全 文 ：西北林学院学报 2侧抖 , 29 (4 ) : 35 一 3 7
Jou nr al Of N
o rt h w e s t Foer
o t yr U n iv e sr i ty
毛豹皮樟的叶片 D N A 提取及其 R A P D 引物筛选
巩艳红 , 刘 军 , 张
(四川农业大学 林学园艺学院 , 四川
健 , 冯茂松
雅安 6 2 5 0 14 )
摘 要 : 以毛豹皮律叶片为材料 , 对其 DNA 提取方法和 R AP D 引物的筛选进行了研究 。 结果表明 ,采用改良 S D S 法从毛豹皮律的老 、 幼叶片中都能提取到高质量的 D NA , 可以用于 R AP D
分析 ;从 4 组随机引物 中筛选 出了 16 个显示毛豹皮择遗传差异的多态性引物 。
关键词 :毛豹皮律 ;叶片 ; DN A 提取 ; RA PD 引物 筛选
中图分类号 :妙49 . 74 7 . 5 文献标识码 : A 文章编号 : 10 卜7 4 61 ( 2仪碎 )04 加35 仍
DN A E x t ar e t i o n a n d R A P D irP m
e r S e er e n in g i n 跳 a v e s o f L i l s ea co ear an v ar . la n ug iosan
G O N G aY
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e m e ht o d o f ios la t i n g ge n o m i e DN A a n d RA PD p ir m e r s e re e n i n g o f w e re s tu d i e d
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4 脚 u p s ot s h o w m u e h h ihg e r 罗 n e ti e d iv e r s i t y o f L . co er a an v ar . l a n iug osn e .
K e y wo 川 s : L i o ea co ear n a v a r . la n u g 忍n os e ; l e af ; D N A i so l a t i n g ; R A P D p ir m e r s e er e n i n g
毛豹皮樟 仪￡岛 ea co ear an va r . la n林g 孟OIZ ` a ) , 又
称老鹰茶 ,属樟科木姜子属植物 ,俗称白茶 。 它主要
分布于浙江 、安徽 、河南 、江苏 、福建 、 江西 、 湖北 、 广
东 、广西 、 云南 、贵州 、 四川 、 重庆等市区川 。 毛豹皮
樟富含矿物质元素以及各种功能性活性成分 ,是一
种用途广泛的树种川 。 但是目前对毛豹皮樟的研
究还仅限于扦擂繁殖 、驯化栽培技术等方面 ,这对于
毛豹皮樟这一野生资源的进一步开发利用还远远不
够川 。 现有的毛豹皮樟野生资源种类繁多 、性状混
杂 、 良落不齐 ,仅靠传统的形态特征很难识别 , 巫需
采用有效的方法进行种质资源 的鉴定和分类工作 ,
以选育优质高产的品种 。 本试验以毛豹皮樟叶片为
材料 ,研究了毛豹皮樟基因组 DNA 的提取和 RAP D
引物筛选 ,为从 D N A 多态性角度直接揭示毛豹皮樟
的遗传多样性奠定了基础 。
1 材料与方法
1
.
1 试验材料
试验材料毛豹皮樟取自于四川省雅安市雨城区
中里镇 (海拔 s o m ) , 其中包括来自中里镇本地以
及从重庆 、达县 、 石棉 、名山等地移植的毛豹皮樟 。
取其叶片后 ,用无菌保鲜膜包装 ,在液氮中速冻 10
s , 立即贮于 一 80 ℃超低温冰箱中保存备用 。
1
.
2 基因组总 DN A 的提取
lX() m L 提取液配方 : 1 mo l/ L irT s HC I ( p H S . 0 )
10m L
,
0
.
5 m ol/ L E D T A 10m L
,
5 m o l/ L N aC 1
2 m L
,
2 0% SD S 10 m L
,
PV P 0
.
3%
,定容至 10 m L 。
取液氮冷冻的毛豹皮樟叶片组织 ,在液氮冷冻
下迅速研磨成粉末 ;将粉末放人 50 m L离心管中 , 然
后加入 巧 m L C T A B 提取缓冲液 ;用力振动 , 至管底
无沉淀叶粉为止 , 迅速将离心管置于 65 ℃水浴中 l
h
,水浴过程中温和地混匀几次 ;取出离心管 ,每管加
人 14/ 体积的 KA c , 再加人等体积的抓仿 : 异戊醇
(抖 : l )溶液 ,混匀后 , 离心 , 8 以刃 r/ m i n , 15 m in ; 取
出离心管冰浴 20 m in ;将上清液移人另一离心管中 ,
重复离心 l 次 ;取上清液于另一离心管中 ,加人 0 . 6
倍体积的异丙醇 , 轻轻混匀 , 4 ℃ 冰箱中静置 20
m in ;用钩针钩出 D NA (如不能钩出 , 则在 12 《X又) r/
收稿日期 : 2 0() 3一 12 切作者简介 :巩艳红 ( 19 8 0 一 ) ,女 , 山西 长治人 ,硕士 , 毕业于四川农业大学林学园艺学院 ,现于四川农业大学学报编辑部从事编校 L:作 。
西北林学院学报 19卷
m in 下离心 5 m in ) ,再用 7 0 % 乙醇冲洗 2 一 3 次 , 每
次 2 0 一 30 m in , 然后晾干 ; 加人适量 1 x ET 溶解
DN A (在 一 20 ℃ 冰箱中 ) 。
1
.
3 RA P D 引物筛选方法
试验所用的 3 组 RA P D 随机引物均由 O eP or n
公司生产 , 扩增反应在 PC R 型扩增仪上进行 , 其余
试剂均购自华美生物工程公司 。 总反应体积为 20
林L : DN A 4 卜L , 引物 4 林 L , T a q 酶 0 . 3 林L , d NT p s
O
·
4 林L , 10 x CP R Z 林 L
,
M g C 1
2
2 卜L ;扩增程序 : 94 ℃
预变性 1 m i n , 94 ℃变性 1 m i n , 34℃复性 一m i n , 7 2℃
延伸 2 m in ,共科 个循环 , 72 ℃延伸 or m in 。
1
.
4 CP R 产物的检验
RA PD 产物用 1% 的琼脂糖凝胶 电泳分离 , E B
染色后用凝胶成像系统分析 。
SD S 法所用试剂设备较为普通 , 一般常规实验室均
可用 ,这就为分子生物学实验方法的普及提供了借
鉴 。 图 1 表明采用改良 S DS 法时 ,样品的 DN A 带纹
非常清晰 ,无拖尾现象 ,因此样品损伤程度也极小 。
2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 1 3
2 结果与分析
2
.
1 毛豹皮樟 D N A 的质最
用改良 S DS 法提取毛豹皮樟叶片的 D N A 所得
量较多 ,提取出的 DN A 均呈无色透明状 , 说明酚类
物质 和 蛋 白质 等 已 被 除 净。 经检 测 , 所 得 的
DN A O
.
D
. 值都在 1 . 80 一 2 . 0 0( ) 之间 , 说明用此法
提取的 D N A 纯度高 ,经凝胶电泳检测 , 全部模板均
未降解 , 说明模板的完整性好 , 这就有效解决 了
RA PD 技术所需的高质量的模板问题 。 同时 , 改良
图 1 改良 S仍 法凝胶成像分析系统检测结果 (加 R N A 醉 )
f’i g . 1 hT e . 名. 心eS gel a n目y o i , ~ d
e匕二 in ed
2
,
2 毛豹皮樟 R AP D 引物筛选结果
本试验从 o p e o n 公司的 Op B 、 Op G 、 o p R 、 OP Q
4 组引物中筛选出 16 个多态性较好 、谱带清晰的引
物 ( 图 2 一 图 5 ) ,经过检测 ,成功地得到了多态性资
料 。
RA P D 扩增所得谱带数随引物不同而异 , 不同
引物在全部供试材料中产生不同分子量的扩增谱带
数 。 随机引物扩增出的不同分子量的条带数在 6 -
18 条之间 ,共扩增出 190 个标记 , 品种间相同的标
记有 89 个 ,多态性标记有 101 个 , 多态性标记占
第 4期 巩艳红 等 毛豹皮樟的叶片 DN A 提取及其 AR DP 引物筛选
图 4 引物 OGP 一 18 对毛豹皮棒不同模板 DN A 的扩增结果
F ig
.
4 以 p D am p l i6 e d 6 n罗印 ri n招 ( p rim e r: O PG 一 18 )
、. J工` es1
2
rL r. L
, .卫,J,J
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r`. L
4 6
.
8%
。 同一引物在不同的试验材料中具有不同的
扩增谱带数 , 扩增谱带数变异在 6 一 18 条之间 。 多
数引物在所有供试材料中均有相同的带 , 相同的谱
带数从 3 一 8 条不等 ,这些谱带反映了毛豹皮樟基因
组 D N A 的保守序列 ,说明毛豹皮樟供试材料间存在
一定的同源性 。 在所筛选出的引物中没有一个引物
对 2 0 个材料的扩增同时具有多态性 ,均只具有部分
多态性 ,也没有一个引物在 20 个供试材料中的扩增
产物完全相同。 毛豹皮樟的这些多态性反映了试验
材料之间在 D N A 序列上存在着相当大的差异 ,表明
毛豹皮樟种质资源 比较丰富 , 同时也说明了 R AP D
技术可以用于毛豹皮樟种质资源鉴定研究 。
表 1 16 个引物的序列及其扩增结果
’
I’ab le 1 T h e 泌 ir e , fO 16 Pir m e伟 a : l d th e er s u l t of a m pli 6 ca t i o n
引物号 扩增潜带数 多态性潜带数 多态性百分数 /%
O P It
一
3 1 1 5 45
.
5
O P I丈一 1 14 7 5 0 . 0
O P It 4 6 2 33
.
3
O P I毛一 7 4 55 . 6
O PG 4 18 11 6】. 1
0 代 j一 13 7 54 . 0
O PG
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11 14 7 50
.
0
0 洲 j 一 14 8 3 37 . 5
O PC
一
15 12 5 4 1
.
7
O PG
一
16 10 3 3 0
.
0
O P G
一
17 15 8 5 3
.
3
O PC
一
18 1 8 10 3 3
.
3
O P (二一19 16 8 5 0 . 0
O P B一 10 3 3 0 . 0
O P B4 10 6 6 0
.
0
O P I弓一 19 8 4 5 0 . 0
3 讨论
R AP D 技术需要的模板 D N A 量极少 ( 巧 一 25
n g )
、 引物随机 、无放射性 、实验设备相对简单 、所用
费用较低 , 已经应用于医学 、生物学研究的各个领
域 , 如 : 品种鉴定 、基因定位 、 系谱分析等 。 RA P D 能
否成功的一个核心问题是能否有效地解决 RA PD 的
稳定性 。 由于 RA PD 对反应体系以及外界条件的变
化非常敏感 , 因此在整个反应过程中首先要保证模
板 DN A 的质量 ,然后要在条件高度一致的情况下对
反应体系和扩增程序进行反复多次的摸索 , 以使扩
增的结果可靠 。 另外 ,许多资料认为 RA PD 的重复
性较差 ,就本试验而言 , 如果能够严格控制实验条件
(包括 :使用同一扩增仪器 、 同一人进行操作 、 电泳
条件稳定等 )则试验的重复性是很好的 。
参考文献 :
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