全 文 ：泰山照山白提取物对过氧化损伤的
PC12 细胞的保护作用*
李福荣1 胡月华2 张 伟1 韩俊芬1 游桂荣1 邢郦健1
(1．泰山医学院药物化学教研室，山东 泰安 271016;2．泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)
摘要:目的 研究泰山照山白提取物(ＲME)对氧化损伤的神经细胞株(PC12)炎症反应的影响及与凋亡的关
系，探讨药物抗炎以及抗凋亡效应的可能机制。方法 体外培养 PC12，ＲME 三个浓度预处理，加入 H2O2 诱导氧
化损伤，MTT 比色法检测细胞存活率，ELISA 测定培养液中白介素 － 1β(IL － 1β)和肿瘤坏死因子 － α(TNF － α)
含量、免疫荧光显微镜检测细胞凋亡率及凋亡的细胞形态变化。结果 与正常对照组相比，经 H2O2 损伤后，细胞存
活率降低 (P ＜ 0． 05、P ＜ 0． 01)、而 IL － 1β和 TNF － α 的释放量增加(P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 01)、凋亡细胞数目增多并呈
现典型的凋亡形态学改变。而 ＲME 各剂量组预处理能提高细胞存活率(P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 01)、降低细胞上清液 IL
－ 1β和 TNF － α 含量(P ＜ 0． 05、P ＜ 0． 01)、降低细胞凋亡率、改善细胞的凋亡形态。结论 ＲME可抑制 H2O2 诱导
的神经细胞株氧化应激性炎性损伤和凋亡，提高细胞存活率，其作用机制可能是通过抑制凋亡转导途径而实现的。
关键词:泰山照山白提取物;氧化应激;神经细胞;凋亡
中图分类号:Ｒ392． 1 文献标识码:A 文章编号:1004-7115(2003)03-0170-03
doi:10． 3969 / j． issn． 1004-7115． 2013． 03． 004
Ｒhododendrom micranthum Turcz． inhibits injury in H2O2 damaged nerve cell lines PC12
LI Fu － rong1 HU Yue － hua2 ZHANG Wei1 HAN Jun － fen1 YOU Gui － rong1 XING Li － jian1
(1． Dept． of Pharmaceutical Chemistry，Taishan Medical College，Taian 271016，China;
2． Taian Center Hospital，Taian 271000，China)
Abstract:Objective:To investigate the effect of extract of Ｒhododendrom micranthum Turcz．(ＲME)against inflamma-
tion reaction of oxidative damage in nerve cell lines PC12 induced by hydrogen peroxide (H2O2)and the possible mecha-
nism． Aim Cultured in vitro，PC12 cells was pretreatment with three concentration of ＲME before injured induced by
H2O2，MTT assay was used to detect cell viability，ELISA to detect content of IL － 1β and TNF － α in culture solution，
immunofluorescence microscopy was used to determine the expression of caspase － 3． Ｒesults Compared with injured group，
ＲME of three concentrations all separately increased the cell viability and reduced the contents of IL － 1β and TNF － α and
the apoptotic percentage of PC12 cells． (P ＜ 0． 05 and P ＜ 0． 01 respectively)，The typical apoptosis morphology was
changed． Conclusion ＲME inhibit the H2O2 － induced apoptosis in nerve cell lines PC12． The mechanism may via Inhibi-
tion of apoptosis transduction pathways
Key words:Ｒhododendrom micranthum Turcz;hydrogen peroxide;oxidative stress;apoptosis
泰 山 照 山 白 为 杜 鹃 花 科 植 物 照 山 白
(Ｒhododendrom micranthum Turcz)的枝叶。其中含
有各种黄酮类成分如金丝桃苷及多种皂苷、鞣质、油
脂和挥发油等，传统用于祛痰止咳及活血通络等，
有研究显示其浸膏不仅具有平喘、解痉等作用［1 － 2］，
还对舒张动脉平滑肌、降低实验性高血压发挥一定
的作用。但是泰山照山白总黄酮对于氧化损伤的神
经细胞的作用尚未见报道。
071
泰 山 医 学 院 学 报
JOUＲNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 34 No. 3 2013
* 基金项目:泰安市科技局科技发展计划项目( 项目编号: 20103003) 。
作者简介:李福荣( 1970—) ，女，山东泰安人，副教授，硕士，主要研究方向: 中药有效成分提取及初步活性。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
1． 1． 1 材料 神经细胞株 PC12 购于中科院生化
细胞所。兔抗人 caspase － 3 多克隆抗体、TNFα、IL
－ 1β酶联免疫试剂盒购于南京凯基生物科技发展
有限公司。二甲基亚砜(DMSO)为北京化工厂产
品;ＲPMI － 1640 培养基、胎牛血清购自 GIBCO 公
司;MTT购自 Sigma 公司;胰蛋白酶 － EDTA 消化液
购自北京 Solarbio科技有限公司。
1． 1． 2 照山白提取物(ＲME)的制备 取夏末采收
泰山照山白药材 250 g，加入 8 倍量 75%乙醇浸泡
过夜，加热回流提取，真空抽滤，滤渣重复上述操
作合并滤液，50 ℃减压旋转蒸干，洗脱所含木毒素，
浓缩蒸干即得 ＲME浸膏 58 g 。用 80%乙醇定容至
10mL，微孔滤膜过滤除菌，存于 4 ℃冰箱。
1． 1． 3 细胞培养及干预 将 PC12 细胞株置于
37℃，5%CO2 孵箱培养，以 10% FBS的 ＲPMI － 1640
培养液调整适当的细胞密度，接种于 25 ml 的细胞
培养瓶。细胞生长至融合率达 70% ～ 80%时，无血
清培养 12 h使细胞同步化于 G0 期，加 ＲME进行预
处理 24 h。分组如下:正常对照组:仅加入 DMEM
培养基;损伤组:H2O2(150 μmol·L
－1) ;ＲME 低、
中、高剂量预处理组: (10、20、50 μg·L －1) ，预处
理后加入 H2O2 作用 12 h。
1． 2 方法
1． 2． 1 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，
制成 1 × 105 /ml 的细胞悬液，接种于 96 孔培养板，
每孔加细胞悬液 100 μl 培养过夜，PBS 洗涤，按照
上述分组处理继续培养 24 h 后，加入 MTT 溶液(
5mg /ml)10 μl 培养 4 h，弃去各孔内液体，加入
100 μl二甲基亚砜，振荡器振荡 5 min，室温放置 10
min，全自动酶标仪上测定各孔 A490 nm 值，取 3 孔
平均值计算细胞抑制率:抑制率% =(1 －实验组 A
值 /对照组 A值) × 100%。
1． 2． 2 ELISA 法检测上清 TNFα、IL － 1β 含量 细
胞分组以及处理同上，收集各分组细胞培养上清液，
ELISA 法检测 TNFα、IL － 1β的产生量，操作按试剂
盒说明进行，酶标仪 450 nm 处测定 A 值。
1． 2． 3 免疫荧光组织化学法检测 caspase － 3 的表
达 调整 PC12 细胞密度为 1 × 106 /ml ，制作细胞爬
片，培养于 6 孔板内，待细胞贴壁过夜后加入无血
清 ＲPMI － 1640 培养液 12 h，使细胞同步化。加入
三个浓度的 ＲME 预处理 12 h 后，加入 H2O2(150
μmol·L －1)损伤 12 h，加入 caspase － 3 一抗孵育，
4 ℃过夜，PBS洗涤 3 次，加入二抗孵育 2h，PBS冲
洗，磷酸甘油缓冲液封片，免疫荧光显微镜观察。
1． 2． 4 统计学处理
采用 SPSSV13． 0 统计软件，标本平行重复检测 3 次
取均值，计量资料用 珋x ± s 表示，多组资料之间比较
用方差分析。
2 结 果
2． 1 ＲME对损伤 PC12 细胞存活率的影响 与空白
对照组相比，H2O2 模型组的细胞存活率明显降低(
63． 72%，P ＜ 0． 01) ;经 ＲME预处理后，细胞存活率
升高为 73． 71% 、82． 76% 和 89． 27%，与 H2O2 损
伤组比较，差异显著(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)。见图
1。
图 1 MTT检测 ＲME对细胞活性的影响
注:* P ＜ 0． 01vs对照组，#P ＜ 0． 05vs损伤组，##P ＜ 0． 01vs损伤组
A:正常对照组;B:损伤组;C:10 μg·L －1 ＲME;D:20 μg·L －1
ＲME;E:50 μg·L －1ＲME
2． 2 ＲME 对培养液上清 TNFα、IL － 1β 含量的影
响 TNFα、IL － 1β 等炎性细胞因子是引起慢性炎症
和严重损伤的重要因素。实验结果表明，与空白对
照组比较，H2O2 模型组 IL － 1β 水平增加 51． 34%
(P ＜ 0． 01) ，TNFα 含量增加 37． 49%(P ＜ 0． 01) ;而
与 H2O2 模型组比较，ＲME 预处理组的 TNFα 分别
降低 31． 15%、25． 52% 和 20． 52%(P ＜ 0． 05，P ＜ 0．
01) ;IL － 1β 含量分别下降为 37． 01%、21． 77%和
20． 56% (P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)。见图 2、图 3。
图 2 ＲME对培养液上清 TNFα含量的影响
注:* P ＜ 0． 01vs对照组，##P ＜ 0． 05vs损伤组
A:正常对照组;B:损伤组;C:10μg·L －1 ＲME;D:20 μg·L －1
ＲME;E:50 μg·L －1ＲME
171
泰 山 医 学 院 学 报
JOUＲNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 34 No. 3 2013
图 3 ＲME对培养液上清 IL － 1β含量的影响
注:* P ＜ 0． 01vs对照组，##P ＜ 0． 05vs损伤组
A:正常对照组;B:损伤组;C:10μg·L －1 ＲME;D:20μg·L －1
ＲME;E:50 μg·L －1ＲME
2． 3 ＲME预处理对 PC12 凋亡的影响 与空白对照
组比较，H2O2 损伤 12 h后，PC12 细胞 caspase － 3 的
表达明显增加，而 ＲME 三个剂量组均可明显降低
PC12 细胞 caspase － 3 的表达，且呈剂量依赖性效
应。见图 4。
图 4 ＲME干预对 PC12 细胞 caspase － 3 表达的影响
A:正常对照组;B:损伤组;C:10μg·L －1 ＲME;D:20μg·L －1
ＲME;E:50μg·L －1ＲME
3 讨 论
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)发病
原因十分复杂，现普遍认为是一种以神经纤维缠结、
β －淀粉样蛋白斑形成、神经元丢失为主要病理特
征的进行性退化性神经系统变性疾病，发病机制尚
未明了，但目前研究认为脑内的慢性炎症反应继而
诱发神经细胞的凋亡可能是其重要发病机制之一，
而氧化应激诱发的自由基损伤是导致神经元凋亡的
根本原因，因此抗氧化是保护神经元的有效途
径［3 － 4］。H2O2 是诱导氧化应激反应的活性氧之一，
其在体内代谢过程中产生的 OH －是氧化性最强的
氧自由基，可自由进入细胞，在许多神经元细胞培养
模型中可引起细胞损伤，因此本研究以 H2O2 作为
损伤因素处理细胞，制备氧化应激损伤模型，研究中
药照山白的抗氧化作用。
据《本草纲目》记载，照山白具有活血、通络、祛
风、散寒等功效，改善全身的血液循环，固标治本，扶
正驱邪。已有研究显示，服用 20%照山白酊，经临
床观察 200 例，降压总有效率为 74%。有研究显
示，照山白酊剂中主要药效成分金丝桃苷，具有抗
炎、解痉、利尿、止咳、降压、降低胆固醇、蛋白同化、
局部和中枢镇疼以及对心、脑血管的保护作用等多
种生理活性，是一种重要的天然产物。能有效抑制
缺氧缺糖 －再灌注损伤后脑片甲躜(formazan)含量
下降，增加缺血区脑片皮层和纹状体的存活神经元
数目，使神经元细胞形态完整，分布良好。抑制
SOD、LDH及谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性的
下降。其作用机制可能与自由基清除，抑制 Ca2 +内
流及抗脂质过氧化物形成等有关［5 － 6］。
本研究中经 H2O2 损伤后 PC12 细胞的存活率
下降;介导炎性损伤的重要的白介素家族成员
TNFα、IL － 1β 的合成与表达增加;caspase － 3 的表
达也明显增高。提示 TNFα、IL － 1β 在早期的氧化
损伤刺激时释放量增多，是参与氧化损伤、凋亡的重
要细胞因子。而照山白总黄酮预处理后，则显示可
明显抑制炎性细胞因子 TNFα、IL － 1β 的合成与表
达;抑制凋亡相关蛋白 caspase － 3 表达，且此效应呈
剂量依赖性。
本研究结果提示，抑制炎症反应的发生、保护细
胞免于炎性损伤以至于凋亡可能是照山白总黄酮发
挥抗氧化和抑制神经细胞株 PC12 凋亡的作用机
制。
参考文献:
［1］ 宋立仁，洪恂，丁绪亮，等． 现代中药学大辞典［M］． 北京:
人民卫生出版社，2001: 40 － 80．
［2］ Ducrey B，MarstonA，Gohring S，et al． Inhibition of 5 alphare-
ductase and aromatase by the ellagitannins oenothein A and oeno-
thein B from Epilobiumspecies［M］． Planta Med，1997，63( 2) :
111 － 114．
［3］ Cagnin A． Positron emission tomography imaging of neuro inflam-
mation［J］． Neurotherapeutics，2007，4: 443-452．
［4］ Quinn J． Inflammation and cerebral amyloidosis are disconnected
in an animal model of Alzheimer＇s disease［J］． J Neuroimmunol，
2003，137: 32-41．
［5］ 杨秀岭，袁志芳，张兰桐，等． 照山白总黄酮药理作用研究
［J］． 中草药，2006，37( 4) : 583 － 585．
［6］ 夏重道，杜安全，王红萍，等照山白有效成分的化学研究［J］．
中国药科大学学报，1999，13( 4) : 99．
(收稿日期 2012 － 11 － 28)
271
泰 山 医 学 院 学 报
JOUＲNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 34 No. 3 2013