全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2007,15 (2):354~355
*通讯作者。Authorforcorespondence.博士，研究员，主要从事植物分子生物学研究。E-mail:.
收稿日期：2006-03-31 接受日期：2006-05-25
·研究简报·
干旱胁迫下白花柽柳抑制性消减文库的构建与分析
蔡勤安 1,王玉成 2,董玉芝 3,邢少辰 1*,韦正乙 1
(1.吉林省农业科学院生物技术研究中心，公主岭136100；2.东北林业大学林学院，哈尔滨150040；3.新疆农业大学林学院，乌鲁木齐830052）
关键词：白花柽柳；干旱胁迫；抑制性消减文库（SSH）；表达序列标签（EST）
中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1006-1304(2007)02-0354-02
ConstructionandAnalysisofTamarixalbiflonumSuppression
SubtractiveHybridizationLibraryUnderDroughtStress
CAIQin-an1,WANGYu-cheng2,DONGYu-zhi3,XINGShao-chen1*,WEIZheng-yi1
（1.BiotechnologicalResearchCenter,JilinAcademyofAgriculturalSciences,Gongzhuling136100，China;2.SchoolofForest,NortheastForestry
University,Haerbin150040,China;3.SchoolofForest,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)
Keywords:Tamarixalbiflonum；droughtstress；suppressionsubtractivehybridization(SSH)library；expressedsequencetag(EST)
白花柽柳(TamarixalbiflonumM.T.Liu.)是一种耐旱性
的植物。本实验利用抑制性消减杂交技术（SSH）克隆了白花
柽柳多个抗旱相关基因的EST片段，并对这些EST片段进
行了分析。
1 材料和方法
1.1材料
由新疆吐鲁番沙生植物园提供白花柽柳 (Tamarixalbi-
flonumM.T.Liu.)插条，用25%PEG6000对苗木进行胁迫处
理，分别在1、3、6、12、24和36h取材，对照组培养在营养液
中，液氮速冻后-70℃冰箱保存。
1.2方法
按照SDS方法提取RNA。取少量电泳检测RNA的质
量，用紫外分光光度计定量。实验采用polyATtract!mRNA
（Promega公司）试剂盒分离系统分离mRNA。
SSH操作依照 CLONTECH试剂盒 PCR-SelectTMcD-
NASubtractionKit进行，以PEG处理为实验组，以正常培养
为对照组。
回收上述PCR产物连接到 pGEM!-TVector载体中，
连接产物转化到TOP10菌株中，在含有X-gal、IPTG和Amp
的LB固体培养基上37℃过夜培养，然后根据蓝白斑检测文
库克隆的重组率。随机挑取白色克隆，提取质粒DNA进行
PCR扩增，电泳检测插入片段长度。
用96孔深孔板培养重组菌落，采用碱裂解法提取质粒。
利用MegaBACE1000测序仪对DNA样品进行测序，选取
100bp以上的序列与GenBank比对，并将所得序列对NCBI
的Nr蛋白质数据库进行同源性检索。
2 结果和讨论
2.1 总RNA质量检测
电泳检测总RNA，可见明显的2条带，条带亮度比值约
为2∶1，表明所提取的RNA未出现降解，用紫外分光光度计
定量，OD260/OD280为1.9（图1）。
图1.总RNA电泳图
Fig.1.TotalRNAelectrophoresisofT.albiflonum
2.2 两轮PCR的结果分析
PCR结果（图2）显示，第一轮PCR扩增后的电泳带很弱
(泳道1～4)，第二轮PCR扩增后可看到电泳带明显(泳道5～
8)，片段大部分集中在200～2000bp之间。
第2期 蔡勤安等：干旱胁迫下白花柽柳抑制性消减文库的构建与分析
2.3 SSH文库的质量分析
提取质粒后进行PCR检测，蓝白斑检测显示文库的重
组率为95%，电泳结果表明片段大小在0.5kb左右（图3）。
图2.两轮PCR扩增检测
Fig.2.TheelectrophoresisofthefirstandthesecondPCRproducts
1～4,thefirstPCRproducts;5～8,thesecondPCRproducts;
M,DL2000marker.
图3.质粒PCR检测
Fig.3.ThePCRidentificationofreconstructedplasmids
1～6,thePCRresultofreconstructedplasmidsofthelengthabout500bp;
M,DL2000marker.
2.4 网上序列比对及EST序列同源性比较分析
根据每个EST可能的功能，本实验将100个EST分为
14个功能类别。
从图4可以看出，植物感受到逆境胁迫信号后立即激发
转录因子即反式作用因子，反式作用因子与顺式作用元件结
合后，激活RNA聚合酶Ⅱ转录复合物，从而启动基因的转录
表达，最后通过基因产物对外界信号做出适合的调节反应，
转录因子在基因的表达调控中起关键作用 (Storeyand
Thomson，1994)。所得的结果也说明了这一点，转录因子所
占的比率也是最大的。
在渗透胁迫下，柽柳产生了大量与信号传导、转录调控、
热激蛋白、离子转运、植物的渗透调节、信号传递、转录调控、
活性氧清除、蛋白代谢、跨膜转运和离子平衡及光合作用等
功能有关的基因，它们与柽柳的抗渗透能力调节紧密相关
(ChanderandRobertson,1994;KrishnamurthandRhagwat,
1989;Tsangetal.,1991)。此结果对今后进一步研究这些基因
的功能提供了基本资料。
参 考 文 献
ChanderPKandRobertsonM.Geneexpressionregulatedbyabscisic
acidanditsrelationtostresstolerance(J).MolecularBiology,
1994,45:113～119
KrishnamurthyRandBhagwatKA.Polyaminesasmodulatorsofsalt
toleranceinricecultivars(J).PlantPhysiology,1989,91:500～504
StoreyRandThomsonW W.Anx-raymicroanalysisstudyofthesalt
glandsandintracelularcalciumcrystalsofTamarix(J).Annalsof
Botany,1994,75:307～313
TsangEW,BowlerCandHerouartD.Diferentialregulationofsuper-
oxidedismutasesinplantsexposedtoenvironmentalstress(J).Plant
Cel,1991,3:783～792
图4.预测功能分类中所占比例100个EST
Fig.4.100ESTcakychartofforecastedfunction
1,渗调物质生物合成基因（1.379%）;2,光合作用(1.724%);3,活性氧清除剂
(1.034%);4,跨膜转运和离子平衡(1.724%);5,胁迫蛋白(2.758%);6,膜流动性
(0.344%);7,信号转导(3.44%);8,新陈代谢(2.758%);9,转录因子(9.655%);10,蛋
白合成(4.482%);11,细胞壁合成(1.034%);12,细胞骨架(0.689%);13,细胞分裂
(0.344%);14,蛋白代谢(3.103%)。
1,osmolytebiosynthesisgene(1.379%);2,photosynthesis(1.724%);3,reactive
oxygenscavengers(1.034%);4,transmembranetransportandionhomeostasis
(1.724%);5,stressprotein(2.758%);6,membranefluidity(0.344%);7,signaling
conduction(3.44%);8,metabolism(2.758%);9,transcriptionalregulators
(9.655%);10,proteinsynthesis(4.482%);11,celwalsynthesis(1.034%);12,
cytoskeleton(0.689%);13,celdivision(0.344%);14,proteinmetabolism
(3.103%).
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