全 文 ：第 32 卷 第 3 期
2013 年 6 月
大 豆 科 学
SOYBEAN SCIENCE
Vol． 32 No． 3
Jun． 2013
福建湄洲岛烟豆(G． tabacina)遗传多样性分析
陈丽丽1，刘晓冬2，赵洪锟2，袁翠平2，王英男2，许明子1，王玉民2
(1．延边大学 农学院，吉林 延吉 133000;2．吉林省农业科学院 农业生物技术研究所，吉林 长春 130033)
摘 要:采用 20 个 ISSR标记对来自福建湄洲岛的 40 份烟豆(G． tabacina)材料进行了遗传多样性分析以促进烟豆资
源的保护开发和利用。结果表明:20 个 ISSR引物对 40 份烟豆基因组 DNA均可进行有效扩增，共扩增出 240 条谱带，
其中多态性谱带 229 条，多态性比率为 95． 4%;20 个 ISSR引物的多态性信息含量为 0． 03 ～ 0． 37，平均为 0． 27;40 份
烟豆材料之间的 Dice相似系数为 0． 335 6 ～ 0． 863 9，平均为 0． 675 3，说明湄洲岛烟豆材料遗传变异较丰富;聚类分析
将 40 份烟豆材料划分为 4 个类群，每个类群都包括来源于不同采集地点的材料，说明不同采集地点之间的材料存在
基因交流。
关键词:ISSR标记;烟豆;遗传多样性
中图分类号:S565． 1 文献标识码:A 文章编号:1000-9841(2013)03-0286-05
收稿日期:2013-03-22
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201003021) ;农业部野生资源保护与利用项目;吉林省现代农作物种业发展专项资金项目。
第一作者简介:陈丽丽(1988-) ，女，硕士，主要从事大豆分子生物学研究。
通讯作者:许明子(1957-) ，女，教授，主要从事植物遗传育种研究。E-mail:xumz@ ybu． edu． cn。
王玉民(1968-) ，男，研究员，主要从事野生大豆种质资源及其利用研究。E-mail:wangym@ cjaas． com。
Genetic Diversity of G． tabacina from Meizhou Island of Fujian Province
CHEN Li-li1，LIU Xiao-dong2，ZHAO Hong-kun2，YUAN Cui-ping2，WANG Ying-nan2，XU Ming-zi1，WANG Yu-min2
(1． College of Agronomy，Yanbian University，Yanji 133000，China;2． Biotechnology Research Institute，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Chang-
chun 130033，China)
Abstract:In this study，the genetic diversity of 40 accessions of G． tabacina，collected from Meizhou Island of Fujian province
were analyzed using 20 ISSR markers to promote the protection，exploration and utilization of G． tabacina． A total of 240 bands
were amplified，of which 229 bands，accounting for 95． 4%，were polymorphic． The average polymorphism information content
(PIC)of 20 ISSR primers was 0． 27，ranging from 0． 03 to 0． 37． The Dice similarity coefficient of the tested accessions ranged
from 0． 335 6 to 0． 863 9，and averaged 0． 675 3． The tested G． tabacina were clustered into four groups by using the unweight-
ed pair-group method with arithmetic averaging(UPGMA) ，and each group contained one or more accessions from different col-
lection sites． Results suggest there is rich of genetic diversity among the accessions of G． tabacina，and existing gene exchange
among G． tabacina accessions from different collection sites．
Key words:ISSR marker;G． tabacina;Genetic diversity
多年生野生大豆是大豆遗传改良的第三基因
库［1］，目前已发现 26 个种［2］。烟豆(Glycine tabaci-
na Benth．)是其中之一，产于中国福建(湄洲岛、东
山岛)和广东，生长在海边岛屿的山坡或荒坡草地
上，在澳大利亚、琉球群岛和南太平洋群岛至斐济
亦有分布［3］。烟豆具有抗病、耐旱和耐热等优势，
在拓宽栽培大豆遗传基础方面具有潜在的应用价
值［4］。关于湄洲岛烟豆种群的研究，钱吉等［5］应用
RAPD标记技术对湄洲岛和平潭岛上的 4 个烟豆小
群体进行了生态遗传学研究，发现在种群间地理距
离较大时，遗传分化与地理距离有一定的相关性，
在小范围内则无明显相关性。
ISSR标记技术是由 Zietkiewicz 等［6］于 1994 年
提出的，是在 SSR(simple sequence repeat，简单重复
序列)基础上创建、基于 PCR 扩增的一种分子标记
技术。即在 SSR序列的 3端或 5端加上 1 ～ 4 个随
机核苷酸，在 PCR 反应中，锚定引物可以引起特定
位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重
复序列间的 DNA片段进行 PCR 扩增，所扩增的 in-
ter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳
或琼脂糖凝胶电泳得以分辨。ISSR 分子标记技术
可以广泛用于生物的遗传多样性、系统发育、基因
标记、遗传图谱构建和生物进化等研究领域［7］。在
大豆上，任小俊等［8］应用 ISSR 标记对灰布支黑豆
与晋豆 23 的 F3群体进行研究，表明该群体内有较
丰富的遗传变异。谢甫绨等［9］采用 ISSR 标记对不
同来源大豆品种(系)进行了研究，结果表明 ISSR
标记能很好地区分不同来源的大豆品种(系)。金
燕等［10］利用 ISSR 标记研究野大豆居群内遗传变
异，并明确了野生大豆居群的取样策略。
本研究利用 ISSR标记对湄洲岛 40 份烟豆材料
进行遗传多样性分析，旨在明确湄洲岛不同采集地
3 期 陈丽丽等:福建湄洲岛烟豆(G． tabacina)遗传多样性分析 287
点烟豆材料在分子水平的遗传变异，为湄洲岛烟豆
资源的保护、开发和利用提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
共 40 份烟豆材料(表 1) ，由吉林省农业科学院
农业生物技术研究所提供。
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA提取 试验材料于 2012 年 10 月种植
于温室，待幼苗生长至 2 片三出复叶时取 1 片三出
复叶用于 DNA提取。DNA提取采用天根生化科技
(北京)有限公司提供的快捷性植物基因组 DNA 提
取系统进行。
表 1 40 份烟豆材料样品编号及采集地点
Table 1 Accessions and collection sites of 40 G． tabacina
编号
No． of accessions
采集地点
Collection site
编号
No． of accessions
采集地点
Collection site
编号
No． of accessions
采集地点
Collection site
编号
No． of accessions
采集地点
Collection site
MZY001 莆田码头 MZY011 黄金海滩 MZY021 黄金海滩 MZY031 鹅尾山
MZY002 湄洲码头 MZY012 黄金海滩 MZY022 黄金海滩 MZY032 鹅尾山
MZY003 湄洲码头 MZY013 黄金海滩 MZY023 黄金海滩 MZY033 鹅尾山
MZY004 湄洲码头 MZY014 黄金海滩 MZY024 黄金海滩 MZY034 鹅尾山
MZY005 湄洲码头 MZY015 黄金海滩 MZY025 黄金海滩 MZY035 鹅尾山
MZY006 湄洲码头 MZY016 黄金海滩 MZY026 黄金海滩 MZY036 鹅尾山
MZY007 金海岸 MZY017 黄金海滩 MZY027 黄金海滩 MZY037 鹅尾山
MZY008 黄金海滩 MZY018 黄金海滩 MZY028 黄金海滩 MZY038 妈祖庙
MZY009 黄金海滩 MZY019 黄金海滩 MZY029 黄金海滩 MZY039 妈祖庙
MZY010 黄金海滩 MZY020 黄金海滩 MZY030 黄金海滩 MZY040 妈祖庙
1． 2． 2 ISSR扩增 ISSR引物参照加拿大哥伦比亚
大学(UBC)2006 年公布的序列，由北京鼎国昌盛生
物技术有限责任公司合成。 ISSR 反应体系为
25 μL，其中，Premix溶液(编号为 D335A，由宝生物
工程(大连)有限公司提供)12． 5 μL，40 ng DNA
2 μL，10 pmol·μL －1引物 2 μL，灭菌双蒸水 9． 5 μL。
ISSR 反应程序:94℃预变性 5 min，94℃45 s，55℃
45 s，72℃1 min，36 个循环，72℃10 min。
1． 2． 3 电泳检测 用 1 × TAE溶液配制 2． 0%琼脂
糖，待胶溶解后，稍微冷却，再往胶中加入溴化乙锭
(终浓度为 5 μg·mL －1) ，倒入制胶板上，冷却凝固后
置于装有 1 × TAE 溶液的电泳槽中。取 ISSR 扩增
产物 5 μL与 10 ×上样缓冲液 2 μL混匀后上样，稳
压 130 V 电泳 2． 5 h，采用 Bio-Rad DOC 2000 凝胶
成像系统拍照记录电泳结果。
1． 3 数据分析
ISSR扩增结果稳定，电泳图谱中一个谱带均可
看作一个位点，仅记录清晰稳定重复出现的条带。
根据各条带的迁移率及其有无统计得到所有位点
的二元数据，有带记为“1”，无带记为“0”。多态性
信息含量(polymorphism information content，PIC)参
照 Anderson的方法［11］计算。采用 FreeTree 软件［12］
计算材料的 Nei 氏遗传相似系数矩阵，按类平均法
(unweighted pair group method using arithmetic avera-
ges，UPGMA)进行聚类分析，采用 1 000 次重抽样对
聚类结果进行自举检验值(bootstrap)进行分析。利
用 TreeView 1． 6． 6［13］绘制 40 份材料的亲缘关系树
状图。
2 结果与分析
2． 1 20 个 ISSR引物扩增结果
从 100 条 UBC引物中选取 20 条引物(表 2)对
40 份烟豆基因组 DNA 进行扩增分析，它们均可扩
增出清晰、稳定且重复性好的谱带(图 1)。20 条引
物对 40 份烟豆基因组 DNA 进行有效扩增，扩增谱
带在 3条(UBC815)到 18 条(UBC864)之间，平均为
12． 05条;多态性谱带为 2 ～ 18 条，平均为 11． 55 条;
多态性比率为 66． 7% ～100%，平均为 94． 10%;20 个
ISSR引物共扩增 240 条谱带，其中多态性谱带 229
条，多态性比率高达 95． 42%;20 个 ISSR引物多态性
信息含量为 0． 03 ～0． 37，平均为 0． 27(表 2)。
图 1 引物 UBC811 对 40 份烟豆
基因组 DNA扩增结果
Fig． 1 ISSR fingerprints of the 40 G． tabacina
accessions generated by primer UBC811
288 大 豆 科 学 3 期
表 2 20 个 ISSR引物对扩增结果统计
Table 2 Summery of the amplification results of 20 ISSR primers
编号
No．
引物名称
Primer code
引物序列(5-3)
Primer sequence
扩增带数
No． of amplified
bands
多态性带数
No． of polymorphic
bands
多态性比例
Percentage of
polymorphic bands /%
多态性信息含量
PIC
1 UBC807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 17 17 100． 0 0． 31
2 UBC808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 11 10 90． 9 0． 26
3 UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 10 8 80． 0 0． 22
4 UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 11 10 90． 9 0． 26
5 UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG 3 2 66． 7 0． 03
6 UBC816 CAC ACA CAC ACA CAC AT 16 16 100． 0 0． 30
7 UBC822 TCT CTC TCT CTC TCT CA 16 15 93． 8 0． 29
8 UBC823 TCT CTC TCT CTC TCT CC 13 13 100． 0 0． 33
9 UBC824 TCT CTC TCT CTC TCT CG 6 6 100． 0 0． 31
10 UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 11 11 100． 0 0． 37
11 UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 9 7 77． 8 0． 22
12 UBC827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 13 13 100． 0 0． 19
13 UBC829 TGT GTG TGT GTG TGT GC 15 15 100． 0 0． 33
14 UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 14 13 92． 9 0． 18
15 UBC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART 9 8 88． 9 0． 18
16 UBC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 12 12 100． 0 0． 26
17 UBC857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 13 13 100． 0 0． 33
18 UBC864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG 18 18 100． 0 0． 37
19 UBC890 VHV GTG TGT GTG TGT GT 9 9 100． 0 0． 31
20 UBC900 ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA 15 15 100． 0 0． 31
合计 Total 240 229 95． 42
平均 Average 12． 05 11． 55 94． 10 0． 27
R =(A，G) ，Y =(C，T) ，H =(A，C，T) (i． e． not G) ，V =(A，C，G) (i． e． not T)
2． 2 40 份烟豆材料的相似性系数
利用 FreeTree软件计算得出的相似性系数矩阵
表(略) ，40 份烟豆材料间的相似性系数为0． 335 6～
0． 863 9，总体平均相似性系数为 0． 675 3。M003 与
M021 的相似性系数最低，为 0． 3356，表明这两份材
料差异最大，其中 M003 取自湄洲码头，M021 取自
黄金海滩。M034 和 M035 相似性系数最高，数值为
0． 863 9，表明这两份材料差异最小，M034、M035 均
取自鹅尾山(表 3)。
表 3 不同采集地点材料之间的遗传相似系数
Table 3 Dice coefficient among G． tabacina accessions from different collection sites
采集地点
Collection site
平均相似性系数
Average similarity
相似性系数范围
Range of similarity
材料数
No． of accessions
莆田码头 － － 1
湄洲码头 0． 6738 0． 5616 ～ 0． 8505 5
金海岸 － － 1
黄金海滩 0． 7021 0． 5446 ～ 0． 8597 23
鹅尾山 0． 7832 0． 6906 ～ 0． 8639 7
妈祖庙 0． 7772 0． 7525 ～ 0． 8177 3
总计 Total 0． 6753 0． 3356 ～ 0． 8639 40
3 期 陈丽丽等:福建湄洲岛烟豆(G． tabacina)遗传多样性分析 289
2． 3 40 份烟豆材料聚类分析
利用 FreeTree 软件计算出 40 份烟豆材料的
Dice遗传相似系数矩阵，按类平均法进行聚类分
析，并采用 1 000 次重抽样对聚类结果进行 bootstrap
分析，采用 Tree View 1． 6． 6绘制 40 份材料的亲缘关
系树状图(图 4)。结果表明，40 份烟豆材料可以分
为 4 个类群。类群Ⅰ包括 17 份材料，其中有 3 份材
料来源于湄洲码头，1 份材料来源于金海岸，10 份材
料来源于黄金海滩，3 份材料来源于妈祖庙;类群Ⅱ
包括 11 份材料，其中有 4 份材料(M027 ～ M030)来
源于黄金海滩，7份材料(M031 ～M037)来源于鹅尾
山;类群Ⅲ包括 9 份材料(M018 ～ M026) ，全部来源
于黄金海滩;类群Ⅳ包括 3 份材料，其中 1 份材料
(M001)来源于莆田码头，2 份材料(M002 和 M003)
来源于湄洲码头。除类群Ⅲ外，其他类群都包括来
源于不同采集地点的材料，聚类结果与材料地理位
置并不存在明显的相关关系，说明不同采集地点之间
的材料存在基因交流。对聚类结果进行 bootstrap 分
析表明，整个聚类结果的自举检验值为 5%～ 100%，
其中类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的自举检验值分别为 5%～ 76%、
10%～77%、25%～86%和 98%～100%。
图 1 40 份烟豆材料基于 Dice相似系数的 UPGMA聚类图
Fig． 1 UPGMA dendrogram of 40 G． tabacina accessions based on Dice coefficient
290 大 豆 科 学 3 期
3 讨 论
本研究采用 20 条 ISSR 引物对湄洲岛 40 份烟
豆进行遗传多样性分析，共扩增 240 条谱带，其中多
态性谱带 229 条，多态性比率高达 95． 42%。说明
ISSR标记可以有效地用于烟豆遗传多样性研究。
钱吉等［5］对湄洲岛和平潭岛上的烟豆 4 个小种群
的 RAPD研究结果多态性比例为 1． 0，与本研究结
果相近。40 份烟豆材料间的 Dice 相似性系数变幅
为 0． 335 6 ～ 0． 863 9，说明湄洲岛烟豆种群具有较
大的遗传变异。聚类分析结果显示并不是来自相
同采集地点的材料总是聚在一起，说明不同采集地
点之间的材料存在基因交流。这与王天菊等［14］对
花生进行 ISSR分析结果显示样品聚类和地域没有
明显的关系相一致;而与孙晓环等［15］对龙井原位保
护区野生大豆进行 SSR 分析结果显示原位保护区
野生大豆和地理位置存在一定相关性不同。自举
检验值(基于 1 000 重抽样)被用来估计聚类结果的
可靠性。本研究聚类结果的自举检验值范围为
5%～ 100%，远低于 Chang 等［16］ 的自举检验值
(64%～100%) ，说明一些聚类节点可靠性较低。
大豆起源于中国，一年生野生大豆是栽培大豆的
近缘野生种。到 2010年底国家种质库已累计保存野
生大豆资源收集品 8 518 份［17］。近年来国家对野生
大豆资源保护工作非常重视，先后在全国范围内建立
了 30多个野生大豆原位保护区。多年生野生大豆主
要分布于大洋洲的澳大利亚和南太平洋的一些岛屿
上，只有烟豆(G． tabacina)和多毛豆(G． tomentella)向
北延伸到中国南部，分布在北纬 25°左右我国东南沿
海地区及岛屿上。我国多年生野生大豆的考察搜集
工作相对滞后，在国家种质资源库中只有很少几份，
多年生野生大豆原位保护工作尚未开展，因此应加大
多年生野生大豆资源考察和收集工作，在多年生野生
大豆集中分布区域建立原位保护区;同时应加强多年
生野生大豆基础研究工作，挖掘其中的优异基因，使
其在大豆遗传改良中发挥作用。
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