全 文 ：2011 年 11 月
第 30 卷 第 11 期
绵阳师范学院学报
Journal of Mianyang Normal University
Nov．，2011
Vol． 30 No． 11
收稿日期:2011-06-20 回修日期:2011-09-05
作者简介:颜 亮(1983 －) ，助教，硕士，主要研究方向:分子生物学。
都支杜鹃 ISSR扩增条件的优化
颜 亮1，赵 凯2
(1． 皖南医学院药学系，安徽芜湖 241000;2． 安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆 246011)
摘 要:对珍稀濒危物种都支杜鹃的 ISSR扩增体系中的 Mg2 +浓度、dNTP 浓度、Taq 酶含量和底物含量进行
优化，并在优化后的基础上筛选出 8 条效果较好的引物，在梯度 PCR仪中设置温度梯度，找到这些引物的最佳退火
温度。优化结果表明，至少在一定的范围内底物浓度和 Taq酶含量对 PCR反应结果影响不大，相对而言，dNTP 浓
度和 Mg2 +浓度对反应结果的影响更加显著。优化后的 15 ul PCR反应体系中包括 20 ng模板 DNA、0． 3 μM引物、
1． 5 ul Buffer(Mg2 + free) ，0． 5 U Taq酶、1． 5 mM MgCl2 和 0． 1 mM dNTP。
关键词:都支杜鹃;ISSR;PCR扩增;条件优化
中图分类号:Q943 文献标识码:A 文章编号:1672-612x(2011)11-0087-04
0 前 言
都支杜鹃(Rhododendron shanii Fang)是我国杜鹃花科专家方文培先生逝世前发表的杜鹃属常绿杜鹃
亚属(Hymenanthes)新种［1］，目前分布范围仅限于安徽西部［2 － 3］。除了种质资源稀缺外，和常绿杜鹃亚属的
其他种一样，都支杜鹃也具备了叶片常绿、花大而艳丽、花簇多花等特征而具有很高的观赏价值，因而被安
徽省政府列为重点保护植物［4］。然而，目前为止仅有少量针对都支杜鹃分类地位［5］和叶片形态［6］方面的
研究，使得我们对该种的了解很少，也限制了对该种的保护和开发工作的开展。
现有研究表明，对一个物种遗传多样性的研究对其保护和起源进化而言是非常必要的［7 － 9］。由 Zietk-
iewicz等 1994 年提出的简单重复序列区间(ISSR，inter simple sequence repeat)分子标记技术［10］是目前较为
流行的遗传多样性研究手段之一［11 － 13］。相对于其他分子标记技术而言，ISSR分子标记技术具有较高的多
态性、可重复性以及操作简便性。由于 ISSR 技术也是基于 PCR 的一种分子技术，其结果易受模板 DNA、
Taq 酶、dNTP、引物以及 Mg2 +等反应物的浓度等因素的干扰，其中任何一个因子的改变都会导致扩增条带
弥散、消失及位置的改变，从而严重影响整个实验结果［14 － 16］，因此，在研究时都应先建立起合适的反应体
系并对其进行优化。本文通过对都支杜鹃 ISSR遗传多样性的 PCR扩增体系的研究并在此基础上完成 IS-
SR引物筛选，进而完成都支杜鹃 ISSR遗传多样性分析，从而对该种的分布现状、起源和进化等的机理进行
探究，并可为杜鹃属尤其是常绿杜鹃亚属其他种的 ISSR引物筛选提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料的采集与 DNA的提取
以一个山头为一个种群，共采集 5 个都支杜鹃自然种群，各种群采集地点自然概况(见表 1)。在每个
种群中尽量均匀地选择至少 20 棵成年植株，根据种群大小的不同，相邻两株间隔在 30 m以上。采集当年
生叶片，变色硅胶干燥，－ 4 ℃保存备用。
称取 0． 05 g干燥叶片，快速核酸提取仪(FastPrep FP120，BIO0101 公司)粉碎(反应条件为 4． 5 M，45
sec) ，高盐低 PH法提取基因组 DNA［17］。紫外分光光度计测定 DNA 含量，稀释至 100 ng /ul，－ 20 ℃保存
备用。
1． 2 实验处理
参考同属植物云锦杜鹃和鹿角杜鹃的 ISSR反应体系［14 － 15］预选出效果相对较好的一个引物(UBC825，
序列见表 2) ，随机选择 3 个种群各 1 个个体，制成混合模板，设置 dNTP、Mg2 +、Taq 酶以及模板量(稀释倍
DOI:10.16276/j.cnki.cn51-1670/g.2011.11.025
数)四个反应条件各 4 个梯度，分别为:dNTP的四个浓度梯度分别为 0． 1 mM、0． 2 mM、0． 3 mM和 0． 4 mM;
Mg2 +四个浓度梯度分别为 1． 0 mM、1． 5 mM、2． 0 mM 和 2． 5 mM;Taq 酶四个含量梯度分别为 0． 5 U、0． 75
U、1． 0 U和 1． 25 U;四个模板含量梯度分别为 10 ng、15 ng、20 ng和 40 ng。根据条带清晰程度确定反应体
系中各反应物的浓度或含量。
根据优化后的反应体系，用混合模板逐条筛选引物，选择条带清晰且重复性好的引物，在梯度 PCR 仪
中设置温度梯度选择各引物的最佳退火温度。ISSR 引物序列由加拿大哥伦比亚大学(University of British
Columbia)提供，上海生物技术有限公司合成。
表 1 各实验种群采集地点自然概况
Tab． 1 Natural information of sample sites of every populations
种群
polulation
地点
locality
经度
latitude
纬度
longitude
海拔
altitude
数量
number
鹞落坪(YLP) 岳西县包家乡都支尖 30o58． 10＇ 116o06． 16＇ 1650m 24
白马尖(BMJ) 霍山县胡家河镇白马尖 31o06． 53＇ 116o11． 59＇ 1755m 23
猪头尖(ZTJ) 霍山县太阳乡猪头尖 31o07． 22＇ 116o12． 01＇ 1567m 23
多云尖(DYJ) 霍山县胡家河镇多云尖 31o07． 44＇ 116o13． 10＇ 1693m 23
石壁沟(SBG) 岳西县河图镇石壁沟 30o57． 17＇ 116o04． 25＇ 1658m 21
1． 3 PCR扩增
PCR反应在 Bio － Rad iCycler PCR 仪中进行，PCR 反应试剂购于上海申能博彩生物技术公司，其中
DL2000Marker购于 Takara宝生生物工程大连有限公司。反应体系 15 ul，包括 2 ul模板 DNA(含量根据体
系优化结果而定)、2 ul引物(0． 3 μM)、1． 5 ulBuffer(Mg2 + free) ，Taq 酶、MgCl2 和 dNTP 加入量依据体系优
化结果而定，其余部分用 ddH2O补上。
PCR循环过程为:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，退火 45 s(不同引物退火温度见体系优化结果) ，
72 ℃延伸 90 s，35 cyclers，最后 72 ℃扩增 10 min。
PCR产物用含有 0． 1% EB和 2． 0%琼脂糖的凝胶电泳，电泳缓冲液为 0． 5 × TBE，以 DL2000Marker(共
6 个条带，从小到大依次为 100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp和 2000 bp)为分子量标记，在 5 V /cm稳
定电压条件下，电泳 3 － 4 h，凝胶成像系统(Bio － Rad Gel Doc XR)拍照。
图 1 反应体系优化结果
Fig． 1 Results of reaction
system optimization
2 结果
2． 1 反应体系的优化
dNTP浓度、Mg2 +浓度、Taq酶含量及模板 DNA含量 4 个反
应条件的优化结果见图 1。
图 1 中 1 － 4 分别对应 dNTP 浓度 0． 1、0． 2、0． 3 和 0． 4
mM;5 － 8 分别对应 Mg2 +浓度 1． 0、1． 5、2． 0 和 2． 5 mM;9 － 12
分别对应 Taq酶浓度 0． 5、0． 75、1． 0 和 1． 25 U;13 － 16 分别对
应模板 DNA含量 10、15、20 和 40 ng。从图中可以看出，dNTP
在 0． 1 mM 时拖尾严重，0． 2 mM 条带清楚但背景值不高，0． 4
mM时背景值较高但部分条带没有出现，折衷选择 0． 3 mM 为
最佳 dNTP反应浓度。同理选择 Mg2 +浓度 1． 5 mM。Taq酶浓度和模板 DNA含量与反应结果关系不大，为
操作方便本研究统一选择模板 DNA含量为 20 ng，为节约费用选择 Taq酶浓度为 0． 5 U。
2． 2 引物筛选
根据体系优化的结果，优化后的 15 ul PCR反应体系中包括有 20 ng 模板 DNA，18 pmol、1． 5 ul Buffer
(Mg2 + free) ，0． 5 U Taq酶，1． 5 mM MgCl2 和 0． 1 mM dNTP。依据此反应体系从 100 个引物中逐条筛选，最
后选择效果最好的 8 条引物在梯度 PCR仪中测试最佳退火温度，结果见表 2。
·88· 绵阳师范学院学报(自然科学版) 第 30 卷
表 2 ISSR引物和最佳退火温度
Tab． 2 ISSR primers and optimal annealing temperature
引物
primer
序列
sequence
退火温度
annealing temperature
条带数
No． Of bands scored
UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG 59． 5℃ 5
UBC816 CAC ACA CAC ACA CAC AT 55． 7 ℃ 7
UBC817 CAC ACA CAC ACA CAC AA 55． 7 ℃ 9
UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 55． 7 ℃ 11
UBC827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 55． 7 ℃ 8
UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 59． 5℃ 14
UBC856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 55． 7 ℃ 7
UBC874 CCC TCC CTC CCT CCC T 55． 7 ℃ 8
2． 3 反应结果
在反应体系和引物最佳退火温度都固定后对各种群的所有个体逐个进行 PCR反应，结果显示，所有个
体的 PCR结果均表现出条带清晰且条带不弥散、不模糊、重复性好的特征(图 2) ，这表明我们的反应体系
优化效果显著。
图 2 UBC840 引物 BMJ种群 ISSR扩增结果
Fig． 2 ISSR amplification result of BMJ population
with primer UBC840．
3 讨论
本文一共设置了 Mg2 + 浓度、Taq 酶含量、
dNTP浓度和模板含量四个因素的梯度，结果表
明，Mg2 +浓度和 dNTP 浓度对反应结果有较大影
响，而 Taq 酶含量和模板量对条带无显著影响。
参考他人研究结果，Mg2 +浓度和 dNTP 浓度对反
应结果都有较大影响，而 Taq 酶浓度和模板量对
条带的影响并非总是不明显［14 － 16］。
一般而言，dNTP 的浓度过低，分子碰撞的机
率低，偶然性大，会导致无扩增或扩增产物不稳定
或扩增出来的条带模糊不清;浓度过高，错误掺入
机率大大增加，导致特异性降低［18］，另一方面，dNTPs是反应中磷酸根的主要来源，其浓度取决于扩增片段
的长度，另外其浓度的任何变化都会影响到 Mg2 +的有效浓度［16］。因此，dNTP的浓度对反应结果必然存在
影响。然而，我们的研究结果却表明 dNTP的含量对反应结果影响不大，我们分析可能是因为都支杜鹃的
ISSR反应体系对 dNTP浓度有一个比较宽的适宜范围，而我们设置的 dNTP浓度梯度范围正好位于这个范
围之内。
模板 DNA量过大则容易导致错配，从而影响条带的背景值，过少则扩增不出清晰的条带［18］。郑道君
等对苦丁茶的 ISSR反应体系研究结果表明，模板浓度在一个很大的范围内(5 － 320 ng)反应结果一致［16］，
这与本文研究结果相符，都支杜鹃的 ISSR反应体系中模板浓度有一个较大的适应范围，至少我们设置的梯
度范围没有超越。
另外，大量研究表明，Mg2 +浓度和 Taq 酶含量对于 PCR反应体系的影响均非常显著［14 － 18］。Mg2 +不仅
影响 Taq酶活性，还能与反应体系中的 dNTP、引物及模板相结合，影响引物与模板的结合效率、产物特异性
及引物二聚体的形成。而 Taq酶的含量对反应体系的影响则是因为其用量受模板的质量、反应体积、酶活
性、酶的耐热性等多种因素的制约，若酶用量过少可能扩增不出条带，相反，酶用量过大时则可能出现非特
异性条带和弥散现象。这与本文的研究结果相符，Mg2 +浓度和 Taq 酶含量对于 PCR 反应体系的影响较为
敏感，也是决定反应结果好坏的关键条件之一。
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Optimization of ISSR Amplification Conditions for
Rhododendron Shanii
YAN Liang1，ZHAO Kai2
(1． Dept． of Pharmacy，Wannan Medical College，Wuhu，Anhui 241000;2． Sch． of Life Science，Anqing
Normal College，Anqing，Anhui 246011)
Abstract:Factors that affect ISSR PCR amplification，such as Mg2 + concentration，dNTP concentration，
were optimized by using the genomic DNA of a rare and endangered species Rhododendron shanii as material，on
the foundation of optimization，8 primers were selected． The optimal annealing temperature of every primer was
selected by using gradient PCR instrument． The optimized result indicates that at least in certain scope template
DNA dosage and Taq DNA polymerase affect little on the result of PCR reaction，relatively，Mg2 + concentration
and dNTP concentration have significant effects to the result． The suitable 15ul PCR reaction should contain 20ng
template DNA，0． 3μM primer，1． 5ul buffer (Mg2 + free) ，0． 5U Taq DNA polymerase，1． 5 mM MgCl2 and 0．
1 mM dNTP．
Key words:Rhododendron shanii;ISSR;PCR amplification;condition optimization
·09· 绵阳师范学院学报(自然科学版) 第 30 卷