全 文 ：第 35 卷 第 1 期
2014 年 1 月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
Journal of Inner Mongolia Agricultural University
Vol． 35 No． 1
Jan． 2014
基于 ISSＲ标记的珍稀濒危植物
内蒙古半日花(Helianthemum ordosicum)
遗传多样性和遗传结构研究
*
魏 磊1， 白沙如拉1， 厐 磊1， 乌兰巴特尔1，
包会嘎2， 史树德1*
(1． 内蒙古农业大学 农学院，呼和浩特 010019;2． 乌海市野生动植物保护中心，乌海 016000)
摘要: 采用 ISSＲ(Inter － simple sequence repeat)分子标记对内蒙古半日花(Helianthemum ordosicum)自然居群的遗
传多样性和遗传结构进行了分析。20 个多态性引物在 4 个居群(412 个体)中共检测到 246 条带(211 条具多态性)，
多态位点比率为 86． 3%。在居群水平上，Nei’s 基因多样性和 Shannon’s 信息指数分别为 0． 247 和 0． 318;在物种水
平上分别为 0． 306 和 0． 461。基因分化系数 Gst为 0． 432，基因流 Nm 值为 0． 658。分子方差(AMOVA)分析显示总的
遗传变异中有 46． 67%的遗传变异存在于居群间。居群间聚类分析表明:千里沟与桌子山居群遗传距离最小，其次
为与棋盘井居群，最远为与阿尔巴斯居群，Mantel 检测表明半日花遗传距离与地理距离无相关性。本研究结果表明
半日花居群间和居群内具有较丰富的遗传多样性，为今后有效保护半日花种质资源提供了理论依据。
关键词: 半日花; ISSＲ 标记; 遗传多样性; 遗传结构; 西鄂尔多斯
中图分类号: Ｒ282 文献标识码: A 文章编号:1009 － 3575(2014)01 － 0030 － 07
GENETIC DIVEＲSITY AND POPULATION STＲUCTUＲE OF
(Helianthemum ordosicum)(Cistaceae )IN WEAT OＲDOS＇S
NATIONAL NATUＲE ＲESEＲVE ＲEVEALED BY ISSＲ MAＲKEＲS
WEI Lei1， Baisharula1， PANG Lei1， Wulanbater1， BAO Hui － ga2， SHI Shu － de1*
(1． College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Huohhot 010019，China;
2． Wuhai Wildlife Conservation Center，Wuhai 016000，China)
Abstract: The genetic diversity and population structure of 4 (Helianthemum ordosicum)populations we analyzed in west Ordos na-
tional nature reserve of Inner Mongolia using the ISSＲ markers． The results were as follows:Twenty Polymorphic ISSＲ primers ampli-
fied 246 DNA fragments，of which 211 (86． 3%)showed polymorphisms among the populations． The percentage of polymorphic bands
at the population level was 83． 1% ． Nei’s and Shannon’s information index were 0． 247 and 0． 318，respectively，at the population
level，both index were 0． 306 and 0． 461，respectively，at the species level． Moreover，the Analysis of Molecular Variance (AMOVA)
showed that 46． 67% of the total genetic diversity was among populations． Ｒelatively lower gene flow (Nm = 0． 658)might be one of
important factors influencing the genetic structure of the species． Based on the genetic distance，Neighbor － joining cluster analysis
shows that the Mt． Zhuozi and Qianligou populations grouped together firstly，and then clustered with Qipanjing populations，which
were clustered finally with Aerbasi population，Mantel test showed that there was no correlation between genetic and geographic dis-
tances． The present analysis reveals that H． ordosicum has high genetic diversity and high genetic differentiation，and provides a theo-
retical basis for the future effective protection of H． ordosicum germplasm．
Key words: Helianthemum ordosicum;ISSＲ marker;genetic diversity;genetic stcurcture;west ordos
* 收稿日期: 2013 － 08 － 30
基金项目: 国家自然科学基金(31060048)
作者简介: 魏磊(1979 －)，男，实验师，主要从事园艺植物生理与分子生物学研究．
* 通讯作者: E － mail:Lycoris@ imau． edu． cn
半日花(Helianthemum soongoricum，Cistaceae)
是半日花科的一种半灌木或灌木，全世界约有 8 属
200 种，多分布于地中海沿岸。中国内蒙古、新疆有
2 种分布，分别是新疆半日花和内蒙古半日花［1］，为
古地中海孑遗植物，也是国家二级保护植物［2］。
内蒙古半日花(H． ordosicum)仅分布在内蒙古
乌海市和鄂尔多斯市的鄂托克旗境内，在这两个地
区内半日花常与四合木和刺旋花等作为荒漠植物群
落的建群种或优势种，对维持草原化荒漠区脆弱的
生态系统具有重要作用。此外，内蒙古半日花对于
研究内蒙古荒漠植物区系的起源以及与地中海植物
区系的联系有重要的科学价值，所以加强对珍稀濒
危植物内蒙古半日花的研究和保护具有重要意
义［1］。
遗传多样性是生物物种在进化过程中积累起来
的遗传变异，是生物多样性的基础和最重要的成分，
是生物进化的基础，遗传多样性的丧失将对物种生
存带来不利影响［3］。对濒危植物遗传多样性研究不
仅能了解物种的进化历史以及导致物种稀有或濒危
的机制，而且关系到能否采取科学有效的措施来保
护濒危物种 ［4 － 5］，因此了解和掌握濒危植物的遗传
多样性和遗传结构是制定科学保护措施的重要基
础。
近年来，关于内蒙古半日花遗传多样性研究仅
见曹瑞等基于等位酶(7 个居群，30 个样品)和高婷
婷 AFLP 分析(30 个样品)的研究［6 － 7］，未见内蒙古
半日花大尺度的遗传多样性和遗传结构分析和评
价，而通过全面系统的对珍稀濒危植物遗传多样性
和遗传结构进行分析和评价，从而获得居群遗传多
样性与遗传变异分布等方面的重要基础数据，是实
现物种的有效管理和制定合理有效的保护对策的重
要前提［8］。简单重复序列间多态性标记(inter － sim-
ple sequence repeat，ISSＲ)由于具有较好稳定性、可
重复性、通用性(不需要预先获知物种基因组序列信
息)和价格低廉的特点，广泛应用于遗传多样性和遗
传结构、系统进化和遗传资源评价方面［9 － 10］。
因此，本文以珍稀濒危孑遗植物内蒙古半日花
为研究对象，通过广泛而有代表性的样品采集，采用
ISSＲ分子标记技术，对内蒙古半日花居群的遗传变
异进行分析，揭示其遗传多样性水平和遗传结构，为
有效保护半日花遗传资源提供科学依据。
1 材料和方法
1． 1 材料
2009 － 2010 年多次对西鄂尔多斯国家自然保护
区内及周边半日花资源进行调查，在查明居群分布
和大小基础上，进行居群随机取样，视居群大小，相
邻取样植株间隔距离至少 10 ～ 50m，各居群取 50 ～
200 株不等的个体新鲜叶片，用变色硅胶快速干燥保
存带回实验室进行遗传多样性分析。所取样本包括
了内蒙古分布的全部半日花主要自然居群，本文实
验材料及其来源详见表 1。
1． 2 DNA提取
所有材料 DNA 采用 Qiagen 公司 DNeasy Plant
Mini Kit(No． 69104)试剂盒进行提取，1． 0%的琼脂
糖电泳检测 DNA质量，DNA的纯度和浓度通过紫外
吸收法测定。
表 1 半日花居群取样情况
Tab． 1 Sampling localities and samples of H． ordosicum populations
居群 经度 纬度 海拔 /m 采样数
Population Longitude Latitude Altitude Number of samples
棋盘井(核心保护区) 107°11E 39°22N 1220 168
千里山(沟) 106°48E 39°52N 1030 119
阿尔巴斯 107°12E 39°30N 1100 58
桌子山 106°57E 39°20N 1200 67
1． 3 ISSＲ反应条件及程序
从 100 个 ISSＲ引物(加拿大 British Columbia 大
学，编号 UBC 801 － 900)中筛选 PCＲ 扩增结果重复
性好、多态性高的 20 条引物进行试验(表 2)。
ISSＲ － PCＲ 扩增反应为:25μl PCＲ 反应液内
含:模板 DNA 约 30 ng，2U Tag 酶，1． 5 mmol /L
MgCl2，4 种 dNTP各 0． 25 mmol /L，0． 2μmol /L 引物，
2%甲酞胺。同时，以蒸馏水为模板，设空白对照实
验。PCＲ扩增条件:94℃预变性 5min，然后进行 45
个循环:94 ℃变性 1 min，52℃复性 45s，72℃延伸 2
min，循环结束后 72℃保温 5 min。PCＲ 产物在含有
EB的 2． 0% 琼脂糖凝胶中电泳，以 100 bp Marker
(北京鼎国昌盛，NMW002)作标准分子量对照，Bio
－ rad GelDoc XＲ 成像仪照相，条带读取由成像仪自
13第 1 期 魏 磊等:基于 ISSＲ标记的珍稀濒危植物内蒙古半日花((Helianthemum ordosicum)遗传多样性和遗传结构研究
动读取(辅以人工校正)。
1． 4 数据统计与分析
将 ISSＲ电泳图谱中的每一条带均视为一个分
子标记，有带的记为“1”，无带的记为“0”。统计时
只统计那些重复性好，条带清晰的扩增条带(100 ～
2000bp)。用 POPGENE 1． 32 软件计算各居群的多
态位点即多态位点百分率(PPB)、Nei’s 遗传多样
性指数(H)、Shannon 多样性指数(I)、遗传分化系数
(Gst)、有效等位基因数(Ne)、基因流(Nm)、总基因
多样性(Ht)和居群内基因多样性(Hs)［11］。用 NT-
sys 2． 1 统计分析软按 Nei ＆ Li (1979)的方法计算
遗传相似系数(Gs)和遗传距离(D)［12］。用 Arlequin
3． 0 软件进行群体间分子方差分析(AMOVA)［13］。
用 MEGA5 软件的邻接法(NJ)构建居群间聚类
图［14］。采用 ZT软件进行 Mantel检测［15］。
表 2 ISSＲ 引物及其扩增结果
Tab． 2 ISSＲ primers and the amplification results
引物 引物序列 总条带数 多态性条带数 多态性比率(%)
Primer Sequence of primer Total bands Polymorphic bands
Percentage of
polymorphic bands
UBC 812 (GA)8A 13 10 76． 9
UBC 818 (CA)8G 8 8 100． 0
UBC 823 (TC)8C 10 6 60． 0
UBC 825 (AC)8T 10 7 70． 0
UBC 835 (AG)8YC 14 13 92． 9
UBC 838 (TA)8ＲC 13 13 100． 0
UBC 841 (GA)8YC 18 16 88． 9
UBC 843 (CT)8ＲA 17 13 76． 5
UBC 847 (CA)8ＲC 12 11 91． 7
UBC 848 (CA)8ＲG 9 9 100． 0
UBC 850 (GT)8YC 16 13 81． 3
UBC 853 (TC)8ＲT 15 10 66． 7
UBC 855 (AC)8YT 10 8 80． 0
UBC 857 (AC)8YG 12 9 75． 0
UBC 862 (AGC)6 13 12 92． 3
UBC 866 (CTC)6 11 11 100． 0
UBC 867 (GGC)6 17 16 94． 1
UBC 874 (CCCT)4 11 10 90． 9
UBC 877 (TGCA)4 8 8 100． 0
UBC 881 (GGGTG)3 9 8 88． 9
总计 Total 246 211
平均 Average 12． 3 10． 6 86． 3
2 结果与分析
2． 1 遗传多样性分析
以筛选的 20 条引物对所有 4 个居群 412 个个
体进行 ISSＲ － PCＲ 扩增，部分居群个体的扩增结果
见图 1。研究结果表明，20 条 ISSＲ 引物共检测到
246 个位点，平均每条引物扩增 6 ～ 16 个位点，平均
每条引物检测到 12． 3 个位点，其中多态位点 211
个;多态位点百分率为 86． 3%(表 2)。在居群水平
上，半日花各居群多态位点百分率在 72． 1% ～
94． 3%之间、平均为 83． 1%(表 3);表明不同居群多
态位点百分率不同，棋盘井半日花核心保护区多态
性最高，为 94． 3%，桌子山地区半日花居群多态位点
百分率最低为 72． 1%;居群水平的 Nei’s 基因多样
性指数(He)与 Shannon 多态性信息指数(I)分析结
果趋势一致，二者平均值分别为 0． 247 和 0． 318，平
均每个位点的有效等位基因数 Ne = 1． 196，揭示出多
样性最高的是棋盘井居群，其次是千里沟居群，第三
是阿尔巴斯居群，最低是桌子山居群，表明西鄂尔多
斯自然保护区内半日花居群具有丰富的遗传多样
性。在物种水平上，Ne，h 和 I 值分别为 1． 375，
0． 306 和 0． 461。总体上，内蒙古西鄂尔多斯自然保
护区的半日花居群具有较高的遗传多样性水平。
23 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报 2014 年
图 1 ISSＲ 引物 843(A)、867(B)对内蒙古千里沟居群(A)和内蒙古棋盘井居群(B)部分个体的扩增图谱。M为 100bp DNA Marker。
Fig． 1 Amplification of QianLiGou(A)and QiPanJing (B)Populations by ISSＲ 843(A)and 867(B)primer． M． 100bp DNA Marker．
表 3 半日花居群的遗传多样性
Tab． 3 Genetic diversity for H． ordosicum populations
居群
Populations
多态位点数
Polymorphic loci
多态位点百分率 /%
The percentage of
polymorphic loci(P)
Nei＇s指数
Nei＇s gene
diversity(H)
Shannon＇s指数
Shannon＇s
information index (I)
棋盘井 86 94． 3 0． 282 0． 461
千里山(沟) 59 84． 9 0． 274 0． 335
阿尔巴斯 41 80． 9 0． 243 0． 263
桌子山 25 72． 1 0． 187 0． 212
平均 Average 52． 8 83． 1 0． 247 0． 318
2． 2 居群遗传结构分析
用 POPGENE 软件在假设遗传平衡时，计算出半
日花总的居群基因多样性 Ht = 0． 304，居群内遗传多
样性 Hs = 0． 173，居群间基因间分化度(Gst)为
0． 4320，即表明总的遗传变异中有 43． 20%的变异存
在居群间，居群每代迁移数是测定基因流的一种方
法，用于反映各居群间、居群内的遗传分化程度。测
得基因流 Nm = 0． 658，揭示鄂尔多斯半日花居群间
基因流动较小，说明半日花居群间缺乏有效的基因
交流，居群间存在较大的遗传分化，遗传变异主要存
在于居群内部。居群遗传分化的分子方差分析
(AMOVA)显示半日花居群间遗传变异占总遗传变
异的 46． 67%(Φst = 0． 467，P ＜ 0． 001)(表 4) ，这
表明鄂尔多斯地区半日花的遗传变异主要存在于居
群内 (53． 33%)，但居群间的变异也处于较高水平。
与 POPGENE 软件分析结果基本一致。
表 4 内蒙古半日花 4 个居群遗传变异的 AMOVA 分析
Tab． 4 AMOVA analysis among the four populations of H． ordosicum
变异来源
Source of
variance
自由度
Degree of
freedom
离差平方和
Sum of square
deviation
均方
Mean square
变异组分
Variance
component
变异百分率
Percentage of
variation (%)
P值
Pvalue
居群间 3 3499． 1 166． 3 136． 5 46． 67 ＜ 0． 001
Among populations
居群内 402 3551． 5 155． 9 155． 9 53． 33 ＜ 0． 001
Within populations
33第 1 期 魏 磊等:基于 ISSＲ标记的珍稀濒危植物内蒙古半日花((Helianthemum ordosicum)遗传多样性和遗传结构研究
2． 3 聚类分析
基于 Nei’s遗传距离(表 5)，采用 MEGA5． 0 软
件中邻接法(NJ)构建居群间聚类图如图 1 所示。NJ
树聚类分析显示，地处保护区中心的千里沟居群与
位于保护区边缘的桌子山居群首先聚成一支，之后
再与棋盘井居群聚合，最后与距保护区较远的阿尔
巴斯居群聚合。NJ树聚类分析表明，千里沟居群与
棋盘井居群虽然地理空间距离最近，但地理距离较
远的桌子山居群却与千里沟居群最先聚合，表现出
较近的遗传距离，同样的，阿尔巴斯居群距桌子山居
群地理距离较近，却与棋盘井居群有较近的遗传距
离，这说明半日花各居群遗传分化与其地理距离之
间没有直接的相关性，经 Mantel 检测［15］，半日花 4
个居群间的遗传距离与地理距离之间无相关性(r =
－ 0． 13，P ＞ 0． 1)。
表 5 半日花 4 个居群间的遗传距离(左下角)和地理距离(右上角，单位:公里)
Tab． 5 Nei＇s Genetic distances index(below diagonal)and geographical distance among populations
(above diagonal)among four populations of H． ordosicum
居群名称
Populations
棋盘井 千里沟(山) 阿尔巴斯 桌子山
棋盘井 1 17 29 43
千里沟(山) 0． 2865 1 12 38
阿尔巴斯 0． 2389 0． 1703 1 16
桌子山 0． 2418 0． 1901 0． 1096 1
图 2 基于 Nei’s 遗传距离的半日花 4个居群的 NJ 聚类图
Fig． 2 Neighbor － joining tree based on Nei’s genetic distance of the four H． ordosicum populations
3 讨论
3． 1 遗传多样性
居群是进化的基本单元，而遗传多样性是居群
生存和进化的基础;物种的遗传多样性越高，其环境
适应能力就越强，这一点对于濒危物种尤为重要［5］。
Ge等采用 ISSＲ标记研究了西鄂尔多斯自然保护区
内濒危植物四合木(Tetraena mongolica Maxim．)的遗
传多样性和遗传结构，发现四合木种水平上具有中
等水平的遗传多样性(Hsp = 0． 324)，推测西鄂尔多
斯地区可能是该物种第四纪冰期避难所，在居群水
平上四合木遗传多样性较低且居群间遗传分化较低
(Gst = 0． 1691)，居群间基因流交流(Nm = 1． 223)较
强［16］。半日花与四合木同为西鄂尔多斯自然保护
区内的濒危孑遗植物，二者在千里沟和阿尔巴斯地
区常互为伴生种，本研究发现在居群和物种水平，所
揭示半日花的遗传多样性水平高于 Ge 等对同域分
布的四合木研究结果，但低于四合木 ＲAPD 分析结
果和蒙古扁桃 ISSＲ 分析结果［17 － 18］。此外，有研究
表明分布在青海、新疆和内蒙古西部的珍稀濒危植
物多具有较高的遗传多样性水平［19 － 21］，Mattner 等
研究濒危植物(Hemigenia exilis，Lamiaceae)和葛永
奇等研究银杏遗传多样性中发现，处于濒危状态的
物种也会保持着较高的遗传多样性［22 － 23］，本文结果
与这些研究基本一致。Nybom 统计了 ＲAPD、AFLP
和 ISSＲ 等分子标记检测多种植物居群水平遗传多
样性的结果［24］，总结出这些植物的遗传多样性平均
值为 Hpop = 0． 22 ± 0． 08，居群水平上，本研究揭示
的半日花遗传多样性 (P = 83． 1% ，H = 0． 274，I =
0． 318 )高于 Nybom的统计结果。物种的遗传多样
性水平与其生活型及其繁育系统密切相关，鄂尔多
斯半日花具有较高的遗传多样性可能与其多年生习
性和复杂的繁育系统有关(兼性异交，有性繁殖，不
能进行无融合生殖以及风媒、虫媒传粉。)［7］。
3． 2 居群遗传结构
居群遗传结构是指遗传多样性在群内和群间的
分布，是一个物种最基本的特征之一，受生境片断
43 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报 2014 年
化、居群分离、繁育系统、基因流等多因素的影响
［25］。Bussell 总结 35 个物种的 ＲAPD 研究结果发
现，29 个远交物种的居群间变异在总的遗传变异中
占 0． 9% ～ 41． 3%，而 6 个近交物种则为 4． 8% ～
66． 9%［26］。Hogbin和 Peakall 认为异交物种的遗传
变异主要分布在居群内，而居群间的遗传变异通常
在 27%以下［27］。本研究揭示的半日花居群间遗传
变异范围(46． 67%变异存在于居群间，53． 33%的遗
传变异存在于居群内)与 Bussell、Hogbin 和 Peakall
的研究大体一致，揭示半日花繁育系统为兼性异交
为主，这与高婷婷［7］研究结果一致。
影响居群遗传结构的因素除繁育系统外，基因
流也是一个重要因素 ［28］。在群体遗传学理论中，
Wright以基因流 Nm 的临界点为判别标准［29］，不管
居群大小，只要基因流 Nm 大于或等于 1 时，就可以
防止由遗传漂变引起的居群间遗传分化。本研究
中，半日花的基因流 Nm =0． 658，说明半日花群体间
基因流较弱，因此，遗传漂变可能是影响半日花群间
分化的因素之一。
NJ法聚类分析(图 1)和 Mantel 检测表明，半日
花 4 个居群间的遗传距离与地理距离之间无相关性
(r = － 0． 13，P ＞ 0． 1)，即在一定空间尺度内居群间
的遗传距离与地理距离关系不大，这可能主要是由
于生境片断化的“随机取样”效应所致［30］。本研究
野外调查发现生境片断化可能是造成这种不相关性
的原因之一，调查结果同时也佐证了半日花居群间
基因交流有限(Nm = 0． 658)，使得居群间遗传差异
很难通过有效基因流来平衡。
4 结论
本研究首次在广泛取样基础上，采用 ISSＲ 分子
标记对内蒙古分布的半日花遗传多样性和遗传结构
进行分析，结果表明:所筛选的 ISSＲ 引物在对所有
样本分析中均具有较好的重复性和多态性，揭示了
内蒙古半日花居群具有较高的遗传多样性(Ht =
0． 304，Hs = 0． 173;)和遗传变异(Gst = 0． 432，Φst =
0． 467);在基因组序列信息未知的情况下，ISSＲ 标
记用于分析半日花遗传多样性和遗传变异具有简
单、实用和可靠性;本研究结果为半日花的保护和利
用奠定了初步的基础。
本研究也揭示出内蒙古半日花 53． 3%以上遗传
变异存在于居群内，而居群间遗传变异也较高
(46． 7%)，总的居群遗传多样性较高(Ht = 0． 304，
Hs = 0． 173)，因此首先应该做好各居群的就地保护
工作。野外调查发现棋盘井和千里沟居群是内蒙古
半日花现存的两个最大居群，目前仅棋盘井地区建
立了半日花核心保护区，根据本研究结果，千里沟居
群也具有较高的遗传多样性，因此应将千里沟居群
划入棋盘井核心保护区进行共同保护。阿尔巴斯和
桌子山居群遗传多样性较低，野外调查发现生境片
断化可能是濒危的重要因素之一，因此除了就地保
护外，还应该进行迁地保护，并应尽可能取足够多样
本，以尽可能完整的保存在其原生境的遗传多样性
和遗传结构。由于内蒙古半日花居群间基因交流较
弱(Nm =0． 658)，因此应该增加各居群内和居群间
的基因交流，可以通过增加传粉媒介等来提高结实
率，使半日花在群落中渐渐形成优势种，更好的保护
其的遗传多样性。
参 考 文 献:
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