全 文 ：第 11 期
收稿日期：2010－03－27
作者简介：张艳红（1970－），女，吉林吉林人，博士，主要从事观赏植物栽培和遗传育种研究，（电话）15941559546
（电子信箱）zyhmm8513＠163．com；通讯作者，沈向群。
第 49 卷第 11期
2010 年 11月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 49 No.11
Nov．，2010
到目前为止，全世界已知的杜鹃花属种类约为
967种。 中国有 561种杜鹃，占世界总种数的 58％，
而且常绿乔灌木型杜鹃花的绝大多数在中国，中国
是世界杜鹃花的发源地和分布中心［1］。 试验以辽宁
迎红杜鹃（Rhododendron mucronulatum Turcz．）为材
料，利用正交设计 L16（45）方法对 ISSR－PCR（Inter－
simple sequence repeat －Polymerase chain reaction
products，简单重复序列区间－多聚酶链式反应）反应
体系 （25 μL）的 5 个因素 （TaqDNA 聚合酶 、Mg2＋、
DNA 模板、dNTP、引物）在 4 个水平上进行了优化，
并对结果用 DPS 统计软件进行了较为详细的分析，
确立了较为可靠的反应体系，为研究杜鹃花的遗传
变异提供一个标准化程序，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1．1 材料
用于 DNA 提取和建立 ISSR 优化反应体系所
用的材料迎红杜鹃采自辽东学院花卉基地。 用于
ISSR－PCR 反应的引物由北京赛百盛生物工程公司
合成，TaqDNA聚合酶、dNTPs、Buffer（含 Mg2＋）、标准
分子量 Marker DL1000 购自天根生化科技有限公
司。
1．2 方法
取迎红杜鹃嫩叶 1．5 g提取 DNA， 加入 100 μL
超纯无菌水，置 4℃备用。采用正交设计 L16（45）方法
进行试验设计。将 16个处理重复 2次，在 BIO－PCR
迎红杜鹃 ISSR－PCR反应体系建立
张艳红 1，2，沈向群 2，刘旭颖 2，赵凤军 1
（1．辽东学院，辽宁 丹东 118003；2．沈阳农业大学园艺学院，沈阳 100161）
摘要：利用正交设计 L16（45）方法对迎红杜鹃（Rhododendron mucronulatum Turcz．）ISSR－PCR（Inter－sim-
ple sequence repeat－Polymerase chain reaction products）反应体系的 5 因素（TaqDNA 聚合酶、Mg2＋、DNA
模板、dNTP、引物）在 4 个水平上进行了优化试验。 结果表明，ISSR－PCR 反应体系各因素在设定的不同
水平对 PCR 反应结果都有影响，其中引物浓度的影响最大；筛选出了各反应因素的最佳水平，建立的迎
红杜鹃 ISSR－PCR 反应最佳体系（25 μL）为 2．0 μL 10×Buffer、0．3 μL Taq DNA 聚合酶（5U/μL）、2 μL
DNA 模板（20ng/μL），2．5 μL dNTPs（2．5 mmol ／ L）、2 μL 引物（10 μmol ／ L）。
关键词：迎红杜鹃；正交设计；简单重复序列区间－多聚酶链式反应体系
中图分类号：S685．21；Q503 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2010）11－2657-03
Optimization for ISSR－PCR System of Rhododendron mucronulatum
ZHANG Yan－hong1，2，SHEN Xiang－qun2，LIU Xu－ying2，ZHAO Feng－jun1
（1．Liaodong University，Dandong 118003，Liaoning，China；2．College of Horticulture，Shenyang Agricultural University，Shenyang 100161，China）
Abstract： The orthogonal design was used to optimize Rhododendron mucronulatum Turcz．’s ISSR－PCR （Inter－simple se-
quence repeat－Polymerase chain reaction products） amplification system’s five factors （Taq DNA polymerase， Mg2＋， DNA
template， dNTP， and primer） in four levels respectively． The results showed that， the affections of each factor in different
levels were found， and concentrations of primer was the most effective factor to the result of PCR， a most suitable ISSR－
PCR system for R． mucronulatum was established， it’s 25 μL reaction system which contained 2．0 μL 10×Buffer， 0．3 μL
Taq DNA polymerase （5 U/μL），2 μL DNA template（20ng/μL），2．5 μL dNTPs （2．5 mmol ／ L），and 2 μL primer （10 μmol ／ L）．
Key words： Rhododendron mucronulatum Turcz．； orthogonal design； Inter－simple sequence repeat－Polymerase chain reaction
products system
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2010.11.063
湖 北 农 业 科 学 2010 年
图中上半幅为引物 840，下半幅为引物 841；M 为标准分子量 DL1000
图 1 ISSR－PCR 正交试验电泳图
表 1 ISSR-PCR 优化的正交设计试验结果
处理
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
TaqDNA 聚合酶（5U/μL）
μL
0．15（1）
0．15（1）
0．15（1）
0．15（1）
0．20（2）
0．20（2）
0．20（2）
0．20（2）
0．25（3）
0．25（3）
0．25（3）
0．25（3）
0．30（4）
0．30（4）
0．30（4）
0．30（4）
10×Buffer
（Mg2＋）//μL
1．0（1）
1．5（2）
2．0（3）
2．5（4）
1．0 （1）
1．5（2）
2．0（3）
2．5（4）
1．0（1）
1．5（2）
2．0（3）
2．5（4）
1．0（1）
1．5（2）
2．0（3）
2．5（4）
20 ng/μL
DNA 模板//μL
1（1）
2（2）
3（3）
4（4）
2（2）
1（1）
4（4）
3（3）
3（3）
4（4）
1（1）
2（2）
4（4）
3（3）
2（2）
1（1）
2.5mmol/L
dNTPs//μL
1．0（1）
1．5（2）
2．0（3）
2．5（4）
2．0 （3）
2．5（4）
1．0（1）
1．5（2）
2．5（4）
2．0（3）
1．5（2）
1．0（1）
1．5（2）
1．0（1）
2．5（4）
2．0（3）
10μmol/L
引物//μL
2．0（1）
2．5（2）
3．0（3）
3．5（4）
3．5（4）
3．0（3）
2．5（2）
2．0（1）
2．5（2）
2．0（1）
3．5（4）
3．0（3）
3．0（3）
3．5（4）
2．0（1）
2．5（2）
引物
840
9
11
6
1
4
12
0
13
5
14
12
12
0
7
15
16
引物
841
8
8
3
1
2
12
14
15
11
10
5
6
13
9
16
4
平均
8.5
9.5
4.5
1
3
12
7
14
8
12
8.5
9
6.5
8
15.5
10
注：括号内数字为各因素的水平值。
扩增仪上进行扩增反应， 反应程序为 94℃ 5 min；
94℃ 30 s，56℃ 45 s，36 个循环；72℃延伸 1.5 min；
最后 72℃ 10 min，4℃保持。 PCR 产物用 1．5％琼脂
糖凝胶（含 EB 0．5 μL ／ mL）电泳，记录并拍照。 结果
采用 DPS统计软件进行分析。
2 结果与分析
2．1 ISSR－PCR 反应因素水平的确定
根据电泳结果（图 1），将 16 个处理从高到低依
次打分 ［2］，把清晰度高、条带数量丰富、背景低的最
佳产物记为 16分，依此类推，最差的记为 1分。 2次
重复分别独立统计．从 2 次重复的结果来看，各处理
组合的表现都具有较高的一致性。 依处理次序得到
的 2次分数见表 1，从中可以得出如下结论：得到最
高分的第 15 个处理即是最佳最合， 也就是在 25
μL PCR 反应体系中， 包含 2.0 μL 10×Buffer （含
Mg2＋）、0．3 μL Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）、2 μL
DNA 模板 （20ng/μL）2．5 μL dNTPs（2．5 mmol ／ L）、2
μL引物（10 μmol ／ L）。
将评分结果用统计软件 DPS 进行方差分析，结
果见表 2，由极差 R可知，引物的量对反应结果影响
最大，dNTPs 的影响最小， 各因素水平变化对 PCR
反应的影响从大到小依次为引物、TaqDNA 聚合酶、
10×Buffer（含 Mg2＋）、DNA 模板、dNTPs，其中引物的
水平 1 和水平 4 的结果差异显著，其他因子各水平
间差异不显著。
2．2 退火温度对 ISSR－PCR反应的影响
与 RAPD 随机引物相比，ISSR 引物更长， 所以
它们所需的退火温度要高， 而这使 ISSR－PCR 的可
重复性比 RAPD－PCR 更多，所以研究者能获得更可
靠的结果，但也有研究认为并非如此 ［3］。 有人认为
50～52℃的退火温度适用于所有不同序列的 ISSR引
物 ［4］，但是更多的研究者认为对不同的引物设定不
同的退火温度能得到更好的结果［5］。 为了确定所选
引物各自最佳的退火温度， 试验在 50～60℃之间进
行了筛选， 由 PCR 仪自动生成了 8 个温度梯度
（50．0、50．7、52．0、53．9、56.0、56．3、58．3、59．4℃），结果
筛选出的 16 个引物及其各自最适的退火温度水平
见表 3。
3 小结与讨论
适合杜鹃花 ISSR 分析的扩增条件优化体系为
在 25 μL PCR 反应体系中， 包含 2.0 μL 10×Buffer
（含 Mg2＋）、0．3 μL Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）、 μL
2658
第 11 期
表 2 不同水平对 ISSR-PCR 结果的影响
Kij
K1
K2
K3
K4
R
TaqDNA 聚合酶
5.88 aA
9.00 aA
9.38 aA
10.00 aA
4.12
Mg2+
6.50 aA
10.38 aA
8.88 aA
8.50 aA
3.88
DNA 模板
9.75 aA
9.25 aA
8.63 aA
6.63 aA
3.12
dNTPs
8.13 aA
9.63 aA
7.38 aA
9.13 aA
2.25
引物
12.50 aA
8.63 abA
8.00 abA
5.13 bA
7.37
注： 同列中英文小写字母表示在 P＜0.05 水平上的差异显著性；
大写字母表示在 P＜0.01 水平上的差异显著性。
表 3 16 个 ISSR 引物及其退火温度
引物编号
UBC807
UBC808
UBC810
UBC811
UBC826
UBC827
UBC835
UBC840
序列
（AG）8T
（AG）8C
（GA）8T
（GA）8C
（AC）8C
（AC）8G
（AG）8YC
（GA）8YT
退火温度//℃
50.0
56.3
50.0
58.3
59.4
59.4
52.0
50.0
引物编号
UBC841
UBC851
UBC855
UBC856
UBC866
UBC867
UBC880
UBC 3
序列
（GA）8YC
（GT）8YG
（AC）8YT
（AC）8YA
（CTC）6
（GGC）6
（GGAGA）3
G（CA）8C
退火温度//℃
56.0
50.7
52.0
56.3
56.3
59.4
50.0
53.9
DNA 模板 （20ng/μL）2．5 μL dNTPs （2．5 mmol ／L）、2
μL引物 （10μmol ／L）。 反应程序为 94℃充分变性 5
min；94℃变性 30 s，50～60℃（根据引物而定）退火 45
s，36 个循环；72℃延伸 1．5 min； 最后 72℃延伸 10
min，4℃终止反应。 以此条件对迎红杜鹃 DNA 进行
了 3次 ISSR分析，结果可靠，带型稳定。
由于 ISSR技术是基于 PCR 的一种标记， 所以
DNA 模板、 引物、dNTPs、TaqDNA 聚合酶等的浓度
以及引物的退火温度都能影响 ISSR－PCR 扩增的结
果，不同厂家和不同批次的药品用量也会不同。 因
此， 在正式试验前应该对各种影响因子进行优化，
初步摸清适宜的 ISSR 反应条件， 并应尽量采用同
厂家和同批次的药品。 本试验 TaqDNA 聚合酶浓度
在 0．3 μL（5 U/μL）时获得了较佳的扩增效果，这比
金凤等 ［6］、赵杨等 ［7］在月季（Rosa chinensis Jacq．）、
胡枝子属（Lespedeza Michx．）的 PCR 反应体系用量
要少；本试验借助 DPS 统计软件，采用正交设计方
法对杜鹃花 ISSR－PCR反应体系的 5因素在 4 个水
平上进行的优化， 将正交试验设计与分析应用到
PCR 反应系统的选优中，使分析结果更加具有科学
性。
参考文献：
［1］ 黄茂如． 杜鹃花［M］． 上海： 上海科学技术出版社， 1998．
［2］ 何正文，刘运生，陈立华，等． 正交设计直观分析法优化 PCR 条
件［J］． 湖南医科大学学报，1998，23（4）：403－404．
［3］ 张立荣，刘大群，徐大庆． 小麦 ISSR 分析初探［J］． 河北农业大
学学报，2004，27（1）：10－13．
［4］ 姜 静，杨传平，刘桂丰， 等． 桦树 ISSR－PCR 反应体系的优
化［J］． 生态学杂志，2003，22（3）：91－93.
［5］ 汪 岚，韩延闯，彭欲率． ISSR 标记技术在莲藕遗传研究中的
运用［J］． 氨基酸和生物资源，2004，26（3）：20－22．
［6］ 金 凤，陈崇顺，邹爱兰． 月季 ISSR 反应体系的优化［J］． 江苏
农业科学， 2006（1）：72－75．
［7］ 赵 杨，陈晓阳，王秀荣，等 ． 9 种胡枝子亲缘关系的 ISSR 分
析［J］． 吉林林业科技，2006，35（2）：1－4．
张艳红等：迎红杜鹃 ISSR－PCR 反应体系建立
《杂交水稻》是由国家杂交水稻工程技术研究中心和湖南杂交水稻研究中心主办的、对国内外公开发行的专业技术
刊物，刊号：ISSN 1005-3956，CN 43-1137/S。 获第二届国家期刊奖提名奖，为全国中文核心期刊、中国科学引文数据库
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2011年《杂交水稻》征订启事
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