全 文 ：38　 林业科技开发　2009年第 23卷第 3期
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(责任编辑　吴祝华)
闽楠 、红楠 AFLP反应体系建立
田晓俊 1 ,温强1 ,汪信东 2 ,杨青2 ,江香梅 1＊
(1.江西省林业科学院 , 南昌 330032;2.江西农业大学林学院)
摘　要:以闽楠 、红楠总基因组 DNA为模板 ,对 AFLP分析各环节的条件进行了优化和筛选 , 建立了适合于闽楠 、
红楠 AFLP分析的最佳反应体系。其中:酶切反应条件为在 20 μL反应体系中 , 加入模板 DNA 150ng, Bufer2
2μL, BSA0.2 μL, EcoRI3U, MseI2U, 37℃酶切 4 h, 65℃变性 10 min, 4℃保存;连接反应条件为将酶切产物中加入
5μL连接体系(包括 T4Bufer2.5 μL, EcoRI接头 5pmol, MseI接头50 pmol, T4连接酶 1U), 16℃连接过夜。预扩增
反应条件为在 20 μL体系中 ,加入稀释 25倍的连接产物5 μL, Mg2+(25 mM/L)1.6μL, dNTP(2 mM/L)2 μL, 预扩
增引物 E00、M00各30ng, Taq酶 1U。选择性扩增反应条件为:在 20 μL体系中 , 加入稀释 100倍的预扩增产物 5 μL,
Mg2+1.2 μL, dNTP2 μL,选择性扩增引物(E+3/ M+3)60 ng, Taq酶 1U。本实验结果为闽楠 、红楠 AFLP分析打
下了良好的实验基础。
关键词:闽楠;红楠;AFLP;反应体系;优化
EstablishmentandOptimizationofAFLPReactionforPhoebebourneiandMachilusthunbergi∥TIAN
Xiao-jun, WENQiang, WANGXin-dong, YANGQing, JIANGXiang-mei
Abstract:TheAFLPreactionsystembasedonthegenomeDNAofPhoebebourneiandMachilusthunbergiiwasestablished
andoptimized.Theoptimizationofrestrictionsystem(20 μL)includedDNA150ng, Buffer2 2μL, BSA0.2μL, EcoRI
3U, MseI2U, incubatedat37℃ for4h.Added5 μLligationsystemwithT4Bufer2.5μL, EcoRIadapter5pmol, MseI
adapter50pmol, T4 ligase1U, reactedat16℃ overnight.Thepre-amplificationsystem(20 μL)included5 μLdiluted
ligationproductsby25 time, Mg2+(25 Mm/L)1.6μL, dNTP(2 mM/L)2 μL, EcoRIprimer(E00)andMseIprimer
(M00)30ng, TaqE1U.Andtheselectiveamplificationsystem(20 μL)included5 μLdilutedligationproductsby100
time, Mg2+ 1.2 μL, dNTP2 μL, EcoRIselectiveprimerandMseIselectiveprimer(E+3/ M+3)30 ng, TaqE1U.The
resultestablishedastrongfoundationfortheAFLPanalysisinP.bourneiandM.thunbergi.
Keywords:Phoebebournei;Machilusthunbergi;AFLP;ReactionOptimization
Firstauthor saddress:ForestryAcademyofJiangxiProcince, 330032Nanchang, China
收稿日期:2008-12-16　　　　修回日期:2009-02-20
基金项目:国家自然科学基金项目 “闽楠 、红楠保护生物学研究 ” (编
号:30560126)。
第一作者简介:田晓俊(1982-),女 ,实习研究员 ,主要研究方向为林
木遗传育种。通讯作者:江香梅 , 女 ,研究员。 E-mail:xiangmeijiang@
yahoo.com.cn。
　　闽楠(Phoebebournei(Hemsl.))和红楠(Machilus
thunbergiSieb.etZucc.(Yang))分别为樟科楠属和
润楠属的常绿乔木树种。它们是集材用 、经济 、生态 、
绿化 、美化等功能于一身的优良珍稀阔叶树种 。其
中 ,闽楠是我国国家 Ⅱ级保护树种和特有珍稀用材树
种[ 1] ,而红楠由于人为干扰如种子采摘 、林下幼苗移
植等致使其生境破坏严重 ,天然资源锐减 ,逐渐沦为
渐危树种 [ 2] 。因此 ,抢救和保护闽楠和红楠基因资
源已成为亟待解决的问题。科学地了解我国现有闽
应用研究　
　林业科技开发　2009年第 23卷第 3期 39　
楠 、红楠资源遗传多样性和遗传结构 ,可以为两树种
种质资源的合理保护和育种策略的制订提供一定的
理论依据 。
扩增片断长度多态性(AmplifiedFragmentLength
Polymorphism, AFLP)结合了 RFLP和 PCR的优点 ,
具有高效 、快速 、稳定 、可靠等特点 [ 3] ,已广泛应用
于植物种质鉴定 [ 4] 、遗传图谱构建 [ 5] 、目的基因定
位 [ 6] 、遗传多样性分析 [ 7] 、作物起源 [ 8]等方面 。本
研究旨在通过建立闽楠 、红楠的 AFLP分子检测反
应体系 ,为其群体遗传结构和遗传多样性分析奠定
实验基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
实验用植物材料取自江西省林业科学院闽楠 、红
楠种质基因库 ,采集两树种新鲜幼叶。
实验用 EcoRI、MseI接头及引物均由上海生工合
成 , EcoRI、MseI内切酶 、T4连接酶购自 NEB公司 ,
Taq酶 、dNTP、100bpDNAmarker购自上海生工公司 ,
其他试剂均为国产分析纯。
实验用仪器主要有 Beckman公司的台式高速冷
冻离心机 , ABI公司的 2700 PCR扩增仪 , BIO-RAD
公司的凝胶成像系统 ,北京六一仪器厂的 DYY-12
电泳仪 、电泳槽 ,上海光谱的紫外分光光度计等。
1.2　实验方法
闽楠总基因组 DNA提取采用改良的 CTAB
法[ 9] ,红楠总基因组 DNA参照 SDS法[ 10]提取。闽
楠 、红楠 AFLP反应体系的建立参照 Vos等[ 11]的方
法。各关键影响环节的优化实验如下。
1.2.1　酶　切
采用识别位点为 6碱基的 EcoRI和 4碱基的
MseI两种限制性内切酶对闽楠 、红楠基因组 DNA进
行双酶切 (20 μL体系)。分别对模板 DNA用量 、内
切酶用量和酶切时间等设置梯度实验。其中:DNA
用量设为 50ng、150ng、300ng、450 ng、600 ng;EcoRI
和 MseI内切酶用量设为 2U、3U、4U,共计 9个酶切组
合;酶切时间设置为 1h、2 h、4h、6h、8 h。
酶切反应条件为:37℃反应 4 h, 65℃变性
10 mins, 4℃保存 。
1.2.2　连　接
通过一步法与两步法连接效果的对比分析 ,对酶
切产物与接头连接反应进行优化。其中两步法的连
接反应条件设为:37℃ 4h, 37℃过夜 , 16℃过夜;一
步法反应条件设为:37℃ 4 h, 65℃变性 10 mins, 4℃
保存。
1.2.3　预扩增
对 AFLP预扩增反应(20 μL体系)中各影响因素
设置梯度实验 。其中酶切连接产物分别按 1倍 、5
倍 、10倍 、25倍 、50倍进行稀释 ,各取 5.0 μL进行下
游实验;Mg2+ (25 mM/L, 下同 )用量:0.8μL、
1.0μL、1.2 μL、1.6 μL、2.0 μL;dNTP(2 mM/L,下
同)用量:1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL;预
扩增引物 EcoRI引物(E00)、MseI引物(M00)用量:10
ng、20 ng、30 ng、40 ng、50 ng;Taq酶(5 U/μL)用量:
0.5U、1.0U、1.5U、2.0U、2.5U。
预扩增反应条件为:94℃ 2 mins, (94℃ 30 s→
56℃ 1min→72℃ 1 min)25个循环 , 72℃ 5 mins,
4℃保持。
1.2.4　选择性扩增
对 AFLP选择性扩增(20 μL体系)各影响因素
进行优化实验。预扩增产物稀释倍数:1倍 、10倍 、25
倍 、50倍 、 100倍 ,取 5.0 μL进行实验;Mg2+用量:
0.8μL、1.0μL、1.2 μL、1.6μL、2.0μL;dNTP用量:
1μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL;选择性扩增引物
(E+3/M+3)用量:25ng、35 ng、50ng、60 ng、75ng;
Taq酶用量:0.5U、1.0U、1.5U、2.0U、2.5U。
选择性扩增反应条件:94℃ 4mins, (94℃ 30 s→
65℃ 1 min→72℃ 1 min, 每个循环降低退火温度
0.7℃)13个循环 , (94℃ 30 s→56℃ 1 min→72℃ 1
min)25个循环 , 72℃ 5 mins, 4℃保持。
1.2.5　电泳与银染
在选择性扩增后的产物中加入 10μL上样缓冲
液 ,混匀 , 95℃变性 10min,立即转移至冰浴冷却 ,待
用。用 6%变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)检测扩增产
物 , 75 W恒功率电泳 2 h。经凝胶固定 、银染 、显影 ,
得到 AFLP扩增的 DNA谱带。
2　结果与分析
2.1　酶　切
2.1.1　模板 DNA用量
预扩增和选择性扩增产物的电泳结果显示 ,在
20μL酶切反应体系中 ,模板 DNA用量在 50 ～ 300
ng时 ,酶切完全 ,电泳条带清晰 ,但实验结果差异不
大;当 DNA用量增大至 450 ～ 600 ng时 ,电泳条带强
度反而有所降低 (见图 1)。鉴于闽楠 、红楠基因组
DNA不易提取 , 同时为了保证 AFLP反应所需的
DNA模版量 , 认为将酶切反应体系 (20 μL)中的
DNA模板用量控制在 150 ng比较合适。
　应用研究
40　 林业科技开发　2009年第 23卷第 3期
左图 1、3、5、 7、 9为闽楠扩增产物;2、4、 6、 8、 10为红楠扩增产物　　右图 1、2:50ng;3、4:150ng;5、6:300ng;7、 8:450ng;9、 10:600ng
图 1　不同 DNA模板用量的预扩增(左)与选择性扩增(右)产物的电泳检测结果
2.1.2　内切酶用量
采用 EcoRI和 MseI两种限制性内切酶对基因组
DNA进行单酶切和双酶切实验。预扩增产物电泳检
测结果表明 ,由于 EcoRI在基因组中切点数量少 ,酶
切片段较大(图 2:泳道 2、4);MseI在基因组中切点
数量多 ,酶切片段较小(图 2:泳道 1、3)。两种内切
酶不同用量组合酶切后谱带亮度差异不大(图 2:泳
道 5 ～ 22),这与选择性扩增的结果一致(图 3)。但
内切酶组合 EcoRI3U/MseI2U中扩增出一条清晰并
在别的组合中未出现的差异带(图 3:泳道 3、4箭头
所示)。综合以上实验结果 ,认为内切酶用量组合
EcoRI3U/MseI2U较为理想。
2.1.3　酶切时间
预扩增产物电泳检测结果表明 ,酶切时间为 1 h
和 2 h时 ,酶切不充分;酶切时间为 4h时 ,电泳结果
呈明亮的连续片状;酶切 6h和 8h时 ,酶切时间又过
长 ,片段较散。选择性扩增产物电泳检测结果同样显
示 ,酶切 4 h时 ,条带较为清晰(图 4:泳道 5-6)。综
合上述试验结果 ,认为酶切时间以 4 h为宜。
　　根据闽楠 、红楠基因组 DNA的特点 ,结合以上对酶
切反应各条件的实验分析 , 确定 AFLP分析的酶切体系
1、2:酶切 1h;3、4:酶切 2h;5、6:酶切 4h;7、8:酶切 6h;9、10:酶切 8h
图 4　酶切时间的选择性扩增电泳图
应用研究　
　林业科技开发　2009年第 23卷第 3期 41　
为:总体系20 μL,包括基因组 DNA150ng, NEBBuf-
er2 2 μL, BSA0.2 μL, EcoRI3U, MseI2U,加 ddH2O
至20 μL。 37℃酶切 4 h, 65℃变性10 mins, 4℃保存。
2.2　酶切产物与接头连接
前人在做 AFLP连接实验时 ,一步法 [ 12] 和两步
法[ 13]是 AFLP分析中酶切产物与接头连接反应中的
两种试验方法 。本研究拟通过对这两种方法连接效
果的比较分析 ,探索适宜于闽楠 、红楠 AFLP分析的
连接反应 。
　　试验结果表明:酶切产物连接一步法与两步法均
可扩增出条带 。但总体来说 ,两步法扩增的条带较一
步法的清晰 ,其中又以两步法中 16℃过夜扩增的效
果最好(图 5:泳道 5 ～ 6)。
综上认为最佳的酶切产物与接头的连接体系如下:
T4Bufer2.5μL, EcoRI接头 5pmol, MseI接头 50pmol, T4
连接酶 1U,加 ddH2O至5μL, 16℃连接过夜。
2.3　预扩增
对连接产物稀释倍数及预扩增反应各因素进行
优化实验。将预扩增产物进行选择性扩增 , PAGE电
泳结果(图 6)显示:连接产物稀释倍数为 25倍时 ,条
带较其他最为清楚 (图 6:泳道 7 -8);并筛选出
20μL预扩增体系中各关键因素的最适用量为:Mg2+
1.6μL(图 6:泳道 17-18)、dNTP2 μL(图 6:泳道
25-26)、预扩增引物 E00 、M00 30ng(图 6:泳道 35-
36)、Taq酶 1U(图 6:泳道 43-44)。
2.4　选择性扩增
确定适当的预扩增产物稀释倍数是选择性扩增体
系的关键 ,同时对选择性扩增反应各因素进行优化。
PAGE电泳检测结果(图 7)显示:预扩增产物稀释倍数
为 100倍时 ,条带较其他最为清楚(图 7:泳道 9-10);
并筛选出20μL选择性扩增体系中各关键因素的最适
用量为:Mg2+1.2μL(图 7:泳道 15-16)、dNTP2μL
(图 7:泳道 25-26)、选择性扩增引物 60 ng(图 7:泳
道 37-38)、Taq酶 1U(图 7:泳道 43-44)。
　应用研究
42　 林业科技开发　2009年第 23卷第 3期
2.5　闽楠 、红楠 AFLP优化反应条件的扩增结果
以上述最佳反应体系为基础 ,采用部分引物组合
对闽楠 、红楠的基因组进行选择性扩增 。结果表明 ,上
述实验筛选出的单项优化条件进行综合应用时 ,能扩
增出清晰 、丰富的条带。说明该优化反应条件可用于
红楠和闽楠 AFLP的进一步分析。图 8所示为优化反
应条件的选择性扩增结果。
图 8　闽楠、红楠 AFLP优化反应条件的选择性扩增结果
3　讨　论
AFLP实验成功与否受很多因素的影响 ,除了对模
板 DNA质量要求较高外 ,对限制性内切酶的选择与组
合 ,接头和引物设计 ,酶切连接 、预扩增 、选择性扩增反
应体系中各组分的用量 ,适宜的扩增程序等都有严格
的要求。宋红竹等[ 14]对杨树部分种进行 AFLP遗传多
样性分析 , 杨树 AFLP反应体系中 , 模板 DNA约
500ng;酶切后 DNA片段与接头连接 ,稀释 10倍后用
作预扩增反应的模板 ,预扩增采用 MseI+C/EcoRI+0
引物组合;预扩增产物稀释 30倍 ,用作选择性扩增反
应的模板 ,选择性扩增采用 E+2/ M+3引物组合[ 14] 。
其 AFLP反应程序中所采用的预扩增引物 、选择性扩
增引物 、模板用量 、稀释倍数 ,与本文中针对闽楠 、红楠
确立的 AFLP反应体系中各因素均不同。由此可见 ,
只有针对不同的物种进行 AFLP反应体系的优化才可
建立最佳反应系统。本文对闽楠 、红楠摸索出了适宜
AFLP指纹分析的最佳反应体系和反应条件 ,为闽楠 、
红楠建立在 AFLP分子标记技术为基础的遗传多样性
及其他相关分析奠定了良好的实验基础。
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(责任编辑　吴祝华)
“三荒 ”、“两漠 ”造林树种速生槐
速生槐根系发达 , 根蘖力和再生能力强 , 水平根系延伸
或断根后可萌发出新的植株 ,单株即可延伸成片林。将栽
100株 /667 m2速生槐育苗基地的苗 、根挖出后 , 靠残留根
第 2年可根蘖萌生出 400 ～ 500棵 /667m2新株。速生槐是
有效加快荒山 、荒坡 、荒滩造林的速生树种。
速生槐生长快 , 树干直 、材质好 , 栽植 、扩繁容易 , 管理
粗放 , 为多功能速生树种 , 10年便可采伐。
速生槐是一种抗旱能力极强的阔叶乔木 , 在年降水仅
200mm的地区仍然郁郁葱葱。 宁夏 8年生速生槐胸径可
达 22 cm,高 14 m。在 1.8 m厚的沙滩上栽植的 1年生苗 ,
持续干旱 60天无一枯死。速生槐耐瘠薄能力强。 速生槐
为豆科固氮树种 , 固氮能力优于大豆和其他豆科树种 , 为
“生物氮肥库”,可改善土壤性状 , 培肥地力。耐土壤贫瘠 ,
在土壤极其瘠薄干旱的半荒漠化和中轻度石漠化地区 ,速
生槐照常生长旺盛。
(吉林省集安市北方园艺研究所　梁山)
应用研究