全 文 ：黑龙江农业科学 2011(6):9 ～ 13
Heilong jiang Ag ricultural Sciences 生物技术
芫荽 RAPD体系优化
李小梅1 , 2 ,栾 杰1 ,张景涛1 , 2 ,张丽茁2 ,张立微2 ,董守坤1
(1.东北农业大学 ,黑龙江 哈尔滨 150030;2.哈尔滨市农业科学院 ,黑龙江 哈尔滨 150070)
摘要:以芫荽基因组 DNA 为模板 , 对 RAPD扩增反应条件进行优化 , 以期建立适合芫荽的 RAPD 的最优反应
体系 ,结果表明:PCR扩增体系(总体积 20 μL)为:模板 DNA1.0 ng·μL-1 , dNTP 0.45 mmol·L-1 , 随机引物
1.3 μmol·L-1 , Taq 酶 0.6 U ,Mg 2+ 2.0 mmo l·L-1 ,退火温度 39℃,循环次数 40。
关键词:芫荽;DNA;RAPD;反应体系
中图分类号:S636.9 文献标识码:A 文章编号:1002-2767(2011)06-0009-05
收稿日期:2011-03-25
基金项目:东北农业大学博士启动基金资助项目
第一作者简介:李小梅(1982-), 女, 黑龙江省绥化市人 , 硕
士 ,农艺师 ,从事蔬菜育种研究。 E-mai l:xmlynn@yahoo.cn 。
通讯作者:张景涛(1963-), 男 ,黑龙江省哈尔滨市人 ,硕士 ,
研究员 ,从事蔬菜育种研究。 E-mai l:chiil lii@126.com。
芫荽又名香菜 、胡荽 、香荽 ,学名为 Corian-
drum sat ivum L.,英文名为 Coriande r ,属伞形科
一年或二年生的草本绿叶蔬菜 ,原产地中海沿岸 ,
汉代经“丝绸之路”传入我国。根据考古学文献和
种间多样性观察 ,芫荽是一种栽培植物 ,有时视为
一种杂草 。关于芫荽最早的考古学文献是公元前
6000年在以色列[ 1] 。芫荽在各地的文献都有记
载 ,埃及 3200BC ,南欧 1500BC ,印度300BC ,中国
400AD ,中欧 100AD ,北欧是 1 400 a 后 ,美国是
1 670 a后[ 2-4] 。它虽非主菜 ,却是人们日常生活
中不可缺少的调味香料[ 5] ,是人类历史上用于调
味食品上最古老的芳香蔬菜之一[ 6-7] ,中医以全草
人药 ,可治麻疹诱发不快 , 食物积滞 , 感冒风寒
等症[ 7-8] 。
Study on the Techniques of Tissue Culture and Rapid
Propagation of Introduced Foreign Blueberry Varieties
Tsvetkov Yordan1 ,ZHAO Yan-l i2 ,WANG Chun3 ,DONG Xuan4 ,YANG Fan1
(1.Heilong jiang Cente r for Ag ricultural Scienti fic and Technological Cooperation be tw een
China and Russia , Heilong jiang Academy of A gricultural S ciences , Harbin , Heilongjiang
150086;2.Harbin S taff and Workers M edical College , Harbin , Heilong jiang 150020;3.Plant
Pro tection Inst itute of Heilongjiang Academy of Ag ricultural Sciences , Harbin , Heilongjiang
150086;4.Harbin Kerui Seed and Seedlings Bio technology Research Insti tute , Harbin , Hei-
lo ng jiang 150086)
Abstract:Dormant shoo t of introduced bluebe rry v arie ties of B91 and B92 from Bulgaria w ere used as expe ri-
mental ma te rials to carr y out a study on techniques o f budding and dissimilating of apical bud , stem apex and
stem segments , regenera tion and fast propagation of stem segments , ro oting and t ransplanting o f seedling s in
test tube.The results show ed that the pre-tr eatment on do rmant shoo t has significantly inc reased efficiency o f
inoculation;WPM+ZEA 2.0 mg·L-1 was a suitable medium fo r stem segment inoculation;WPM +ZEA 1.0
mg·L-1 w as a fast propagation medium producing a la rge numbe r o f clusters;1/2 WPM +IBA 1.0 mg·L-1 +
NAA 0.5 mg·L-1 was the ideal medium fo r r oo ting.I n the g reenhouse peat , river sand and garden soil mixed at
1∶1∶1 ra tio , and trea ted with sulphur pow der after acid w as a compa rativ ely g ood subst rate for transplanta tion
of seedlings produced in test tube;T ransplanted seedling s perfo rmed vigo rous gr ow th in the demonst rate o r-
chard.
Key words:blueberr y;tissue culture;fast propaga tion techniques
9
生物技术 黑 龙 江 农 业 科 学 6 期
RAPD(Random Amplified Po lymo rphism
DNA)标记是由 Williams 等和 Welsh 等在 PCR
技术基础上发展起来的一种分子标记 ,是一种运
用随机引物扩增基因组寻找多态性 DNA 片段的
技术 ,该技术具备简单 、快速 、不需预先知道目的
基因的碱基顺序 ,仅需少量模板 DNA 就可获得
丰富 DNA 多态性的优点。现已广泛应用于遗传
多样性分析 、物种进化 、品种鉴定 、分类等研究领
域。目前芫荽的分子生物学研究尚未见报道 ,为
了更好地利用 RA PD技术对芫荽进行聚类分析 ,
确定品种间亲缘关系 ,进而为芫荽育种提供理论
指导 ,该试验在成功提取芫荽基因组 DNA 的情
况下 ,对其 RAPD扩增反应条件进行了优化 ,最
终建立了适合于芫荽的 RAPD最佳反应体系 ,以
期为进一步的 RA PD研究奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 试验材料采自哈尔滨市农业
科学院薛家试验基地 ,将采取的叶片封存于液氮
中带回实验室。
1.1.2 试验试剂 dN TP 购自天泽基因工程有
限公司 , Buffer(10 ×PCR Buf fer)、Taq DN A 聚
合酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;
RNaseA 、DNAM arke r DL 2000 购自宝生物公
司;随机引物购自上海生工;CTAB 、EDTA 、Tris 、
HCl 、NaC l、PVP 、β-巯基乙醇 、无水乙醇 、氯仿 、异
戊醇等均为国产分析纯试剂;电泳仪及电泳槽均
由北京六一厂生产。
1.2 方法
1.2.1 芫荽 DNA 提取方法 芫荽基因组 DNA
提取利用 CTAB 法 ,将叶片于液氮中迅速研磨至
粉状 , 转入 1.5 mL 离心管 , 加入 65℃预热的
CTAB抽提缓冲液 600μL ,65℃恒温水浴 1 h(每
隔 10 min摇荡 1次)。取出待冷却至室温后加入
600 μL 氯仿∶异戊醇(24∶1),轻摇至有机相为绿
色 ,静止 10 min 。4℃12 000 r·min-1离心 10 min ,
取上清液转至 1.5 mL 新管 ,加入 600 μL 氯仿:
异 戊 醇 , 轻 轻 摇 匀 静 止 10 m in。 4℃
12 000 r·min-1离心 10 min ,取上清液至事先预冷
的无水乙醇中 ,轻摇至有絮状沉淀 , -20℃冰冻
30 min后 ,4℃12 000 r·min-1离心 10 min ,倒掉液
体 ,留下沉淀。加 80%乙醇洗涤后将 DNA吹干 ,
加入 300 μL 去离子水 、1 μL RNase A 酶溶
液(10 mg·mL-1),摇晃均匀于 37℃下温浴 1 h(每
隔 10 min摇荡 1次)。取出后加入 600 μL 氯仿-
异戊醇 ,颠倒均匀 ,静置 10 min ,4℃12 000 r·min-1
离心 10min。取上清至事先预冷的无水乙醇中 ,
轻轻摇匀 , -20℃中冰冻 30 min。取出后 4℃
12 000 r·min-1离心 10 m in。弃上清 , 用 80%乙
醇洗涤 DNA ,吹干后加入适量 TE 或去离子水溶
解。4℃过夜使 DNA 溶解 ,分装 ,置于-20℃保
存备用。
1.2.2 DNA 检测 (1)用紫外分光光度仪
(DU640 , Beckman)测定 DNA 浓度 , 检测 DNA
样品在 260 、280 nm 的吸光值(OD), 由此计算
DNA 的浓度 ,DNA 的浓度/ng·μL-1 =OD260 ×50
×稀释倍数 ,纯度按 A 260/A 280值判断[ 7] 。(2)凝
胶电泳检测以 1%琼脂糖凝胶(1.00 g 琼脂糖 、
100 mL TAE 电泳缓冲液 , 0.5 μL EB)电泳检测
DNA 完整性 ,电压 100 V ,电泳时间约30 min ,在
凝胶成像仪下拍照观察。
1.2.3 芫荽 RAPD-PCR 反应体系的建立 随
机扩增多态 DNA 分析影响 RA PD试验的因素众
多 ,且多对试验条件敏感 ,在 RAPD反应体系中 ,
各种试验参数都会影响到试验结果 。但可以通过
对试验条件的严格控制和试验操作流程的规范加
以避免 ,而影响 RAPD-PCR扩增效果的反应体
系则需通过试验进行探索来建立。该试验主要通
过单因素试验法对模板 DNA 浓度 、引物浓度 、
dN TP 浓度 、Taq酶用量及 Mg2+浓度 5个主要影
响因素进行了比较 ,从而寻找适合芫荽 RA PD-
PCR扩增反应的最佳反应条件。
表 1 各因素水平设计
水平 模板浓度/ ng·μL-1
引物浓度
/μmol·L-1
dNTP 浓度
/mmol·L-1
Mg2+浓度
/mm ol·L-1
Tag
酶用量/U
1 0.5 1.0 0.25 1.0 0.2
2 0.8 1.3 0.35 1.5 0.4
3 1.0 1.6 0.45 2.0 0.6
4 1.5 2.0 0.60 2.5 0.8
PCR反应总体积为 20μL ,于Eppendorf基因扩
增仪中进行扩增。采用普遍使用的循环体系进行各
因素优化:94℃预变性 4 min ,之后 38个循环(94℃
30 s ,37℃30 s ,72℃90 s),最后 72℃延伸10 min ,4℃
终止反应。扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后在
凝胶成像分析仪上观察结果并照相。
退火温度及循环次数对 RAPD-PCR扩增结
果也很重要 ,根据这些试验所获结果 ,选取各因素
最佳反应组合 ,设置 10个退火温度梯度及扩增循
10
6 期 李小梅等:芫荽 RAPD体系优化 生物技术
环数进行单因素 RAPD反应条件优化。
2 结果与分析
2.1 DNA 浓度与纯度检测结果
提取的 DNA 用紫外分光光度计进行检测 ,
根据在 260 nm 和 280 nm 的读数比值可以估计
核酸的纯度 。经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测 ,
DNA 条带整齐清晰 ,无断裂和降解 ,所提取的样
品 DNA 能够满足 RAPD扩增的要求(见图 1)。
图 1 基因组 DNA 电泳
M:DL2000;1～ 16:所提取的芫荽叶片 DNA
2.2 RAPD反应体系的优化
2.2.1 模板浓度优化 试验设计了 0.5 、1.0 、
1.5和 2.0 ng·μL-14 个浓度梯度 ,结果表明:4个
浓度均有扩增产物 ,以 DNA 模板为 1.0 ng·μL-1
时的扩增效果最好 ,条带清晰 、稳定。同时从图 2
中可以看出随着模板浓度的升高 ,扩增产物有弥
散现象。因此 ,芫荽的 RA PD 反应体系中 DNA
模板最佳用量为 1.0 ng·μL-1(见图 2)。
图 2 模板浓度对扩增结果的影响
M :DL2000;1:0.5 ng·μL-1;2:1.0 ng·μL-1;
3:1.5 ng·μL-1;4:2.0 ng·μL-1
2.2.2 dNTP 浓度优化 dN TP 的浓度对 PCR
反应有较大影响 。其浓度过高会降低扩增反应的
准确率;浓度过低则会造成扩增产物率太低 ,从而
导致条带模糊。试验设计了 0.25 、0.35 、0.45和
0.60 mmol·L-1 4个浓度梯度。从图 3 可见 , 4个
浓度均有条带产生 ,但在 dNTP浓度为0.45 mmol·L-1
时 ,扩增出来的条带比较清晰。因此 , 20 μL 的芫
荽 RA PD 扩增反应体系中最佳 dNTP 浓度为
0.45 mmol·L-1(见图 3)。
图 3 dNTP 浓度对扩增结果的影响
M :DL2000;1:0.25 mmol·L-1;2:0.35 mmol·L-1 ;
3:0.45 mmol·L-1;4:0.6 mmol·L-1
图 4 引物浓度对扩增结果的影响
M:DL2000;1:1.0μmol·L-1;2:1.3μmol·L-1 ;
3:1.6μmol·L-1 ;4:2.0μm ol·L-1
2.2.3 引物浓度优化 在 RAPD 反应中 ,引物
浓度太低 ,会导致扩增反应无法进行;浓度太高 ,
则会产生新的扩增条带 。试验设计了 1.0 、1.3 、
1.6和 2.0 μmol·L-1 4个浓梯度 ,结果表明 ,引物
浓度为 1.3 、1.6 μmol·L-1时扩增出来的条带带型
稳定 、清楚 ,而随着引物浓度的升高 ,扩增出来的
产物条带变弱。故芫荽的 RAPD 扩增反应体系
11
生物技术 黑 龙 江 农 业 科 学 6 期
中最佳随机引物浓度为 1.3 μmol·L-1(见图 4)。
2.2.4 aq 酶用量优化 试验设计了 0.2 、0.4 、
0.6和 0.8 U4 个浓度梯度 , 结果表明 , 浓度为
0.6 、0.8 U 的 Taq酶用量扩增效果较好 ,条带清
晰 、稳定。 Taq 酶用量少 , 会影响扩增产物量;
Taq酶用量过多 ,可能会产生非特异性扩增。综
合成本考虑 ,芫荽的 RAPD扩增反应体系中最佳
Taq酶用量为 0.6 U(见图 5)。
图 5 T aq酶浓度对扩增的影响
M:DL2000;1:0.2 U;2:0.4 U;3:0.6 U;4:0.8 U
图 6 Mg2+浓度对扩增结果的影响
M :DL2000;1:1.0 mmol·L-1;2:1.5 mmol·L-1 ;
3:2.0 mmol·L-1;4:2.5 mm ol·L-1
2.2.5 Mg2+浓度优化 试验设计了 1.0 、1.5 、
2.0和 2.5 mmol·L-1 4个浓度梯度 ,结果表明 ,当
Mg 2+浓度为 2.0 mmol·L-1时条带最为清晰;
Mg 2+浓度为 1.0 、1.5 mmol·L-1时扩增条带有些
暗;Mg2+浓度为2.5 mmo l·L-1时扩增片段有弥散
现象 ,因此芫荽 RAPD 扩增反应的最佳 Mg2+浓
度为 2.0 mmo l·L-1(见图 6)。
2.2.6 退火温度的优化 在 RAPD扩增反应
中 ,退火温度也是一个重要的影响因子 ,它具有一
定的灵活性 , 是 RAPD 扩增反应的重要控制条
件。在上述试验确定的各因子的最适条件下 ,对
退火温度作单因子试验 ,设置了 10个温度梯度 ,
依次为:36 、37 、38 、39 、40 、41 、42 、43 、44 、45℃(见
图 7),结果表明 , 30 ～ 41℃都有条带出现 , 39℃较
为适宜 ,谱带清晰。
图 7 退火温度对扩增结果的影响
M:DL2000;1～ 10:36～ 45℃
图 8 循环次数对扩增结果的影响
M:DL2000;1～ 6:30 、34 、36 、38 、40 、44次循环
2.2.7 循环次数对扩增结果的影响 RA PD分
析一般采用 35 ～ 45个循环进行扩增 ,为了提高效
率节省时间 ,需要摸索一个最佳循环数 。该试验
设循环次数为 30 、34 、36 、38 、40 、44次 6个水平 ,
试验结果表明 , 30 ～ 34次扩增效果不太好 ,由于
过少的循环次数 ,未能获得明显的扩增产物;36 ～
40次循环扩增条带的确认较容易 ,但 36次扩增
产物较多 ,谱带背景非常浓 ,非特异性扩增较为明
显 ,因此试验确定循环数为 40次(见图 8)。
12
6 期 李小梅等:芫荽 RAPD体系优化 生物技术
3 结论与讨论
通过各因素的优化试验 ,最终确定了芫荽
RAPD-PCR扩增的最佳反应体系:20 μL PCR反
应体系中 ,模板 DNA为 1.0 ng·μL-1 , dN TP 浓度
为 0.45 mmol · L-1 , 随 机 引 物 浓 度 为
1.3 μmo l·L-1 ,Taq酶浓度为 0.6 U ,Mg2+浓度为
2.0 mmol·L-1 。通过对退火温度及循环数的单因
素试验 ,确定热循环参数为:94℃预变性 4 min ,
之后进行 40 个循环(94℃变性 30 s , 39℃退火
30 s , 72℃延伸 90 s),最后72℃延伸10 min ,然后
在 4℃终止反应。
RAPD反应的结果受到很多因素影响。Smith
和Caetano-Anolles等发现 ,当 DNA 模板的最适浓
度确定后 ,各种方法提取的 DNA 均能获得一致的
扩增结果 ,模板中少量的蛋白质和 RNA 对扩增结
果无影响 ,该试验也发现模板中一定量的蛋白质不
影响扩增结果 ,模板降解程度不大。由此可见 ,
RAPD对模板 DNA 的质量要求不高。但是在
DNA提取过程中应严格避免影响 Taq 酶活性的有
机溶剂的残留 ,如酚 、三氯甲烷等。
模板 DNA 的用量有一个适宜的变动范围 ,
所以 ,制备模板 DNA时 ,在开始就将其达到各样
本之间浓度的统一 , 在正式 PCR扩增之前 ,做
DNA 模板浓度梯度试验 ,以选取最佳的模板浓
度。dN TP 是 RAPD反应的原料 ,从试验可以看
出 ,浓度太低会造成产物率过低 ,导致条带模糊;
浓度过高易与 Mg2+结合降低游离 Mg2+浓度 ,从
而影响 Taq 酶的活性。 Mg2+是 Taq 酶的激活
剂 ,可以说是一个重要影响因素[ 9] 。Mg2+浓度过
低时 ,酶活力显著降低;过高时扩增产物有弥散现
象 ,背景模糊。T aq 酶的活性与用量关系到扩增
能否正常进行 ,是 PCR反应中最重要的因子 。酶
用量过低 ,会导致无扩增产物或扩增产物少 ,但量
过多会导致非特异性扩增产物含量增高 ,同时成
本升高。在 RA PD-PCR 扩增反应体系中 ,引物
与模板 DNA 的浓度比率是十分重要的 ,如果引
物浓度太低 ,DNA模板则不能被引物所饱和[ 10] ,
在琼脂糖凝胶上就会出现模糊的扩增带 ,因此只
有确定引物与模板在体系中的最佳浓度才会得到
重复性好的扩增产物 。
总之 ,RAPD反应中 ,各反应参数都是保持
其稳定性的重要因素 ,只有反复摸索 ,建立最佳反
应条件才能准确 、稳定地反映不同模板的遗传差
异 ,使结果更可信。
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Optimization of RAPD Reaction Conditions
for Coriander sativum
LI Xiao-mei1 , 2 ,LUAN Jie1 ,ZHANG Jing-tao1 , 2 ,ZHANG Li-zhuo2 ,ZHANG Li-wei2 ,DONG Shou-kun1
(1.Northeast Ag ricultural University , Harbin , Heilong jiang 150030;2.Harbin Academy of
Agricul tural Sciences , Harbin , Heilong jiang 150070)
Abstract:Taking the DNA of Coriander sativum as the templa te , the amplification sy stem was optimized to set
up the optimal reaction sy stem.The results showed that the optimum conditions w ere as fo llow s:20 μL PCR
reaction vo lume , 1.0 ng·μL-1 templa te DNA , 0.45 mmo l·L-1 dNTP , 1.3 μmo l·L-1 prime r , 0.6 U Taq DNA po l-
ymerase and 2.0 mmo l·L-1 Mg 2+ , 39℃annea ling temperature and 40 cycles.
Key words:Coriander sativum;DNA;RAPD;r eac tion sy stem
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