全 文 ：　文章编号:0559-7234(2000)04-0464-05
药用植物石防风与柴胡不对称体
细胞杂交的初步研究
霍丽云　向凤宁　夏光敏
(山东大学生命科学学院 ,山东 济南 250100)
摘要:经狭叶柴胡悬浮细胞系分离的原生质体用强度为 260 μW/cm 2 紫外线照
射 0 ,1 ,2 ,3 m in后 ,与石防风原生质体在 PEG 诱导下融合.对融合再生的 56个
单细胞克隆进行杂种形态学 、染色体 、同功酶分析表明 ,其中的 34个为体细胞杂
种细胞系.5个杂种愈伤组织(不对称融合产物)在培养 12个月时再生出完整小
植株.
关键词:石防风;红柴胡;紫外线照射;不对称体细胞杂交;再生植株
中图分类号:Q943　　　文献标识码:A
近年来 ,植物的体细胞杂交由于供体和受体不对称融合方法的应用 ,增加了成功的机
会 ,可望实现部分核基因或胞质基因的转移 ,达到改良物种的目的.[ 1]狭叶柴胡(Bupleu-
rum scorzoneri fol ium Willd ,又称红柴胡)系伞形科(Umbelli ferae)多年生草本植物 ,其
性微寒 、味苦.有解毒 、镇痛 、抗肝损伤等作用 ,是临床治疗感冒 、疟疾等症的常用药材.石
防风(Peucedanum terebinthaceum Fisch)亦是伞形科草本植物 ,在分类上与狭叶柴胡同
科异属 ,其性温 、味辛.能发表 、祛风 ,是治疗风湿性关节炎 ,偏头痛 、皮肤搔痒等症的优良
药材.[ 2]利用原生质体融合技术 ,可将决定药用植物有效成分的基因在不同科属种间相互
转移 ,达到改良中药材的目的.有关伞形科植物石防风和狭叶柴胡的属间原生质体融合未
见报道.
1　材料与方法
1.1　石防风与柴胡原生质体制备
狭叶柴胡和石防风幼茎愈伤组织经长期继代已丧失分化能力.取继代后新长出的颗
粒状愈伤组织建立悬浮细胞系.悬浮细胞酶解分离的原生质(酶液含 1%Onozuka , RS ,
收稿日期:2000-03-20
基金项目:微生物技术国家重点实验室开放项目
作者简介:霍丽云(1946-),女 ,副教授 ,从事生物化学研究.现在山东省教育学院任教.
第 35 卷　第 4 期
Vol.35　No.4 　　　　　
山　东　大　学　学　报(自然科学版)
JOU RNAL OF SHANDONG UNIVERSIT Y
　　　 　2000 年 12 月
Dec.2000
0.1%Pectoly ase Y-23 ,0.6 mol/ L 甘露醇 , 5 mmol/L CaCl2 , pH =5.8),用 0.6 mol/L
甘露醇+5 mmol/L C aCl2清洗 2次 ,调成 1×106/m 的密度.狭叶柴胡原生质体经强度为
260μW/cm2 UV 分别照射 0 、1 、2和 3 min作为供体.石防风原生质体用作受体.
1.2　原生质体融合培养
石防风原生质体分别与紫外线照射不同时间的供体等体积混合 ,用 PEG 法[ 3]诱导
融合.融合的原生质体培养在附加 9%葡萄糖的 P 5[ 4]液体培养基上.培养物中再生的细胞
系长至 1 —1.5 mm 大小时 ,按大小先后将其转入 2.4-D 1 mg/ L 的固体 MS 培养基上
增殖.将增殖 2次的融合再生愈伤组织转入不含激素的 MS 培养基上分化.共再生 56个
细胞系 ,按其生长速度分别编号为:NO .1 、NO.2 、NO.3……NO.56.
1.3　杂种鉴定
1.3.1　形态比较
对融合再生的愈伤组织及再生植株与双亲在外形 、颜色上进行比较.
1.3.2　细胞学鉴定
取融合及对照的愈伤组织以及幼叶基部于 4 ℃处理 24 h ,甲醇:冰醋酸=3∶1的固定
液固定 ,用压片法制片 ,[ 5]卡宝品红染色 ,观察染色体.
1.3.3　同功酶鉴定
(1)酶液制备
取融合再生细胞系各 200 mg(称重前需将样品用吸水纸吸干),放入冰冻研钵中 ,按
照 1∶2(V / W)的比例加入Tris-HCl 、pH值8.3的缓冲液 ,研磨匀浆 ,所得匀浆液静置
1 h , 4000 r/min离心 30 min ,取上清液备用.
(2)电泳
采用聚丙烯酰胺凝胶平板电泳 ,分离胶浓度为 10%,浓缩胶浓度为 4%,电泳温度是
4 ℃(放入冰箱内进行).在 80 V 下电泳 3-4 h.
(3)染色
取坚牢蓝 R 30 mg ,溶于 30 mL ,pH 值 6.4的磷酸缓冲液中 ,过滤.再加入 2 mL 1%
的α-醋酸萘酯(少许丙酮溶解后 ,用 8%乙醇配制), [ 6] 1 mL 2%β-醋酸萘酯(配法同上)于
滤液中 ,再过滤 ,滤液待用.
(4)脱色与保存
脱色可用重蒸水反复冲洗.用 7%醋酸溶液保存.
2　实验结果
2.1　石防风与柴胡原生质体融合产物的培养
石防风与狭叶柴胡不同组合的融合产物在培养初期无明显区别.除 UV 照射 3 m in
的组合 ,其余均在第 7 d 开始分裂 ,20 d后形成小细胞团 ,60 d 左右长至直径 1 ～ 1.5 nm
的单细胞克隆 ,将其转入 2.4-D 1 mg/L 的 MS 培养基上增殖 ,共选出 56个克隆.其中 2
个(NO.1 ～ NO.2)为对称融合 ,36个(NO.3 ～ NO .38)属 UV 照射 1 m in 组合的 , 18个
(NO .39 ～ NO.56)属 UV 照射 2 min 组合.
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将上述 56个单细胞克隆再生的愈伤组织转到分化培养基上.培养 8个月后共有 12
个克隆来源的愈伤组织分化出幼叶 ,他们生长较慢.对称融合未产生幼叶.培养 12个月
后 ,经不对称融合产生的 NO.3 、NO.6 、NO .9 、NO .33 、NO.39克隆再生的愈伤组织分化
出完整小植株(图 1).作为对照的双亲原生质再生愈伤组织没有分化.
2.2　融合产物的杂种性质的鉴定
(1)形态学鉴定
融合再生愈伤组织表型除 NO.1-NO.2外均介于双亲之间.石防风原生质体再生
的愈伤组织多为淡黄色 、粉粒状 ,狭叶柴胡原生质体再生的愈伤组织多为黄色 、颗粒状 、较
松散 ,融合再生愈伤组织淡黄色 、颗粒状(图 2).狭叶柴胡原生质体幼叶为倒披针形 ,全
缘 ,[ 7]石防风原生质体幼叶为掌型 、深裂.[ 8]不同融合早期(7个月时)形成的幼叶形态各
异 ,不同于双亲.后期(12个月)新分化的植株表型介于双亲之间或偏向石防风(图 1).
图 1　石防风与柴胡融合克隆 3 , 39再生的小植株
Fig.1　Plant regenerated f rom clones Nos.3 and 39
图 2　石防风与柴胡杂种愈伤组织
Fig.2　Hyb rid cell lin e
　　(2)细胞学鉴定
用于融合的石防风愈伤组织染色体数目 82%左右为 15 ～ 22 ,柴胡愈伤组织染色体数
目 88%左右为 9 ～ 12 ,融合再生的 56个细胞系在早期(7个月左右),无论是对称还是不
对称融合产生的克隆 ,其染色体数目无明显差别 ,86%左右分布在 18 ～ 60之间 ,其再生幼
叶基部染色体数目 75%在 16 ～ 48之间(图 3).12个月后 ,检查后期再生完整植株的愈伤
组织及幼叶基部发现 ,染色体数目明显减少 ,83%以上分布在 16 ～ 26之间(图 4).
(3)同功酶鉴定
对石防风与紫外照射 1 min 的柴胡融合再生的愈伤组织的酯酶同功酶分析表明 ,在
36个细胞系中 ,12个具有双亲特征谱带并出现新带.6个具有双亲特征谱带 ,无新带(图
5)以 NO.3和 NO.6克隆为例:第 4 条带为新带;第 5条和第 6条带为柴胡特征带 ,第 1
条带为石防风的特征带 ,由此可见再生愈伤组织中有 18个细胞系表现出杂种特性.
对石防风与柴胡紫外照射 2 min 的融合再生的 18个愈伤组织进行酯酶同功酶分析 ,
6个细胞系具有双亲特征谱带 ,8个细胞系同时具有双亲特征带和新带(图 5).因此有 14
个克隆可初步鉴定为杂种细胞系.
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图 3　石防风与柴胡融合克隆 3再生幼叶
(7个月)染色体 , ※示双着丝粒染色体
Fig.3　Ch romosomes of hybrid Nos.3 clones derived
leaf let.Arrow indicates dicent ric ch romosomes.
图 4　石防风与柴胡融合克隆 3再生植株
(12个月)染色体 , ※示双着丝粒染色体
Fig .4　C hromosomes of hybrid Nos.3 clones derived
plant let.Arrow indicates dicen tric chrom osom es.
图 5　Nos.3 , 6 , 7 , 9 , 11 , 14细胞系脂酶同功酶谱带
Fig.5　Estenase i sozyme p at tern of clones Nos.3 , 6 , 7 , 9 , 11 , 14
3　讨　论
本试验所用双亲材料均没有分化能力 ,而融合产物却分化出大量的再生植株.这事实
说明在伞形科植物的属间体细胞杂交中也有与小麦族[ 9]一样存在再生能力互补效应的例
子.
石防风与柴胡杂种细胞系在培养 7个月左右才开始分化幼叶 ,到 12个月时分化出完
整小植株 ,这可能与体细胞杂交中双亲的染色体通过消减而降低双亲遗传物质的不平衡
有关.[ 10]可能当双亲遗传物质在杂种细胞中达到平衡时分化能力才得以恢复 ,此现象对
远缘体细胞杂交的机理研究有重要意义.
在石防风与柴胡融合培养物培养前期 ,不对称和对称融合组合的染色体数目差异很
小 ,但到后期 ,不对称融合染色体数目减少迅速.可以认为 , UV 使染色体损伤及不稳定的
作用是在融合物生长发育过程中逐步显现出来 ,杂种的生长发育特性也随之变化 ,出现了
表型完全像受体的植株.
同功酶谱可作为观察外源基因存在 ,表达活性的生化指标.也是快速筛选杂种细胞克隆
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及植株的标志.在石防风和狭义柴胡不同组合的杂种细胞系中 ,酯酶酶谱既有分别由柴胡及
石防风基因控制的酯酶(蛋白质),又有石防风与柴胡基因重组后表达的酯酶(蛋白质)出现.
表明杂种细胞系具有双亲特征带和新带.双亲的基因组在杂种细胞系中存在并表达.
石防风与柴胡体细胞杂种的分子鉴定及药用成分的比较正在进行之中 ,此项研究可
望为中草药的改良提供一条新途径.
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ASYMM ETRIC SOMA TIC HYBRIDIZAT ION BETWEEN
PEUCEDANUM TEREBIN THACEUM FISCH AND
BUPLEURUM SCORZONER IFOLIUM WILLD
H UO Li-yun ,XIANG Feng-ning ,XIA Guang-min
(School of L i fe Sci., S handong Univ ., J inan 250100 , S handong , China)
Abstract:The pro toplasts of Bupleurum scorzoneri fol ium i rradiated by ult raviolet lig ht
(UV)at an intensi ty of 260 μW/cm 2 fo r 0 ,1 , 2 ,3 m in respectively w ere fused wi th that
of Peucedan um terebinthaceum Fisch by PEG method.The regenerated 56 clones , ev-
eryone derived f rom a single fused cell ,were examined fo r their hybrid nature by pheno-
type , esterase iso zyme and chromosome analysis.The results reveal that 34 clones of them
are somatic hybrids.5 hybrid cell lines de rived f rom asymmetric fusion regenerated plants
af ter 12 months of culture.
Key words:Bupleurum scorzoneri folium ;Peucedanum terebinthaceum fisch;UV-irra-
diat ion;asymme tric somatic hybridization;hybrid plants
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