全 文 ：咖啡为世界三大饮料之首， 是国际贸易中非常
重要的原料产品 [1-2]。 咖啡为茜草科（Rubiaceae）咖
啡属（Coffea）植物， 该属植物共 100 多种， 而生产
性栽培的主要为小粒种和中粒种， 小粒种约占栽培
面积的 70％， 中粒种约占 30％[3-5]。 小粒种咖啡因
其品质优于中粒种咖啡， 其国际市场交易价格也经
常是中粒种咖啡的 2～3 倍， 因此， 在咖啡贸易过
程中常常出现将中粒种咖啡冒充小粒种咖啡进行销
售的不法行为， 损害消费者的利益 [6]； 另外， 两种
咖啡适合种植的生长环境也有差异， 小粒种适合种
植于高海拔温热地带， 而中粒种适合种植于低海拔
的高温湿热地区， 如果两种咖啡的种子或苗木发生
混淆， 则会造成咖啡减产并影响咖啡品质， 给咖啡
种植者带来很大影响[7-8]。 因此， 生产和市场贸易上
热带作物学报 2014， 35（4）： 622-627
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-09-16 修回日期 2014-01-13
基金项目 国家自然科学基金项目（No. 31071475， 31000740）。
作者简介 王晓阳（1983年—）， 男， 硕士， 助理研究员； 研究方向： 遗传育种学。 *通讯作者（Corresponding author）： 董云萍（DONG Yunping），
E-mail: dyp6005@163.com。
利用 SSR分子标记快速鉴别
中粒种与小粒种咖啡
王晓阳 1， 董云萍 1*， 黄丽芳 1， 闫 林 1， 周 华 2
陈金焕 3， 孙 燕 1， 林兴军 1
1
中 国 热 带 农 业 科 学 院 香 料 饮 料 研 究 所
农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室
海南省热带香辛料作物遗传改良与品质调控重点实验室
海南万宁 571533
2 云南省德宏热带农业科学研究所， 云南瑞丽 678600
3 云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所， 云南保山 678025
摘 要 为快速、 准确地鉴别中粒种与小粒种咖啡， 以不同种源的中粒种和小粒种咖啡为试验材料， 对 514 对
SSR 引物进行中、 小粒种咖啡种间特异性引物筛选， 最终筛选到 1 对特异性引物， 该引物在小粒种咖啡样本中
扩增出 90 bp 和 110 bp 双带产物， 而在中粒种咖啡样本中只扩增出 90 bp 或 100 bp 的单带产物， 根据产物条带
的数目即可对中粒种和小粒种咖啡进行鉴别。 经随机抽取中、 小粒种咖啡样本进行种类鉴别准确性验证， 验证
结果与实际结果一致。
关键词 中粒种咖啡； 小粒种咖啡； SSR； 鉴别
中图分类号 S571.2 文献标识码 A
Distinguishing Analysis Between Coffea canephora and
C. arabica Species by SSR Markers
WANG Xiaoyang1, DONG Yunping1*, HUANG Lifang1, YAN Lin1
ZHOU Hua2, CHEN Jinhuan3, SUN Yan1, LIN Xingjun1
1 Spice and Beverage Research Institute, CATAS / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops,
Ministry of Agriculture / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice
and Beverage Crops, Wanning, Hainan 571533, China
2 Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan, Ruili, Yunnan 678600, China
3 Tropical and Subtropical Economic Crops Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Baoshan,
Yunnan 678025, China
Abstract This study was conducted to provide an efficient method to distinguish between C. canephora and C.
arabica. One pair of coffee species-specific SSR primers were selected from 514 pairs of SSR primers. The results
of PCR amplifying analysis demonstrated that two fragments of 90 and 110 bp from C. arabica and one fragment of
90 or 100 bp from C. canephora were respectively amplified by the primers, meaning C. arabica and C. Canephora
coffee could be identified according to the number of amplified fragments. The result of the method was proved to
be reliable through our verification test.
Key words Coffea canephora; Coffea arabica; SSR; Distinguishing
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.002
第 4 期 王晓阳等： 利用SSR分子标记快速鉴别中粒种与小粒种咖啡
序号 所属种类 样本种质名称 种质来源 序号 所属种类 样本种质名称 种质来源
1 小粒种 铁毕卡 德热所 23 中粒种 越南 香饮所
2 小粒种 卡蒂姆7963 德热所 24 中粒种 泰国 香饮所
3 小粒种 肯尼亚-1 德热所 25 中粒种 24号 香饮所
4 小粒种 巴西-2 德热所 26 中粒种 24-2 香饮所
5 小粒种 台湾 香饮所 27 中粒种 24-10 香饮所
6 小粒种 墨西哥 德热所 28 中粒种 24-11 香饮所
7 小粒种 NY002 香饮所 29 中粒种 26号 香饮所
8 小粒种 CB52 香饮所 30 中粒种 27号 香饮所
9 小粒种 蓬莱大杨 香饮所 31 中粒种 兴28 香饮所
10 小粒种 德热48-1 德热所 32 中粒种 兴29 香饮所
11 小粒种 德热132 德热所 33 中粒种 兴31 香饮所
12 小粒种 德热161 德热所 34 中粒种 兴32 香饮所
13 小粒种 德热199-1 德热所 35 中粒种 兴33 香饮所
14 小粒种 CCC24 香饮所 36 中粒种 兴34 香饮所
15 小粒种 云南贡山 热经所 37 中粒种 大丰1号 香饮所
16 小粒种 SL28 德热所 38 中粒种 大丰3号 香饮所
17 小粒种 SL34 德热所 39 中粒种 大丰4号 香饮所
18 小粒种 S795 德热所 40 中粒种 越南1 香饮所
19 小粒种 蓝山 德热所 41 中粒种 马来西亚-1 香饮所
20 小粒种 蓝山2号 德热所 42 中粒种 巴布亚新几内亚 香饮所
21 小粒种 哥伦比亚 德热所 43 中粒种 泰国4-1 香饮所
22 小粒种 RUME SUDAN 德热所 44 中粒种 热经所中粒种 热经所
表1 试验材料明细表
Table 1 The experimental samples list
急需一种快速、 方便、 可靠的鉴别中、 小粒种咖啡
的检测方法。
传统方法鉴别中、 小粒种咖啡主要通过将咖啡
培炒后进行杯品品尝， 这种方法容易受主观人为因
素及培炒条件等影响， 鉴别结果不准确， 且需要专
业杯品师参与， 可操作性差。 现有中、 小粒种咖啡
鉴别技术主要包括化学分析法及 DNA 分子标记检
测法。 化学分析法主要基于两种咖啡内含特定化学
物质含量存在差异， 通过测定这些化学物质含量，
如固醇类、 脂肪酸、 绿原酸及咖啡因等， 再与标准
样品进行比较鉴别， 由于这类化学物质含量都处于
一个幅度范围， 没有固定值， 且含量差异不是十分
明显， 同时， 某些化学物质含量容易受栽培条件、
代谢生理等因素的影响， 检测结果精确性较差[9-11]。
基于检测 DNA 分子水平多态性的分子标记技
术的发展为种间鉴别提供了有效途径， DNA 分子
标记可以直接反映 DNA 水平上的遗传多态性， 表
现为核苷酸序列上的差异， 这种方法不受人为及环
境因素的影响， 检测结果非常精确。 在所有分子标
记中， SSR 分子标记由于具有染色体上分布均匀、
多态性丰富、 共显性、 分辨率高和易于检测等优
点， 自开发以来就成为最为有效构建许多作物指纹
图谱的工具， 被广泛应用于品种鉴定等方面 [12-14]。
目前尚未有利用 SSR 分子标记鉴别咖啡种类的方
法， 因此， 本研究拟开发出一种利用 SSR 分子标
记快速鉴别中粒种与小粒种咖啡的方法， 为咖啡生
产上种子、 苗木种类鉴定及咖啡市场贸易中产品的
真伪鉴别提供有效的工具。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为中粒种和小粒种咖啡不同种质叶
片， 分别取自中国热带农业科学院香料饮料研究所
（以下简称 “香饮所”）、 云南省德宏热带农业科学研
究所（以下简称“德热所”）和云南省农业科学院热带亚
热带经济作物研究所（以下简称“热经所”）咖啡种质资
源圃。 材料分两部分， 一部分用于筛选中粒种、 小粒
种咖啡种间特异性 SSR 引物（表 1）， 另一部分用于
验证所筛选引物在中粒种与小粒种之间的种间特异
性。 取上述种质样本的新鲜无病斑嫩叶， 置于-70℃
超低温冰箱保存备用或利用硅胶干燥剂干样保存。
623- -
第 35 卷热 带 作 物 学 报
1.2 方法
1.2.1 总 DNA 的提取 咖啡总 DNA 提取采用植
物基因组 DNA 提取试剂盒提取（TIANGEN 牌离心
柱型试剂盒， 目录号： DP305）， 操作方法详见产
品说明。
1.2.2 SSR-PCR扩增 PCR扩增体系为20 μL 体系，
包括： 模板 DNA 1 μL、 10×Buffer 2 μL、 2.5 mmol/L
dNTPs 1.6μL、 25mmol/L MgCl2 1.2μL、 引物 0.8μL、
5 U Taq 酶 0.1 μL、 ddH2O 13.3 μL； PCR 反应程
序采用降落 PCR(Toutchdown PCR)： 95 ℃预变性
3 min； 梯度降温扩增： 95℃ 30 s， 66℃（-1℃/cycle）
45 s， 72 ℃ 1 min， 15 个循环； 一般性扩增： 95 ℃
30 s， 51℃ 45 s， 72℃ 1min， 25个循环； 延伸 72℃
5 min； 4℃保存。
1.2.3 PCR 扩增产物电泳检测 PCR 扩增产物采
用 8％变性聚丙烯酰胺凝胶（210 g 尿素、 1 g 甲叉、
39 g丙烯酰胺、 50 mL 10×TBE， 定容至 500 mL）进
行电泳检测 ； 采用 1×TBE 作为电泳缓冲液 ； 在
20 μL SSR-PCR产物体系中加入 6μL溴酚蓝上样缓
冲液（0.125g溴酚蓝、 20g蔗糖， ddH2O定容至 50mL），
上样 1.5 μL至点样孔中， 200 V恒压电泳1 h。
1.2.4 银染显影 电泳结束后迅速进行银染显影。
固定： 将电泳完的凝胶放入固定液中（100 mL 无水
乙醇、 5 mL 乙酸， ddH2O 定容至 1 000 mL）， 固定
5 min 后取出， 蒸馏水清洗 1 次； 银染： 将固定后
的凝胶放入银染液中（0.8 g 硝酸银， ddH2O 定容至
1 000 mL）， 银染 10 min后取出， 蒸馏水清洗 2 次；
显影： 将银染后的凝胶放入显影液中（15 g 氢氧化
钠、 10 mL 甲醛， ddH2O 定容至 1 000 mL）， 直至
条带清晰显出， 取出凝胶于胶片灯箱上观察拍照。
2 结果与分析
2.1 引物初筛
特异性引物筛选所用引物来源于文献及数据库
已发表、 公布的咖啡种属特异性 SSR 引物 [15-24]， 共
514 对。 利用中、 小粒种咖啡样本各 2 个（中粒种：
越南、 泰国； 小粒种： 卡蒂姆 7963、 铁毕卡）进行
筛选， 剔除无扩增产物或无多态性引物， 选留扩增
条带清晰、 重复性好、 种内一致性较高、 种间差别
明显的引物作为候选引物， 初步筛选出种间特异性
候选引物 10对（图 1）。
M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M
M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M
500
400
350
300
250
200
150
100
bp
500
400
350
300
250
200
150
100
bp
上排从左至右： Carm012、 Carm021、 M25、 M29、 M3； 下排从左至右： 774、 SSR124577、 SSRZAP25、 M327、 SSR124195；
M： Marker； 1～2： 中粒种； 3～4： 小粒种。
Top row from left to right: Carm012, Carm021, M25, M29, M3; Bottom row from left to right: 774、 SSR124577、 SSRZAP25、 M327、
SSR124195; M: Marker; 1-2: Coffea canephora; 3-4: Coffea arabica.
图1 引物初筛结果
Fig 1 The first round screening of primers
624- -
第 4 期 王晓阳等： 利用SSR分子标记快速鉴别中粒种与小粒种咖啡
2.2 引物复筛
利用中、 小粒种咖啡样本各 20 个， 对初步筛
选出的 10 对 SSR 引物进行复筛， 最终筛选出中、
小粒种咖啡种间特异性 SSR引物 1对， 引物名称为：
SSR124195， 引物序列为： Forward primer(5′-3′)：
ATCCCCATCAGAAGACCTCA； Reverse primer(5′-3′)：
CCTCCACCGCCTGTTTATTA。 该引物在小粒种咖
啡样本中扩增出 90 bp和 110 bp双带产物， 而在中
粒种咖啡样本中只扩增出 90 bp或 100 bp的单带产
物（图 2）， 因此， 根据产物条带的数目即可对中粒种
和小粒种咖啡进行鉴别， 即双带为小粒种咖啡， 单带
为中粒种咖啡。 中、 小粒种咖啡样本及 SSR124195
对样本的扩增情况见表 2。
表2 引物SSR124195对中粒种、 小粒种咖啡各20个样本扩增结果
Table 2 Fragments amplified by SSR124195 on C. canphora and C. arabica samples
样本编号 所属种类 样本种质名称
检测结果
样本编号 所属种类 样本种质名称
检测结果
90 bp 100 bp 110 bp 90 bp 100 bp 110 bp
1 中粒种 24号 ＋ － － 21 小粒种 肯尼亚-1 ＋ － ＋
2 中粒种 24-2 － ＋ － 22 小粒种 巴西-2 ＋ － ＋
3 中粒种 24-10 ＋ － － 23 小粒种 台湾 ＋ － ＋
4 中粒种 24-11 ＋ － － 24 小粒种 墨西哥 ＋ － ＋
5 中粒种 26号 ＋ － － 25 小粒种 NY002 ＋ － ＋
6 中粒种 27号 ＋ － － 26 小粒种 CB52 ＋ － ＋
7 中粒种 兴28 ＋ － － 27 小粒种 蓬莱大杨 ＋ － ＋
8 中粒种 兴29 ＋ － － 28 小粒种 得热48-1 ＋ － ＋
9 中粒种 兴31 － ＋ － 29 小粒种 得热132 ＋ － ＋
10 中粒种 兴32 － ＋ － 30 小粒种 得热161 ＋ － ＋
11 中粒种 兴33 ＋ － － 31 小粒种 得热199-1 ＋ － ＋
12 中粒种 兴34 ＋ － － 32 小粒种 CCC24 ＋ － ＋
13 中粒种 大丰1号 － ＋ － 33 小粒种 云南贡山 ＋ － ＋
14 中粒种 大丰3号 ＋ － － 34 小粒种 SL28 ＋ － ＋
15 中粒种 大丰4号 ＋ － － 35 小粒种 SL34 ＋ － ＋
16 中粒种 越南1 ＋ － － 36 小粒种 S795 ＋ － ＋
17 中粒种 马来西亚-1 ＋ － － 37 小粒种 蓝山 ＋ － ＋
18 中粒种 巴布亚新几内亚 － ＋ － 38 小粒种 蓝山2号 ＋ － ＋
19 中粒种 泰国4-1 ＋ － － 39 小粒种 哥伦比亚 ＋ － ＋
20 中粒种 热经所中粒种 ＋ － － 40 小粒种 RUME SUDAN ＋ － ＋
说明： ‘+’ 有扩增产物； ‘-’ 无扩增产物。
Note: ‘+’ Having amplification products; ‘-’ Having no amplification products.
1～20； 中粒种； 21～40： 小粒种。
1-20： Coffea canephora; 21-40: Coffea arabica.
图2 引物SSR124195在中、 小粒种咖啡种间特异性扩增情况
Fig. 2 Species specific amplification products of C. canephora and C. arabica by SSR124195
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M
500
400
350
300
250
200
150
100
bp
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第 35 卷热 带 作 物 学 报
3 讨论与结论
分子标记技术因直接检测 DNA 分子水平上的
遗传差异， 不受人为及环境因素的影响， 相比其他
鉴别中、 小粒种咖啡的方法， 分子标记在检测精度
上具有非常明显的优势。 Spaniolas[25]等利用 PCR-
RFLP 技术对中、 小粒种咖啡进行了鉴别研究。 该
方法基于咖啡 trnL-trnF 基因中长度为 251 bp 的一
段序列， 该序列包含一限制性酶切位点， 能够被限
制性酶 Psul酶切成 92 和 159 bp 两个片段。 小粒种
在该酶切位点上存在 1 个 SNP， 因而不能被酶切，
电泳检测结果为 251 bp 一条条带， 而中粒种不存
在该 SNP， 电泳检测结果为 92 和 195 bp 两条条
带， 因此， 根据酶切后电泳检测结果能够很好地区
分中、 小粒种咖啡， 然而， 该方法因检测过程中需
要使用限制性酶酶切， 操作过程复杂且成本较高，
在使用上受到较大限制。 与前人的方法相比， 本研
究操作简便、 快速， 且重复性好、 鉴定结果准确可
靠， 具有较好的应用前景。
本研究筛选出的 SSR124195 引物为中粒种 、
小粒种咖啡的鉴别提供了一种有效途径， 如何保证
鉴别效果的准确性和稳定性是本研究最为关心的问
题， 这就要求引物筛选所采用的样本必须具有足够
的信息量和代表性。 本研究采用的中、 小粒种咖啡
样本均取自中国热带农业科学院香料饮料研究所、
云南省德宏热带农业科学研究所和云南省农业科学
院热带亚热带经济作物研究所三家国内最主要的咖
图3 引物SSR124195在中粒种上的验证结果
Fig. 3 Testing result of SSR124195 on Coffea canphora
500
400
350
300
250
200
150
100
bpM M M
2.3 种属鉴别验证
田间随机抽取中、 小粒种咖啡样本各 23 份，
利用 SSR124195 引物进行种属鉴别， 结果显示 ，
中粒种样本扩增条带全部为 90 bp或 100 bp 的单带
产物（图 3）， 小粒种全部为 90 bp 和 110 bp 的双带
产物（图 4）， 验证结果与实际结果一致。
500
400
350
300
250
200
150
100
bp
M M M
图4 引物SSR124195在小粒种上的验证结果
Fig.4 Testing result of SSR124195 on Coffea arabica
626- -
第 4 期
啡种质资源保存单位， 收集保存了国内外大部分咖
啡主栽品种及遗传资源， 样本具有足够的信息量和
广泛的代表性。 本研究引物筛选及鉴别验证所用样
本既包括了当前国内外咖啡主栽品种， 如小粒种的
卡帝莫 7963、 卡杜拉、 T5175、 T8667、 波邦、 铁
毕卡， 中粒种的 6号、 24号、 26号、 兴 28等， 这
增加了所筛选引物在咖啡商品贸易真伪及种子、 苗
木种属类别鉴别过程中的适用性； 同时也包括了不
同种源、 不同性状， 遗传差异显著的种质样本， 如
来自巴西、 哥伦比亚、 危地马拉、 墨西哥、 坦桑尼
亚、 厄瓜多尔、 巴布亚新几内亚、 哥斯达黎加、 夏
威夷、 澳大利亚、 肯尼亚等国家的不同种源及黄
果、 紫叶、 矮种等性状显著差异的样本， 提高了所
筛选引物的可靠性和稳定性。
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责任编辑： 沈德发
王晓阳等： 利用SSR分子标记快速鉴别中粒种与小粒种咖啡 627- -