全 文 ：植 物 学 报 1 9 57, 29 (哟 : 3科一3 允
滋` 户口 召。 t “ n fe “ S 月 i e 。
品升奋二二二二二一二二 二乙二二二二 二二二二之二二 : 盆石二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二
石防风原生质体再生植株 ,
李忠谊 陈惠民
(山东 人学生物 系 , 济南 )
摘 要
石防风种子幼苗切段 , 在含有 l m g Z1 2 , 4 一 D 的 M S 固体培养基 (大 鼠元素减半 )上 ,产生含
有胚性细胞团的愈伤组织 。 经液体培养 , 获得含有高比例胚性细胞团的悬浮培养物 。 在含有
1
.
5%纤维素酶 、 0 . 3% 果胶酶 、 0 . 5% 蜗牛酶 、 s m m o J { I C a C I : 、 l m m o l / I K H : p o ; 、 o . 6m `》互/ l 甘露
醉 、 p H S . 8 的混合酶液中 ,在 2 5℃ 条件下 ,经过 5 小时消化 ,获得了原生质体 。 在含有 1 i n g /
J Z , 4 一 D + 0
.
s m g / l 玉米素的修改的 M s 培养基中 ,原生质体第 4 天出现了第一次分裂 ;约 仍
天后 ,形成 0 . 5一 1亩 m 的细胞团 。 把它们转移到含有 。 . , m g / 1 玉米素的液体 M s 培养基 (大
量元素减半 )中 ,逐步发育成胚状体 。 在不含激素的 M s 固体培养基 (大量元素减半 )上 , 胚状
休发育成完整植株 。
关键词 石防风 ;原生质体 ;再生植株 .
石防风 ( P o u c o d a , 。 m 一。 r e b泣, ,人。 c e , 。 ( F i s c h ) F is e h e x T u r e z . )属于伞形科植物 , 为
一种中药 。 伞形科植物的原生质体再生植株已有少数几例 l[, 3, 。 石防风原生质体的培养
工作尚未见有报道。 本文采用石防风为材料 , 进行原生质体培养 , 一方面进行原生质体培
养方法及理论探讨 ;另一方面可以作为进行细胞工程选育的工作基础 。
材 料 和 方 法
(一 ) 悬浮细胞培养物的制备
将石防风的种子 , 用 75 务酒精浸泡几秒钟后 , 用 0 . 2多 升汞消毒 15 分钟 , 用无菌蒸
馏水洗 5 次 ,放在无菌的 、 不含激素的 1/ 2 M S 固体培养基 (即大量元素减半 )上萌发 。 待
小苗长到 2一 3 c m 高时 , 在无菌条件下 , 将小苗切成 3一 4 m m 长小段 , .放在含有 l m g八 2 ,
4 一 D的 l / 2 M s 固体培养基上 , 诱导产生愈伤组织 。 然后将诱导两个半月后的愈伤组织转
人到含有 l m g / 1 2 , 4一 D 十 2 0 m g / l 水解干酪素的 l 2/ M s 液体培养基中 , 进行悬浮细胞
培养 ,每周继代一次 。 一个月后 , 悬浮培养物中含有大量细胞团 (细胞数 目多数在 50 个以
下 ) 。 我们以这种细胞悬浮培养物作为原生质体培养的游离材料 。
(二 ) 原生质体的游离和语养
将含有大量细胞团的悬浮细胞培养物 , 继代培养后 3一 7天作为游离原生质 体 的 材
料 。 先用 1 0 目不锈钢丝网过滤悬浮细胞培养物 , 去掉较小的班;胞 团及单细饱。 再用不
木文于 1 9 86 年 10 月收到 , 1 9 8 7 年 l 月收到修改稿 。
* 重墓江同 态在校期间参加部分实验工作。
牛 期 李忠谊等 : 石防风原生质体再生植株
含激素的 l/ 2 M S液沐培养基冲洗滤网上的材料 5次 。 然后将滤网上的材料按材料 : 酶
液 一 ;1 0的比例 , 放在含有 1 . ,外 o m o z u k a R一 1 0 + 0 . 3外 M a e e r o z y m e R一 1 0 + 0 . 5关蜗牛酶 (中国科学院生物物理所产品 ) 、 5 ; n , l /1 e a e l Z、 l m m o l /1 K H ZP o 4 的 o . 6 m o l /l 甘
露醇溶液 ( p H 5 . 5) 中 ,在 50 转 /分 、 25 ℃ 条件下 , 消化 5 小时 。
消化好的材料用 2 0 目不锈钢丝网过滤 , 去掉没消化完的材料及碎片 。 将滤液收集
到 , m l试管中 , 5 0 转 /分离心 5 分钟 , 用吸管吸去酶液 ,再用 .0 2 m ol 八 c a CI : 洗涤原生质
体两次 。 将原生质体悬浮在含有不同配比的 2 , 4 一 D 和玉米素的修改的 M s 培养基 1L , 密
度为 5 x l 创 /m l , 浅层培养在 25 ℃ 、 散射光条件下。
(三 ) 胚状体的诱导
将浅层培养 斗。天后 , 产生的细胞团转移到含有 0 . s m g ZI 玉米素和 20 0 m g / 1 水解干
酪素的 ` l / ZM s 液体培养基中 , 在 2 ℃ 、 1 0 转 /分摇瓶机中振荡培养。 诱导产生胚状体。
( 四 ) 再生植株的诱导
将振荡培养 刊 天含有胚状体的液体培养物 , 转移到不含激素的 l / 2 M S 固体培养基
上 ,诱导植株再生 。
结 果 和 讨 论
用于游离原生质体的悬浮细胞培养物中含有大量胚性细胞团 (图版 I , l ) (这些细胞团
若培养在含有 0 . sm g八玉米素的 1 / 2 M s 培养液中 , 能分化出胚状体 , 再生成植株 )。 经过
滤处理后 , 胚性细胞团的比例更高 。 原生质体再生细胞能否分裂和发育与用于游离原生
质体的材料来源和生理特性密切相关 : 游离原生质体的材料胚性高 , 所得原生质再生细
胞容易分裂。 胚性细胞培养物是原生质体培养的适宜材料【5J 。 近年来 , 来源于悬浮细胞
的原生质体再生植株 一也逐渐增多。 一幼 , , J。 本实验材料选用含高比例胚性细胞 团的悬浮培
养物 , 这些细胞团具有较强的分裂和发育能力 , 同时在游离原生质体之前 , 又把分裂较慢
的单细胞及去壁较难的老化单细胞过滤掉 , 因而提高了游离原生质体中具有胚性的比例 ,
为获得较高频率的分裂及进一步发育打下基础 。
胚性悬浮细胞的继代时间对原生质体的游离及原生质体再生细胞的分裂也 至 关 重
要 。 本实验采用继代培养后 3一 7天的胚性悬浮细胞培养物作游离的材料 , 游离的原生质
体数量多 、 杂质少 、 内含物较多 , 原生质体容易分裂 、 分裂频率高 ;而采用继代培养 13 天的
材料进行游离 , 所得原生质体数量少 、破碎多 、 内含物较少 、 分裂较难 , 培养材料中含杂质
多 。 显然 ,这是由于继代时间不同 ,细胞壁成分及原生质的生理状态不同所致 。
刚游离的原生质体呈圆球形 (图版 I , 2 ) , 内含物较多 。 原生质体悬浮液中杂质较少 ,
不含有单细胞及小细胞团 。 在含 l m g / 1 2 , 4一 D + 0 . s m g / l 玉米素的培养液中 , 培养两天
后 , 原生质体由圆球形变成椭圆形 ,第 斗天开始第 1 次分裂 (图版 I , 3 ) 。 第 7 天 出现了 8
个细胞的细胞团 (图版 I , 4 ) 。 半个月分裂成几十个细胞的细胞团 (图版 I , 5 ) 。 分裂频率达
20 舜 左右。 本实验中 , 不同的激素组合 , 对原生质体的分裂频率有较大影响 。 在含
0
.
s m g / 1 2
, 4一 D培养液中 , 分裂频率为 10 多左右。 在含 0 . s m g / 12 , 4 一D + 0 . 2 。盯 1 6一 B A 或
l m g / 1 2
, 4一 D 培养液中 ,分裂频率为 4 %左右 。 而在合 0 二 l m g八 2 , 4 一 D + o . l m g / 1 6 一 B A 培
养敌中 , 只有少数几个原生质体的再生细胞分裂。 在最适合培养基中 , 培养 40 天后 , 细胞
3 5 6 植 物 学 报 2 9卷
团发育成 0. 5一 l m m大小。 将这些细胞团转移到含有 o. s m g /l玉米素和 2 0 0 m g /1水解干
酪素的 l /ZM s液体培养基中 , 10 天后出现球形胚 , 继而发育成心形胚 、 鱼雷胚 、 子叶胚 (图
版 I , 6 ) 。 转移到不含激素 1 / ZM s 固体培养基上 ,胚状体长出根和叶 。 一个月后 , 发育成
高 cZ m 小植株 (图版 I , 7 ) 。 现已有植株数百株。 部分植株已在 田间移栽成活 。
参 考 文 献
【l 〕 李忠谊 、 陈惠民 , 1 9 8 :6 川芍原生质体再生植株。 植物学报 , 28 : 知一 5 40
[ 2 ] 衣t a n a s so v , A . 1 . a n d D . C . W . B r o w n , 19 8 3 : p l a n o r e g e n o r a t i o n f r o m s n s p c n s i o n e u l t u r e a n d m e s o p h y l l p r-o
t o P l a s t s o f a l f a l f a
.
I n P o s t e r P r oc
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.
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,
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4 0一4 1 .
[ 3 ] G
r a m b o w
,
H
.
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. ,
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.
N
.
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.
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,
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.
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, 10 3 ( 4 )
: 3 4 8一3 5 5 ·
[冲 ] L u , C , V . v a s i l , a n d 1 . K
.
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, 19 8 1
: I s o l a t i o n :
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[ 5 ] ya
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.
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.
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.
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, 19 80 : I s o l a r i o n
a n d C u l t u r
。 。 f P r o t o p l a s t ` . I n P e r s p e e t i v o s i n P l a n t eC l l
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[石 ] v as i l , v . a n d I . K , v a s i l , 2 97 9 : x s o l a t i o n a n d 。 u l t u r e o f 。 e r e a l p r o t o p l a s : s : e a l l u s f o r m a t i o n f r o m p e a r l
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[ 7 ] v a s i l
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a n d l… v a s i l , 1 9 80 : I s o l a t i o n a n d e u l t u r e o f e e a r l L p r o ` o p l a s ` s 二 2 · Em b r , o g e n e s i s a n d p l a n` l e t
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P L A N T R E G E N E R A T IO N F R O M P R O T O P L A S T S O F
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t u r e w i th h i g h P e r e e n at g e o f e m b r y o g en i e e e l l c o l o
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