘角
质层几乎全部分离 。继续浸泡约 5天后 ,整个叶圆
片颜色完全变深 ,角质层基本完全分离 。这时 ,可用
镊子夹住角质层边缘 ,轻轻撕下 ,有些则可自动脱
落。分离后用去离子水洗以除去粘附的细胞碎片 。
增加酶浓度可以减少分离角质层所需的时间
(图 1)。酶浓度小于 2%时 ,随浓度的增加 ,角质层
分离所需时间减少较快;而当酶浓度大于 2%时 ,对
角质层分离所需时间的影响则不很明显 。2%的酶
浓度较合适 ,此浓度下大约 9小时后角质层可分离 。
图 1　酶浓度(w/ v)对分离大叶藤黄叶片上表皮角质层所需时间影
响
Fig.1　Effect of enzyme concentration(w/ v)on the time required to
isolate the upper epidermis cuticle of Garcinia xanthochymus leaves
注:数据点为平均值±标准误(n=3),下同。
不同大写字母表示不同浓度处理间性差显著异(P<0.05)
　　叶圆片浸泡 3 h 时还无角质层分离 ,随浸泡时
间的延长 ,角质层分离的叶圆片增多 ,9 h后 pH 3.0
的酶液中的 20个叶圆片角质层几乎全部分离(图
2)。酶液的 pH 对角质层的分离速度有显著的影
响 ,浸泡相同时间后 , pH 值越低角质层分离的叶圆
片数量越多 ,9 h 后 pH 3.0 、3.5 、4.0 、4.5 、5.0 、5.5 、
6.0的酶液中角质层分离的叶圆片数分别为
19.6667±0.3333;16.6667±0.3333;15±0.5774;
12.6667±0.3333;11 ±0.5774;6.3333 ±0.3333;
0.3333±0.3333(图 2)。延长浸泡时间 , pH 6.5的
酶液中大叶藤黄叶片角质层也能分离 , 这与
Schönherr[ 8]的结果不同 ,pH 6.0条件下榕树叶片角
质层已不能分离 。pH 7.0时 ,即使浸泡时间再长大
叶藤黄叶片角质层也不会分离。
图 2　pH对分离大叶藤黄叶片上表皮角质层所需时间的影响
Fig.2　Effect of pH on the time required to isolate the upper epidermis
cuticle of Garcinia xanthochymus leaves
　　角质层分离的速度随温度的升高而显著增加 ,
温度较低时(15 ℃～ 20 ℃)增加较快 ,温度较高时
(20 ℃～ 40 ℃)增加速度变缓(图 3)。
图 3　温度对分离大叶藤黄叶片上表皮角质层所需时间的影响
Fig.3　Effect of temperature(℃)on the time required to isolate the
upper epidermis cuticle of Garcinia xanthochymus
注:不同大写字母表示不同温度处理间差异显著(P<0.05)
4　讨　论
角质层酶分离过程中 ,一些酸性化合物如石炭
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酸 、脂肪酸 ,会从细胞中释放出来 ,并被角质层吸收 ,
被吸收的石炭酸会影响角质层透性[ 8] 。这些物质
的释放量随浸泡时间的延长而增多 ,故在角质层酶
分离过程中应尽量缩短叶圆片的浸泡时间 ,以减少
这些物质对角质层透性的影响。本研究表明 ,增加
酶的浓度(图 1),降低酶溶液的 pH 值(图 2)和升高
温度(图 3), 均可加快角质层分离速度 , 这与
Schönherr[ 8]的结果是较一致的 。2%(w/v)的果胶
酶和纤维素酶浓度 ,pH 3.0 , 30 ℃条件下可以较好
地分离大叶藤黄成熟叶片的角质层 ,在此条件下也
能较好地分离黄花胡椒 、红雾水葛成熟叶片的角质
层(结果未列出)。角质层分离所需时间与植物种类
和叶片年龄紧密相关 ,黄花胡椒 、红雾水葛叶片角质
层分离明显比大叶藤黄快 ,1%酶浓度下榕树叶片角
质层分离速度明显比大叶藤黄快[ 8] 。增加酶浓度
可以减少角质层分离所需时间 ,但酶浓度大于某一
值时 ,酶浓度的效应不显著(图 1),可依据实际情况
选择适宜的酶浓度 。研究表明 , 40 ℃到 50 ℃之间
角质层会发生相变 ,引起水分通透性的不可逆转的
增加[ 6 , 7] ,故分离角质层时温度不能高于 40 ℃。降
低酶溶液的 pH可以加快角质层分离速度(图 2),但
分离角质层时 pH 不能低于 3.0 ,因 pH 低于 3.0时
角质层中的一些物质不稳定[ 3] 。在 pH 3.0的条件
下角质层分离快 ,细胞内释放出的石炭酸等不能电
离 ,角质层对它们的吸收较少[ 8] ,分离到的角质层
结构 、透性及表面的石蜡层均未受到分离过程的影
响。为去除石炭酸等对角质层透性的影响 ,分离下
来的角质层需在硼酸盐缓冲液(0.01 mol·L-1 , pH
9.0)中充分浸泡数日 ,期间定期更换硼酸溶液 。取
出角质层于空气中干燥 ,并于室温下存放于聚乙烯
盒中 ,3个月后可以用于角质层透性测定(新分离的
角质层的透性比其实际透性高[ 2])。室温下将角质
层放于氯仿/甲醇(1:1)中 10分钟 ,可去除其表面的
蜡质[ 5] 。
在叶圆片的酶液浸泡过程中 ,溶液很容易长霉。
15 ℃时 ,长霉较慢 ,当温度高于 20 ℃时 ,浸泡 1至 2
天 ,肉眼即可观察到霉菌 。为抑制霉菌的生长可在
酶溶液中加入叠氮化钠等 ,条件允许时也可采用其
它无菌操做技术。
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作者简介　王博轶 , 女 , 1978 年出生 , 在读硕士研究生。 主
要从事植物生理生态学研究。发表论文 2篇。
责任编辑　魏丽萍
143王博铁等:大叶藤黄叶片角质层的酶分离技术