全 文 ：第 40 卷 增刊
2013 年
北京化工大学学报(自然科学版)
Journal of Beijing University of Chemical Technology (Natural Science)
Vol． 40，Suppl．
2013
云南小粒咖啡湿法发酵过程中细菌分离与鉴定
董红红1 杨 盼1 吕 杰1* 盛 军2
(1. 北京化工大学 生命科学与技术学院，北京 100029;
2. 云南农业大学 普洱茶学教育部重点实验室，云南 昆明 650201)
摘 要:咖啡发酵过程中微生物种类、数量的变化及它们的代谢产物如酸等引起的发酵体系变化将直接影响着咖
啡的最终品质。本文首次对云南小粒咖啡湿法发酵体系中的 pH值和 8 种有机酸的含量变化进行了测定，并分离
和鉴定了发酵过程中的细菌种类。结果发现在整个发酵过程中，pH值变化整体呈下降趋势;本文所测 pH 值变化
与利用 HPLC法检测的有机酸草酸、乙酸、乳酸含量变化规律相吻合，而苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和丙酸基本上保持
不变，其中丙酸含量最低。在 20 ℃下，结合发酵过程中的 pH 值，采用传统的微生物培养法，对整个发酵过程的细
菌进行了分离、纯化和鉴定。结果发现存在大量的产果胶酶的细菌，包括产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes、肠膜明
串珠菌 Leuconostoc mesenteroides、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis、蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus、巨大芽孢杆菌 Bacillus
megaterium，冰核活性细菌 Erwinia herbicola、肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae等，并对分离、鉴定出来的细菌在发
酵中所起的作用进行了剖析。
关键词:小粒咖啡;湿法发酵;细菌;pH值;有机酸
中图分类号:Q93
收稿日期:2013－04－02
基金项目:云南省科技厅州、市党政“一把手”科技工程
(2008QA028)
第一作者:女，1985 年生，硕士生
* 通讯联系人
E-mail:lvjie@ mail． buct． edu． cn
引 言
普洱小粒咖啡以“味道香浓、但不苦涩，带有淡
淡的果酸味”等特征著称，有数据表明，云南省的小
粒咖啡与世界上最好的蓝山咖啡品质相近，都具有
很强的市场竞争力［1］。
咖啡生产加工工艺有干、湿两种方法［2］。在我
国的云南省，一般采用湿法加工［3］。湿法加工包括
咖啡豆的发酵过程，即使残余在种子上的果肉残渣
脱落，顺便也会溶解咖啡豆表面的黏质物，最后用水
洗净，经日光晒干即可。这种黏液状的果胶物质是
由糖、酶、原果胶质和果胶脂组成的化学物质构
成［4］，通过自然发酵可以除去。如果发酵不完全，
残留的黏液将给微生物生长提供有利媒介，会在干
燥和贮存过程中形成二次发酵，致使咖啡出现异
味［5］。此外，如果发酵过度，会有丙酸、丁酸等代谢
产物的生成，这些物质的存在会使咖啡味道出现酸
味和苦味过重，严重影响咖啡品质［6］。所以咖啡的
发酵过程在整个处理过程中占有重要位置。目前，
国外对咖啡发酵中微生物的研究较多，如 Silva 等［6］
对巴西小粒咖啡传统发酵过程中的细菌演变规律进
行了报道;Massawe 等［7］对坦桑尼亚的咖啡发酵过
程中的乳酸菌进行了研究;Ｒodarte 等［8］对巴西小粒
咖啡发酵中产果胶酶的多种细菌进行了报道。而我
国对有关此类微生物的研究却鲜有报道。近几年来
我国有关此类的研究主要集中于咖啡种植资源收
集、咖啡系列产品开发等领域，如李贵平等［9］对云
南咖啡种质资源调查和收集的研究，李国鹏等［10］用
分子标记技术对咖啡育种进行改良研究等，但在咖
啡发酵研究领域研究较少。
研究表明，大量产果胶酶的细菌广泛的存在于
湿法发酵过程中［6］。而国外报道的干法工艺中，发
现成团肠杆菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、巨大芽孢
杆菌、芽孢杆菌和浸麻乳酸菌为发酵过程中的优势
菌种。细菌的种类要比酵母和真菌的复杂，且会产
生大量的酸性代谢物［11］，从而能引起 pH 的降低，
影响咖啡品质，所以对发酵过程存在的细菌研究很
有必要。果胶在果胶酶的作用下水解生成乳酸、乙
酸和更多的羧酸。在咖啡发酵中起到影响酸味作用
的主要有 6 种有机酸，分别是苹果酸、柠檬酸、乳酸、
乙酸、琥珀酸和草酸［12］。而丁酸和丙酸的形成会降
DOI:10.13543/j.cnki.bhxbzr.2013.s1.008
低咖啡的品质［6］。Pederson 等［13］研究表明，墨西哥
的咖啡干法发酵中微生物分布主要表现为以细菌为
主，且数量要大于酵母和真菌。而 van Pee 等［14］研
究表明，在罗布斯塔咖啡湿法发酵中，酵母菌种是占
优势菌种，数量大于细菌和真菌。造成这种菌种相
对优势比例不同的最重要的原因就是 pH 的不同。
在湿法发酵中由于微生物的酸性代谢物的产生，pH
是随着发酵的进行逐渐降低的，在这种酸性较低的
条件下则会引起好氧细菌数量的减少，而酵母菌的
数量却是逐渐增加的［15］。因此推测 pH 的变化间
接的反映了微生物的变化，从而间接的影响了咖啡
的品质。
本文对咖啡湿法发酵整个周期内都进行了采
样，对咖啡发酵体系里 pH 值的变化及存在的主要
酸类型进行了测定，并对分离到的细菌进行了 16S
rDNA测序鉴定，得到了多种产果胶酶细菌，为更深
一步研究微生物的种群结构及其在湿法发酵过程中
的作用奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
云南省南岛河咖啡种植基地种植的小粒咖啡。
本次发酵原料为 40 t，发酵后为 32 t。发酵前原料的
含水量为 57. 05%(质量分数)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 发酵地点、时间及过程
本批咖啡的发酵地点为云南省小粒种咖啡思茅
标准化示范区，发酵时间从 2011－11－09T20:00 到
2011－11－11T8:00，共 36 h。
湿法发酵过程为:采收—鲜果分级(同时除去
杂质)—脱皮(果肉去除机)—发酵(脱胶除去内果
皮上附着的黏膜)清洗—咖啡豆分级(通过水流重
力作用分开重量轻和重的豆粒)—浸泡(24 h)—干
燥(日光)—脱壳—分级(电子选豆机)—包装入库。
1. 2. 2 取样
在小粒种咖啡思茅标准化示范区分别取脱皮后
的咖啡原豆，发酵第 13 h 的样品，发酵第 18 h 的样
品，发酵第 23 h的样品，发酵结束时第 36 h 的样品，
一共取 5 次样。每次取样 100 g，用于 pH值、有机酸
的测定和微生物菌悬液的制备。
1. 2. 3 咖啡样品及培养基 pH值的测定
5 g咖啡样品与 5 倍体积的去离子水，匀浆拍打
3 min，将 pH计(PHS-3C，上海精密科学仪器有限公
司)的探头插入匀浆液中，数值稳定后，记录下 pH
值。
水浴锅的温度设置为 20 ℃后，把装有 200 mL
培养基的锥形瓶经过灭菌后放入水浴锅中预热并摇
匀，然后测定其 pH，再滴加醋酸溶液进行调节，最后
达到符合的 pH［16］。
1. 2. 4 菌种的分离和纯化
100 g咖啡豆样放入无菌匀浆袋中，加入 100 mL
无菌水，匀浆机拍打 3 min，高速冷度离心机离心，去
上清，制成匀浆液。将制备的匀浆液作为菌悬液分
10 －3、10 －4、10 －5 3 个梯度稀释，分别涂布到灭过菌
pH值调试好的 LB培养基、YEPD 培养基、查氏培养
基、WL鉴别培养基、EMB 署红亚甲基蓝培养基和
MＲS培养基的平板上，20 ℃温度下恒温培养，挑取
典型微生物单菌落进行划线纯化培养，并进行测序
鉴定。
1. 3 分析方法
1. 3. 1 样品处理及有机酸的测定
将保存的咖啡样品(发酵 0 h样品，发酵 13 h 的
样品，发酵 18 h 样品，发酵 23 h 样品，发酵 36 h 样
品)在室温下解冻，4 g样品与 36 mL的超纯水混合，
粉碎机(TH220-PCＲ，美国 OMNI公司)粉碎 15 min，
经过 0. 2 mm的有机膜过滤器过滤。分别测乙酸，乳
酸的峰面积。色谱条件:色谱柱 KromasilC18，250
mm ×4. 6 mm;流动相 5 mmol /L 浓 H2 SO4，流速 0. 6
mL /min。进样量 20 μL，柱温 30 ℃。
1. 3. 2 菌种鉴定
挑取纯化的细菌单菌落到装有 20 μL 的无菌水
的 PCＲ管中，混匀制成菌悬液，作为 DNA 模板。细
菌的 PCＲ 体系:10 × Taq Buffer 5 μL、2. 5 mm dNTP
mixture 4μL 、Taq DNA 聚合酶(5 U /μL)0. 25μL、上
游引物(10 μmol /L)1. 5 μL、下游引物(10 μmol /L)
1. 5 μL、菌悬液 2. 5 μL、无菌水 38 μL。PCＲ 的反应
条件:①预变性 94 ℃ 5 min;②变性 96 ℃ 30 s;③复
性 52 ℃ 30 s;④延伸 72 ℃ 50 s，步骤② ～④循环 35
次;⑤延伸 72 ℃ 10 min;⑥4 ℃保温。将得到的
PCＲ产物送到北京三博远志测序部，根据测序正常
的结果，在 BLAST 系统中找出对应菌种，完成菌种
鉴定工作。
上游引物
27F:5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3
下游引物
1492Ｒ:5-TCCTCCgCTTATTgATATgC-3
·72·增 刊 董红红等:云南小粒咖啡湿法发酵过程中细菌分离与鉴定
2 实验结果
2. 1 咖啡湿法发酵过程中的 pH值变化
发酵体系中的 pH值对咖啡发酵过程中微生物
影响很大，本实验对咖啡整个发酵周期内的 pH 进
行了检测。图 1 为发酵过程中 pH 随发酵时间的的
变化情况，pH值总体在 4. 1 ～ 5. 3 之间，发酵体系呈
酸性。通过分析发现，整个发酵过程中 pH 变化呈
下降趋势，发酵前期，pH暂时处于基本稳定状态，保
持在 5. 1 左右。在发酵 18 h 之后 pH 下降的较快，
发酵 23 h之后，pH则下降缓慢。
图 1 发酵时间对 pH值的影响
Fig． 1 Change of pH value with the
pile-fermentation time
2. 2 咖啡湿法发酵过程中 7 种有机酸量的变化定
图 2 为发酵过程中 7 种有机酸随发酵时间的的
变化情况。由图 2 可知，草酸、乙酸和乳酸含量在整
个过程含量呈上升趋势，草酸含量最高。这 3 种有
机酸在发酵初期，增长缓慢。发酵 18 h 后草酸，乳
酸和乙酸增加都是最快的，发酵后期增加量变缓，这
3 种酸的变化规律和 pH 值的变化是相吻合的。变
化不明显的有机酸如苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和丙
酸，本研究中未检测出丁酸，而检测出的丙酸是有机
酸中含量最低的，发酵 23 h 质量浓度达到整个周期
的最大值，为 0. 188 mg /mL，而在发酵结束的时候，
质量浓度为 0. 016 mg /mL，基本上检测不到。
2. 3 咖啡发酵过程中细菌的鉴定及其分离
本次研究对传统湿法咖啡发酵过程中细菌群落
的多样性进行了评估，一共挑送了 225 个纯化菌落
进行了 PCＲ测序、鉴定和保存。共鉴定出 27 种不
同种类的细菌菌种，归为 15 类菌属，结果如表 1。
其中数量最多的为肠杆菌属，如变形菌门 Enter-
obacter cowanii、阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii、路
德维希肠杆菌 Enterobacter ludwigii。其次是芽孢菌
图 2 发酵时间对有机酸含量的影响
Fig． 2 Changes of organic acid content with
pile-fermentation time
属、假单胞菌属，如成团泛菌枯草芽孢杆菌 Bacillus
subtilis、蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus、巨大芽孢杆菌
Bacillus megaterium、萤光假单孢菌 Pseudomonas fluo-
rescens、铜绿假单胞菌 Pseudomonas fulva。还有葡糖
杆菌属、克吕沃尔菌属，如弗托氏葡萄糖酸杆菌 Glu-
conobacter frateurii、氧化葡萄糖酸杆菌 Gluconobacter
oxydans、葡萄糖杆菌 Gluconobacter cerinus、中间克吕
沃尔菌 Kluyvera intermedia、栖冷克吕沃尔菌 Kluyvera
cryocrescens。
3 讨论
通过分析发现，整个发酵过程中 pH 值变化呈
下降趋势，整体偏酸性，其变化与微生物代谢活动有
关。而本文中的草酸、乙酸和乳酸是主要的酸代谢
物。Avallone等［17］对墨西哥的小粒咖啡发酵的机
理进行了报道，通过对整个发酵过程的样品进行检
测，发现产生乳酸和乙酸的细菌，作用主要引起 pH
降低的。发酵前 18 h，pH 降低比较缓慢，可能是因
为发酵时间(夜间)温度较低，微生物代谢处于一个
停滞期，初期微生物的种类丰富，如乳酸细菌等存
在，仅仅消耗营养物中单糖，产生少量的有机酸［5］。
但 18 h之后一些好氧微生物大量生长，如产酸克雷
伯式菌 Klebsiella oxytoca产酸克雷伯菌、荧光假单胞
菌 Pseudomonas fluorescens等，产生纤维素酶和果胶
酶，降解果胶，产生大量的酸性物质，使 pH 迅速降
低。发酵后期因为酸度过低导致一些细菌生长受到
抑制，推测这些菌种和酸性代谢物的产生对咖啡的
发酵起到调节促进作用。
本文分离出的产果胶酶细菌肠系膜明串珠菌
Leuconostoc mesenteroides曾被报道产大量的乳酸，引
起 pH 的降低［17］。本文被分离出的草生欧文菌
·82· 北京化工大学学报(自然科学版) 2013 年
表 1 发酵中细菌的鉴定结果
Table 1 Identification results for bacteria in fermentation
菌株编号 培养基 pH 温度 /℃ 来源编号 菌株名称 相似性 /%
Y-1 Y 5. 57 20 JN167946. 1 Yersinia kristensenii 99
Y-2 Y 4. 83 20 AB696775. 1 Sphingomonas sp 100
Y-3 Y 4. 83 20 JQ286962. 1 Leuconostoc mesenteroides 100
Y-4 Y 4. 83 20 JN642252. 1 Pseudomonas fluorescens 100
Y-5 Y 5. 57 20 JN835511. 1 Enterobacter cowanii 100
Y-6 Y 5. 69 20 AB274290. 1 Enterobacter sakazakii 100
Y-7 Y 5. 69 20 HQ407266. 1 Escherichia hermannii 100
Y-8 Y 5. 57 20 JQ229796. 1 Pseudomonas fulva 99
LB-1 LB 4. 38 20 JF938989. 1 Kluyvera intermedia 99
LB-2 LB 5. 57 20 AM184098. 1 Erwiniaherbicola 99
LB-3 LB 4. 83 20 AB495128. 1 Pseudomonas lutea 100
C-1 C 4. 83 20 KC128897. 1 Bacillus subtilis 100
C-2 C 4. 83 20 JF794022. 1 Gluconobacter frateurii 100
EMB-1 EMB 5. 69 20 AM184245. 1 Kluyvera cryocrescens 99
EMB-2 EMB 4. 83 20 HM047740. 1 Pantoea dispersa 100
EMB-3 EMB 4. 38 20 HE585223. 1 Ewingellaamericana 100
EMB-4 EMB 4. 38 20 JX026700. 1 Bacillus cereus 99
EMB-5 EMB 5. 69 20 EU982878. 1 Klebsiella oxytoca 100
EMB-6 EMB 4. 38 20 EU256396. 1 Bacillus megaterium 99
EMB-7 EMB 5. 57 20 JN712163. 1 Ｒahnella aquatilis 100
EMB-8 EMB 4. 38 20 AB647208. 1 Klebsiella pneumoniae 100
EMB-9 EMB 5. 69 20 JQ002568. 1 Serratia marcescens 100
WL-1 WL 5. 69 20 GQ915080. 1 Enterobacter ludwigii 99
WL-2 WL 4. 83 20 EF210101. 1 Enterobacter aerogenes 100
WL-3 WL 4. 83 20 JF794016. 1 Gluconobacter cerinus 99
MＲS-1 MＲS 5. 57 20 JX077098. 1 Pantoea agglomerans 100
MＲS-2 MＲS 4. 37 20 JN004201. 1 Gluconobacter oxydans 100
Erwinia herbicola、佛里德兰德氏杆菌 Klebsiella pneu-
moniae是降解果胶酶的细菌［18］。草生欧文菌 Er-
winia herbicola、佛里德兰德氏杆菌 Klebsiella pneu-
moniae 是降解果胶酶的细菌［18］。Escherichia her-
mannii菌属据报道有降低果胶黏液的作用［19］。产
气肠杆菌 Enterobacter aerogenes能分泌果胶酶，当咖
啡发酵中的果胶质量分数达到 60% ～ 70%时，这种
细菌就参与果胶酶的分解中［6］。芽胞杆菌属 Bacil-
lus sp产生一些列胞外酶，如纤维素酶、酰胺酶、蛋
白酶，可能在发酵过程中起着重要作用，这些胞外酶
能够降解诸如纤维素及果胶之类的化合物。如本文
分离出的蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus、巨大芽胞杆
菌 Bacillus megaterium 和枯草芽胞杆菌 Bacillus sub-
tilis是最常见的水解纤维素的芽孢杆菌［6］。
另外发现的菌种中如阴沟肠杆菌 Enterobacter
cloacae、产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes、Enter-
obacter sakasaki以及克雷伯氏菌属 Klebsiella sp曾在
巴西咖啡干法工艺处理中鉴定出来［6］。同样，菌种
如蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus、枯草芽胞杆菌 Bacil-
lus subtilis、巨大芽胞杆菌 Bacillus megaterium、肠系
膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides、肠杆菌属 En-
terobacter sp、耶尔森氏菌属 Yersinia sp 和沙雷氏菌
属 Serratia sp 已经在国外的咖啡发酵中被报道
过［14］。本研究发现的未见报道的细菌种类有葡糖
·92·增 刊 董红红等:云南小粒咖啡湿法发酵过程中细菌分离与鉴定
杆菌属 Gluconobacter sp、泛菌属 Pantoea sp 和鞘氨
醇单胞菌属 Sphingomonas sp，对它们在发酵过程中
所起的作用有待于进一步的研究，而从本研究中分
离出的大量细菌对产果胶酶的验证试验仍在继续
进行。
本文使用 6 种培养基全面系统的分离和鉴定了
云南小粒咖啡湿法发酵过程中的细菌种群，且对发
酵环境中的 pH值及 8 种有机酸的含量的变化进行
了测定。由于每种培养基对细菌种类的计数较复
杂，因此本文中只是从咖啡发酵中初步筛菌，简单的
剖析了分离出来的各细菌在发酵过程中所扮演的角
色，与国外的有关咖啡发酵中研究结果形成互补，也
是首次对云南小粒咖啡发酵中的微生物进行探索研
究，望为将来从事研究咖啡发酵中微生物的群落结
构及作用机理的科研工作者提供一些参考。
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Isolation and identification of bacteria in wet
processed Yunnan arabica coffee
DONG HongHong1 YANG Pan1 LU Jie1 SHENG Jun2
(1. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029;
2. Ministry of Education Key Laboratory of Pu’er Tea，Yunnan Agricultural University，Kunming Yunnan 650201，China)
Abstract:The change of microbial species，quantities and their metabolites such as acids，enzymes and etc in the
coffee fermentation process would affect the final quality of coffee directly． In this paper，for the first time we deter-
mined the change rules of pH value，content variations of the eight kinds of organic acids，isolated and identified
the bacterial community in the whole fermentation of Yunnan arabica coffee processed by wet method． It was found
that the variation of pH values showed a decrease trend，corresponding with the change of contents of oxalic acid，
acetic acid and lactic acid which were measured by high performance liquid chromatography (HPLC)method．
However，the contents of malic acid，citric acid，succinic acid and propionic acid remained substantially constant，
among which the content of propionic acid was the minimum． Isolation，purification and identification of bacteria
were conducted by using the traditional microbial culture method at an environmental temperature of 20 ℃ and the
same pH value as the fermentation system． The results showed a large number of bacteria existed which could me-
tabolize pectinase，including Enterobacter aerogenes，Leuconostoc mesenteroides，Bacillus subtilis，Bacillus cereus，
Bacillus megaterium，Erwinia herbicola，Klebsiella pneumonia，etc． And the role of the identified bacteria in the
coffee fermentation was also analyzed．
Key words:arabica coffee;wet processed;bacteria;pH value;organic acid
·13·增 刊 董红红等:云南小粒咖啡湿法发酵过程中细菌分离与鉴定