全 文 ：植物遗传资源学报 2008, 9(4):453-457JournalofPlantGeneticResources
北京东灵山地区不同海拔柴胡居群的遗传多样性
黄　玮 1, 2 ,孙　平 1, 2 ,张文生 1, 2 ,孟繁蕴 1, 2 ,王永炎1, 2 ,冯成强 1, 2
(1中药资源保护与利用北京市重点实验室 ,北京　 100875;2北京师范大学资源学院中药资源与资源药物研究所 ,北京　100875)
　　摘要:利用 ISSR技术对北京东灵山地区不同海拔的 6个柴胡居群进行分析 , 观察不同海拔柴胡居群的遗传多样性。结果
表明 , 东灵山地区不同海拔柴胡居群的遗传多样性差异较大 , 海拔 1135m居群表现出较高的遗传变异水平 ,高海拔居群遗传
多样性较低;遗传距离与海拔差距有一定的相关性 , 相邻海拔的不同柴胡居群间具有相对较低的遗传距离;柴胡具有较强的
遗传分化趋势 , 且大部分变异存在于居群内。不同海拔导致的异质生境及基因流是影响柴胡居群遗传多样性的主要原因。
关键词:柴胡;遗传多样性;ISSR标记;东灵山;海拔;基因流
收稿日期:2008-03-12　　　　　修回日期:2008-06-02
基金项目:北京市教育委员会共建项目建设计划资助项目(SYS100270430);国家 “ 973”计划项目(2006CB504701)
作者简介:黄玮 ,江苏南通人 ,在读博士。主要从事中药材基础研究。 E-mail:oneway@ires.cn
通讯作者:冯成强 ,博士 ,高级工程师。主要从事道地药材研究。 Tel:010-62205282;E-mail:fengcq@ires.cn
GeneticDiversityofBupleurumchinenseDC.PopulationsfromDiferent
AltitudesinDonglingMountainDistrictinBeijing
HUANGWei1, 2 , SUNPing1, 2 , ZHANGWen-sheng1, 2 , MENGFan-yun1, 2 , WANGYong-yan1, 2 , FENGCheng-qiang1, 2
(1ProtectionandUtilizationofTraditionalChineseMedicineofBeijingAreaMajorLaboratory, Beijing100875;2 InstituteofNatural
MedicineandChineseMedicineResources, CollegeofResourceScience＆Technology, BeijingNormalUniversity, Beijing100875 )
　　Abstract:GeneticdiversityofBupleurumchinenseDC.populationsfromdiferentaltitudesinDonglingMoun-
taindistrictinBeijingwereconductedbyISSRtechnology.Thevaluesofgeneticdiversityindexes, Shannondiver-
sityindexes, hereditarydistance, geneticdiferentiationcoeficientandgeneflowwereobserved.Resultsshowed
thataltitudeafectedthegeneticdiversityofBupleurumchinenseDC.inDonglingMountaindistrict.Thepopulation
ataltitude1135mshowedhighergeneticvariation, whilelowergeneticdiversitywasobservedinpopulationsofhigh
altitude.Hereditarydistancesbetweendiferentpopulationswerecertainlycorelatedwithaltitudedistance, thatthe
valueofhereditarydistancesbetweennearaltitudepopulationswaslower.B.chinenseDC.haslargegeneticdifer-
entiation, whileamajorityofgeneticvariationwasexistedininnerpopulation.Divergenthabitatsandgeneflow
causedbydiferentaltitudesplayedimportantrolesingeneticdiversityofB.chinenseDC.population.
Keywords:BupleurumchinenseDC.;Geneticdiversity;ISSRmarker;DonglingMountain;Altitude;Geneflow
　　柴胡(BupleurumchinenseDC.)是我国传统大宗
中药材 ,中医常用于升阳解热 、疏肝开郁 、和解表里
之主药 。柴胡分布广泛 ,在我国除海南省以外均有
分布 ,主要集中在西南 、西北 、华北和东北地区 。由
于柴胡分布区域广泛 ,生态环境多样 ,长期的自然选
择使得柴胡自然居群间存在较大的分化。不同自然
居群柴胡在化学成分上存在较大差异 [ 1] ,这种不同
居群化学表型的多样性是柴胡遗传多样性的外在表
现 。然而我国野生柴胡资源遭受着大规模的非理性
采挖 ,道地产区柴胡分布范围日趋缩小 ,面临着优良
遗传资源退化的威胁。对道地产区柴胡居群遗传多
样性进行研究 ,可获得柴胡居群遗传变异和遗传分
化规律 ,揭示生态环境因素与遗传分化的相关联系 ,
从而为道地柴胡遗传资源有效保护和合理利用提供
理论依据 。
北京东灵山为太行山脉小五台山余脉 ,最高
海拔达 2303m。该地区历来被医家推崇为北柴胡
的道地产区而备受关注 。本文利用 ISSR技术着重
植　物　遗　传　资　源　学　报 9卷
研究北京东灵山地区不同海拔条件下柴胡遗传多
样性 ,探求生态环境变化对北柴胡遗传多样性的
影响 。
1　材料与方法
1.1　样地调查及材料采集
东灵山地区位于北京门头沟区的西部 , 北纬
39°48′～ 40°02′,东经 115°24′～ 115°36′,为暖温带
大陆性季风气候 [ 2-3] ,该区山地植被具有明显的垂
直地带性 ,自下而上依次为灌丛带 、落叶阔叶林带 、
亚高山草甸带及亚高山灌丛草甸带 [ 4] 。东灵山柴
胡主要分布在海拔 200 ～ 2000m范围内 ,除在亚高
山灌丛草甸带未有分布外 ,其他 3个不同植物带均
有柴胡的分布;不同海拔柴胡居群群落特征差异明
显 ,群落生境类型复杂。
本研究在广泛收集资料 、全面了解柴胡在北京
东灵山地区地理分布的基础上 ,按照居群取样原则 ,
选取北京东灵山海拔不同的 6个居群 ,每个居群选
15个样本为研究对象(表 1)。于 2005年 9月野外
采样 ,分单株取叶片置于塑封袋中 ,加硅胶快速干
燥。本研究所有样本由北京师范大学江源教授鉴定
为北柴胡(BupleurumchinenseDC.)。
表 1　采集样地及生境描述
Table1　Colectedsampleandhabitatsdescription
居群
Population
海拔(m)
Altitude
坡向
Slope
坡度
Grade
生境类型
Habitattypes
伴生植物
Companionspecies
土壤 pH值
SoilpH
H1 1900 东坡 35° 半阳坡草甸 以苔草 、小红菊为主 7.07
H2 1700 南偏东 10° 25° 阳坡林缘草甸 以小红菊 、蒙古蒿为主 5.89
H3 1135 南坡 10° 阳坡稀疏灌丛 以虎尾草 、丝柄苔草为主 7.08
H4 1050 西坡 35° 西坡山沟石缝处 以蒙古蒿、荆芥和菊科植物为主 7.02
H5 750 北偏东 25° 35° 阴坡灌丛 苔草 、土庄绣线菊 7.10
H6 350 北偏西 10° 20° 阴坡山脚下 ,灌丛 荆条 、白莲蒿、蚂蚱腿子和卷柏 7.01
1.2　DNA的提取与纯化
采用改良的 CTAB法提取 DNA[ 5] 。采用玻璃
粉纯化系统 (DPS)纯化部分含次生物质较多的总
DNA。所提取或纯化的供试模板 DNA用紫外分光
光度计测定 OD260和 OD280的值 ,计算其纯度及浓度 ,
并以 400ng/μlλDNA(华美公司)为参照 , 1%琼脂
糖凝胶电泳检测 DNA的浓度和质量;将样品浓度稀
释至 5ng/μl;-20℃保存备用 。
1.3　ISSR扩增
本研究选用加拿大 BritishColumbia大学提供
的 100条 ISSR引物试剂盒。挑选来自 2个居群的 4
个柴胡样品 ,用于引物筛选 。在 100条引物中选取
11条多态性较高的引物用于柴胡 ISSR-PCR扩增 ,
所选引物如表 2。
为获得清晰 、重复性的 ISSR扩增结果 ,对影响
ISSR-PCR的多个因素进行了比较 、优化 ,确定 ISSR-
PCR分析最适宜的 20μlPCR反应体系:1×Taq酶
配套缓冲液(10mmol/LTris· HClpH9.0, 50mmol/L
KCl, 0.1% TritonX-100), 0.6UTaqDNA聚合酶 ,
0.15μmol/L引 物 , 0.2mmol/L dNTP, 1.5 ～
2.0mmol/LMgCl2 , 10 ～ 20ng模板 DNA。 PCR反应
条件:94℃ 5min;94℃ 45s, 50 ～ 54℃ 45s, 72℃
1.5min, 37个循环;72℃ 7min。
表 2　用于 ISSR扩增的引物及退火温度
Table2　ISSRsequencesandannealingtemperatureused
inthisstudy
引物
Primer
引物序列(5′-3′)
Primersequence
退火温度(℃)
Tm
825 ACACACACACACACACT 50
836 AGAGAGAGAGAGAGAGA 52
840 GAGAGAGAGAGAGAGAT 51
843 CTCTCTCTCTCTCTCTA 51
846 CACACACACACACACART 51
849 GTGTGTGTGTGTGTGTYA 50
855 ACACACACACACACACYT 51
856 ACACACACACACACACYA 52
861 ACCACCACCACCACCACC 54
862 AGCAGCAGCAGCAGCAGC 54
868 GGAGGAGGAGGAGGAGGA 54
　　R=A/G;Y=C/T
以 GeneRulerTMl00bpDNALadderPlus为分
子量标记 ,用含有 0.1%EB的 1.5%琼脂糖凝胶电
泳检测扩增产物 ,用凝胶成像系统照相保存 。
1.4　数据分析
同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带视为具
有同源性 ,属于同一位点的产物 。按扩增阳性(记
为 1)和扩增阴性(记为 0)记录电泳带谱 ,建立数据
矩阵 。用 POPGENE1.31[ 6]进行遗传参数分析 ,包
括多态位点百分率 、Shannon′s多样性指数 、Nei′s遗
454
　4期 黄　玮等:北京东灵山地区不同海拔柴胡居群的遗传多样性
传多样性指数 、居群总遗传变异(Ht)、居群内的遗
传变异(HS)、遗传分化系数(GST)及基因流(Nm)。
用 POPGENE 1.31[ 6] 计算居群间 Nei无偏遗传
距离。
2　结果与分析
2.1　ISSR扩增结果与遗传多样性分析
利用优化的 ISSR-PCR扩增体系 ,用筛选的 11
条引物对东灵山地区 90个样品进行 PCR扩增 ,共
扩增出 158条重复性高 、清晰的条带 ,扩增片段分子
量为 300 ～ 2600bp,其中多态性条带为 138条 ,多态
性位点百分率为 87.50%(表 3)。部分引物 PCR扩
增结果如图 1。由此表明 ,柴胡不同居群间的 DNA
多态性很丰富 ,有较高的遗传差异性。
东灵山地区 6个不同海拔柴胡居群具有较高的
遗传变异水平 ,不同海拔各居群的多态位点百分率
具有较大差异 (表 4)。 Nei′s遗传多样性指数及
Shannon′s多样性指数显示与多态性位点百分率相
一致的结果 ,即以海拔 1135m居群(H3)显示出较
高的遗传变异水平 ,而高海拔 1900m居群(H1)遗
传变异水平相对较低 , 6个不同海拔柴胡居群在遗
传变异水平上的高低顺序为 H3 >H5>H4 >H6 >
H2>H1。以上结果显示 ,海拔影响着柴胡遗传多
样性水平 ,中低海拔地区柴胡居群具有较高的遗
传多样性 ,而高海拔地区柴胡居群遗传多样性水
平较低 。
图 1　引物 836、843、849、856、861及 868对部分柴胡材料的扩增结果
Fig.1　AmplificationresultsofpartialsamplesforBupleurumchinenseDC.
basedonISSRprimer836, 843, 849, 856, 861 and868
M:Marker;1 ～ 5:居群内的 5个柴胡样本 FivesamplesofBupleurumChinensefromcorespondingpopulation
455
植　物　遗　传　资　源　学　报 9卷
表 3　不同 ISSR引物扩增结果
Table3　Theamplificationofdifferentprimers
引物
Primer
位点数
No.ofloci
多态性位点数
No.of
polymorphousloci
多态性位点百分率(%)
Percentageof
polymorphousloci
825 15 13 86.67
836 14 12 85.71
840 14 14 100.00
843 16 12 75.00
846 13 10 76.72
849 17 16 94.11
855 13 13 100.00
856 15 12 80.00
861 15 13 86.67
862 12 11 91.67
868 14 12 85.71
总数 Total 158 138
平均 Average 14.4 12.5 87.50
表 4　ISSR分析柴胡居群遗传多样性
Table4　GeneticdiversityofBupleurumchinenseDC.pop-
ulationbasedonISSRanalysis
居群
Population
多态性位点
百分率(%)
Percentageof
polymorphousloci
Nei′s遗传
多样性指数
Nei′sgenetic
diversityindex
Shannon′s
多样性指数
Shannon′s
diversityindex
H1 29.80 0.1346 0.2465
H2 31.60 0.1421 0.2654
H3 41.30 0.1755 0.2964
H4 35.80 0.1589 0.2801
H5 39.50 0.1656 0.2893
H6 33.40 0.1501 0.2745
平均 Average 35.23 0.1545 0.2754
2.2　柴胡不同居群间的 Nei′s遗传距离
用 Nei′s方法估算各居群的遗传距离(表 5),可
知海拔影响着各居群间的遗传距离 ,其中 H1与 H6
的遗传距离最大 ,为 0.210。相邻海拔不同柴胡居
群间具有相对较小的遗传距离 ,表明海拔影响着柴
胡遗传分化 。高的海拔跨度扩大了不同海拔居群的
表 5　柴胡居群间 Nei′s遗传距离
Table5　Geneticdistancebetweendifferentpopulationsof
BupleurumchinenseDC.calculatedbyNei′sindex
居群
Population H1 H2 H3 H4 H5 H6
H1 0.000 0.056 0.125 0.149 0.155 0.210
H2 0.000 0.115 0.097 0.165 0.154
H3 0.000 0.102 0.125 0.132
H4 0.000 0.127 0.157
H5 0.000 0.185
H6 0.000
地理距离 ,影响着彼此居群间的遗传交流 ,因而表现
出较大的遗传距离 。最小的遗传距离出现在较高海
拔 1700m居群(H2)与高海拔 1900m居群(H1)间 ,
为 0.056,结合高海拔地区柴胡居群(H1与 H2)表
现出的遗传多样性规律(表 4),表明高海拔地区柴
胡居群间遗传基础渐趋同一 ,遗传一致度高 。
2.3　种群遗传分化及遗传结构
通过 Nei′s指数估算居群间的遗传分化系数 ,
得到居群间的遗传分化系数(GST)为 0.349,表明总
的遗传变异有 34.9%来自于居群间的分化 、65.1%
来自于居群内 ,这反映出 6个不同海拔柴胡居群间
的遗传多样性较低 ,居群内的分化较高 ,大部分变异
存在于居群内 。由 Gst计算出的居群间的基因流为
0.932,表明不同海拔柴胡居群间保持着基因流 ,由
此可以说明柴胡居群间有较小的遗传分化;但 6个
柴胡居群间的基因流仍小于 1,表明相对于其他物
种如樟子松 [ 7] 、珙桐[ 8]等 ,柴胡居群间仍存在着较
大的遗传变异 。
3　讨论
遗传多样性是生物所携带遗传信息的总和 ,是
居群生存 、发展和进化的基础 [ 9] 。遗传多样性最直
接的表达形式就是遗传变异的高低 [ 10-11] 。本研究
结果显示 ,东灵山地区 6个不同海拔柴胡居群具有
较高的遗传变异水平(表 4),不同海拔各居群内遗
传多样性具有较大差异 。海拔高度对柴胡群体遗传
有着一定的影响 ,中海拔柴胡居群的遗传变异水平
要高于低海拔居群 ,而高海拔柴胡居群遗传变异水
平最低 ,柴胡的遗传变异随着海拔高度的升高呈低
-高 -低的分布。这种有限地理范围内种群遗传变
异的产生来自于生境选择压力 [ 12-13] 。高海拔柴胡
居群所处的生境多为阳坡亚高山草甸 ,通风透光 ,相
对于其他类型生境更适合于柴胡的生长 ,而随着海
拔的升高 ,环境趋于极端 ,柴胡居群群落结构及种类
组成趋于单一 ,柴胡选择压力降低;相反 ,中低海拔
地区 ,柴胡居群所在生境类型多样 ,群落结构及种类
组成复杂 ,选择压力较大 ,因而也表现较高的遗传变
异水平。
遗传多样性除了能够表现出遗传变异的高低 ,
同时还包括了遗传变异分布格局 ,即居群的遗传结
构[ 10-11] 。居群遗传结构是指遗传多样性在居群内
和居群间的分布 ,即遗传分化 。Wright[ 14]指出遗传
分化系数(GST)大于 0.25表明居群遗传分化极大。
本研究中柴胡居群间有很强的遗传分化趋势 ,其部
456
　4期 黄　玮等:北京东灵山地区不同海拔柴胡居群的遗传多样性
分原因应归结为异质生境导致的地理隔离和由于生
态破坏导致的基因流等因素。大量证据表明在一个
连续的居群内遗传分化将很少发生 ,但在较小地理
范围内异质生境确实可以造成某些植物居群的遗传
分化[ 15-17] 。东灵山山地垂直地带性明显 ,不同海拔
植被差异显著 ,柴胡居群群落生境类型多样(表 1)。
而相比于异质生境 ,基因流更能影响柴胡的遗传分
化 。陈小勇等[ 18]指出在小地理范围内即使不存在
明显的微生境差异 ,限制的基因流也能导致遗传分
化 。异质居群导致遗传分化的根本原因也在于基因
交流的不畅 。Wright[ 19]以 1作为评价基因流高低的
临界点 ,认为基因流大于 1能发挥其均质化的作用 ,
而小于 1则说明基因流成为遗传分化的主要原因 。
由此可知基因流是不同海拔柴胡居群间遗传分化的
主要原因。这种基因流导致柴胡遗传分化的机制在
于不同海拔的水热差异显著 ,致使不同海拔居群生
育期有所差别 ,生育期的不重叠限制了外部花粉
(基因)的迁入。本研究中柴胡居群间基因流为
0.932,表明柴胡居群间仍存在着一定的基因交流 ,
较高的基因流降低了居群间的遗传分化 ,因而表现
出较低的遗传多样性;至于柴胡居群的遗传分化更
多地存在于居群内 ,笔者认为可能与柴胡的种子结
实及萌发特性有关。柴胡种子小 ,萌发率低 ,陈年种
子多已丧失活力 [ 20] ,野生柴胡又多为顶端开花的有
限型花序 、花量少 [ 21] ,种子发育不同步 ,后期种子发
育不完全或不能正常成熟 [ 22] ,上述特性决定了柴胡
种子定居萌发成新个体能力弱 、个体萌发整齐性差 、
个体差异显著 ,致使居群内柴胡个体发育不一 、基因
交流困难。
遗传相似性系数或遗传距离是衡量居群间遗传
分化程度的重要指标 。本研究中柴胡各居群的遗传
距离变化幅度较大 ,表明各居群遗传分化的程度不
同 。海拔相近的居群遗传距离小 ,海拔相差大的遗
传距离大 ,由此可知遗传距离与海拔高度有一定相
关性。海拔差距对柴胡遗传距离的影响 ,初步说明
了海拔对基因交流存在一定的阻碍作用;而海拔相
近的居群遗传距离较小 ,可能是小地区内生境类型
基本一致 ,自然选择压力也趋于一致的缘故 , H1居
群与 H2居群生境类型接近 ,遗传距离相近便是一
例 。海拔差距的存在 ,阻碍了不同居群基因交流 、扩
大了物种居群间遗传距离的现象不只是柴胡的个
案 ,前人亦在马尾松 [ 13] 、华山新麦草[ 17] 、枫香 [ 23] 、红
松[ 24]等上有所报道。
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