全 文 ：林业科技开发 2013 年第 27 卷第 6 期 17
3 结论与讨论
(1)本文采用 5 株优势木对比法开展任豆人工
林优树选择研究，以胸径、树高、单株材积作为生长量
评价指标，以干形、自然整枝能力和分枝作为形质评
价指标，采用“t检验”分析确定了任豆人工林优树选
择综合评价标准为:胸径≥5 株优势木平均胸径的
1． 22倍、树高≥5 株优势木平均树高的 1． 13 倍、单株
材积≥5 株优势木平均单株材积的 1． 63 倍，且形质
指标(干形 +自然整枝能力 +分枝)综合得分≥8． 0
分，只有同时满足上述指标的才能入选评为优树。本次
选优，60株任豆候选优树共有 19株入选，入选率 32%。
(2)本次选优目的是用材型优树，重点关注与单
株材积量密切相关的性状指标，如胸径、树高的生长
量以及干形、自然整枝能力、分枝等形质表现。而对
木材基本密度、纤维形态、纤维素含量、树木繁殖力和
抗逆性等指标未作测试分析，实际评选优树时，应根
据优树类型、遗传改良目标和选优林分不断改进选优
指标，完善选优标准，使选优结果更客观、更准确。
参考文献
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( 责任编辑 吴祝华
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
)
doi:10． 3969 / j． issn． 1000－8101． 2013． 06． 005
基于 SＲAP分子标记的三桠乌药遗传多样性分析
张勇杰，朱鸿菊，任莹，梁婷婷，臧德奎*
(山东农业大学林学院，山东 泰安 271018)
收稿日期:2013－06－17 修回日期:2013－08－28
基金项目:山东省农业良种工程重大课题“林木种质资源收集保护与
评价”(编号:鲁农良字［2010］6 号) ;山东省林业厅资助项目“泰山、
蒙山、徂徕山、抱犊崮树种资源调查”。
作者简介:张勇杰(1989 －) ，女，硕士生，研究方向为园林植物种质资
源及遗传育种。通讯作者:臧德奎，男，教授。E-mail:zangdk@ sdau．
edu． cn
摘 要:采用 SＲAP分子标记对山东省三桠乌药 4 个居群的遗传多样性进行了分析。16 对引物共检测到 174 个
位点，其中多态位点 142 个，多态位点百分率( PPL) 81． 61%，Nei’s基因多样性指数( H) 0． 254 8、Shannon’s信息指
数( I) 0． 385 2，表明三桠乌药的遗传多样水平较高。遗传分化系数( Gst ) 0． 317 1，表明 31． 71%的遗传变异存在于
居群间，68． 29%的遗传变异存在于居群内。在居群水平上，崂山居群的遗传多样性最高，徂徕山最低。居群间遗
传一致度( GS ) 和遗传距离( GD ) 分别为 0． 853 0 ～ 0． 943 3 和 0． 058 4 ～ 0． 159 0，居群间的遗传距离和地理位置间无
直接相关性。
关键词:三桠乌药; SＲAP;遗传多样性
Genetic diversity of Lindera obtusiloba revealed by SＲAP markers∥ZHANG Yong-jie，ZHU Hong-ju，ＲEN
Ying，LIANG Ting-ting，ZANG De-kui
Abstract:Genetic diversity of 4 Lindera obtusiloba populations collected from Shandong province was estimated by using se-
quence-related amplified polymorphism (SＲAP)． 174
loci were identified with 16 SＲAP primer combinations，
out of which 142 were polymorphic． The proportion of
polymorphic loci (PPL)was 81． 61% ． Nei’s gene di-
versity(H)was 0． 254 8，Shannon’s Information index
(I)was 0． 385 2，which showed a rich genetic diversity
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 应用研究
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in Lindera obtusiloba． Coefficient of genetic differentiation (Gst) (0． 317 2)suggested that most of variation distributed a-
mong different populations． At the level of populations，Laoshan population exhibited the highest genetic diversity while Cu-
laishan contained the lowest． Nei’s genetic identity and genetic distance of 4 populations were 0． 853 0 － 0． 943 3 and
0． 058 4 － 0． 159 0，respectirely． No significant correlation between the genetic distance and the geographical location was
observed．
Key words:Lindera obtusiloba;SＲAP;genetic diversity
Author’s address:Forestry College，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，Shandong，China
三桠乌药(Lindera obtusiloba)属于樟科(Laurace-
ae)山胡椒属(Lindera) ，是樟科植物中最耐寒的种类
之一，自然分布北界可至辽宁省千山山脉，在研究樟
科植物的起源和扩散方面具有重要价值。同时，三桠
乌药也具有较高的经济价值［1］。在山东省主要分布
于山东半岛山地丘陵区，尤以崂山和蒙山较多，为山
东省珍稀树种。目前未见有其遗传多样性方面的研
究报道。
相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified
polymorphism，SＲAP)是一种新型的基于 PCＲ 的分子
标记，通过独特的双引物设计(正向引物 17 bp，反向
引物 18 bp)对基因的 OＲFs(Open reading frames)特
定区域进行扩增，因不同个体以及物种的内含子、启
动子与间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有
简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便
于克隆目标片段的特点［2］。目前已成功地应用于作
物遗传多样性分析、遗传图谱的构建、重要性状的标
记以及相关基因的克隆等方面［3－5］。本研究对山东
省境内 65 份三桠乌药进行 SＲAP 遗传多样性分析，
旨在为分子系统学研究提供资料，并为三桠乌药的利
用和保护提供分子依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
试验材料于 2011—2012 年采自山东崂山、蒙山、
塔山和徂徕山，共 65 份样品(表 1)。居群内相邻植
株采样间距在 30 m以上，记录所采样品的海拔、地理
位置并采集凭证标本。采取新鲜幼嫩叶片放入封口
袋中，编号后用变色硅胶进行快速干燥。
表 1 供试三桠乌药居群概况
居群 采样数 海拔 /m 地理位置 /(°)
徂徕山 4 600 ～ 700 36． 0039 ～ 36． 0583N，117． 3206 ～ 117． 3892E
崂山 39 300 ～ 1 000 36． 1310 ～ 36． 2376N，120． 4995 ～ 120． 6871E
蒙山 18 300 ～ 1 000 35． 5050 ～ 35． 5804N，117． 8144 ～ 117． 9677E
塔山 4 500 ～ 800 35． 4323 ～ 35． 4683N，117． 0435 ～ 118． 0297E
1． 2 DNA提取
采用改良的 CTAB 法［6］提取样品总 DNA，0． 8%
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量，用紫外分光光度计
检测 DNA浓度后用 ddH2O稀释至 50 ng /μL，－ 20℃
保存备用。
1． 3 SＲAP－PCＲ反应体系和程序
SＲAP引物设计参照 Li［2］，13 个正向和 18 个反
向共 234 对引物组合，由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。从中筛选出 16 对扩增条带数量多、
清晰、重复性好的引物组合(表 2)用于正式扩增。
反应体系为 25 μL:10 × PCＲ Buffer 2． 5 μL，模板
DNA 75 ng，Mg2 + 1． 5 mmol /L，dNTP 0． 2 mmol /L，上
下游引物各 0． 35 μmol，TaqDNA 聚合酶 1． 5 U，用
ddH2O调整使终体积为 25 μL。
PCＲ扩增程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 1
min，35℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，进行 5 个循环;
94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，进
行 30 个循环;72℃延伸 7 min。
PCＲ扩增产物采用 2%琼脂糖凝胶电泳分离，经
溴化乙锭(EB)染色后采集图像。
表 2 SＲAP扩增引物组合序列
引物组合
引物组合序列
正向引物 反向引物
ME1－EM7 5－TGAGTCCAAACCGGATA－3 5－GACTGCGTACGAATTGAC－3
ME2－EM18 5－TGAGTCCAAACCGGAGC－3 5－GACTGCGTACGAATTATG－3
ME2－EM2 5－TGAGTCCAAACCGGAGC－3 5－GACTGCGTACGAATTCAG－3
ME2－EM11 5－TGAGTCCAAACCGGAGC－3 5－GACTGCGTACGAATTGGT－3
ME2－EM14 5－TGAGTCCAAACCGGAGC－3 5－GACTGCGTACGAATTCAT－3
ME4－EM7 5－TGAGTCCAAACCGGAAT－3 5－GACTGCGTACGAATTGAC－3
ME4－EM15 5－TGAGTCCAAACCGGAAT－3 5－GACTGCGTACGAATTCTG－3
ME5－EM10 5－TGAGTCCAAACCGGTAA－3 5－GACTGCGTACGAATTGAG－3
ME5－EM14 5－TGAGTCCAAACCGGTAA－3 5－GACTGCGTACGAATTCAT－3
ME5－EM18 5－TGAGTCCAAACCGGTAA－3 5－GACTGCGTACGAATTATG－3
ME8－EM2 5－TGAGTCCAAACCGGTCC－3 5－GACTGCGTACGAATTCAG－3
ME8－EM12 5－TGAGTCCAAACCGGTCC－3 5－GACTGCGTACGAATTTCA－3
ME8－EM15 5－TGAGTCCAAACCGGTCC－3 5－GACTGCGTACGAATTCTG－3
ME8－EM16 5－TGAGTCCAAACCGGTCC－3 5－GACTGCGTACGAATTGTT－3
ME11－EM10 5－TGAGTCCAAACCGGTAG－3 5－GACTGCGTACGAATTGAG－3
ME11－EM17 5－TGAGTCCAAACCGGTAG－3 5－GACTGCGTACGAATTACG－3
1． 4 数据分析
根据扩增电泳谱带结果，选择易于辨认的条带，
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
林业科技开发 2013 年第 27 卷第 6 期 19
在相同迁移率上按条带有(1)和无(0)记录，构成原
始数据矩阵。用 POPGENE 1． 32 统计:多态性位点数
NPL、多态位点百分率 PPL、等位基因数 Na、有效等位
基因数 Ne(Ne = 1 /∑Pi
2，Pi 为第 i 个等位基因出现
变异的频率) ;Nei’s 基因多样性指数 H(H = 1 －∑
Pik
2，Pik为第 i 个等位基因在所有基因中出现的频
率) ;Shannon’s信息指数 I(I = － ∑(Pi × lnPi) ，Pi
为第 i个等位基因的频率) ;Nei’s遗传一致度 GS(GS
= 2Nij /Ni + Nj，Nij为样品 i 和 j 共有位点数，Ni 和 Nj
分别为样品 i 和样品 j 的总位点数)和遗传距离 GD
(GD = － ln(GS) ) ;总遗传多样性 HT、群体内的遗传
多样性 HS，并应用 Nei’s 基因多度法计算遗传分化
系数 Gst = Dst /HT，其中 HT = HS + Dst，Dst为群体间遗
传多样性;计算反映基因流强度的群体每代迁移数
Nm［Nm = 0． 5(1 － Gst)/Gst］;利用 NTSYS pc version
2． 10e软件，根据 Nei’s 遗传相似系数采用 UPGMA
方法进行聚类，绘出聚类分析树状图［7］。
2 结果与分析
2． 1 SＲAP引物对三桠乌药的扩增多态性
用筛选出的 16对引物对供试三桠乌药 65 份样品
进行扩增(表 3) ，共扩增出 174 个位点，其中多态性位
点 142个，多态性位点百分率为 81． 61%，说明山东省
三桠乌药存在丰富的遗传多样性。每对引物产生的位
点数为 6 ～ 15，多态性位点数为 6 ～ 13，平均每对引物
产生 10． 88个位点和 8． 88 个多态性位点。其中，引物
组合 ME1－EM7 和 ME2－EM18 产生的多态性位点比
率最高，为 100%;ME2 －EM18 的 H 和 I 值都最高;
ME4－EM7 产生的多态位点比率最低，为 46． 15%。
表 3 SＲAP引物组合扩增三桠乌药 DNA的多态位点数
引物组合 总位点
多态
位点数
多态比率 /
%(PPL)
Nei’s基因多样
性指数(H)
Shannon’s
信息指数(I)
ME1－EM7 6 6 100． 00 0． 229 1 0． 377 0
ME2－EM18 13 13 100． 00 0． 328 0 0． 487 6
ME2－EM2 14 13 92． 86 0． 315 9 0． 474 5
ME2－EM11 8 4 50． 00 0． 134 5 0． 207 5
ME2－EM14 6 5 83． 33 0． 147 3 0． 243 7
ME4－EM7 14 6 46． 15 0． 227 2 0． 364 4
ME4－EM15 12 11 97． 67 0． 327 1 0． 483 5
ME5－EM10 8 5 62． 50 0． 263 8 0． 381 7
ME5－EM14 12 11 91． 67 0． 274 7 0． 417 9
ME5－EM18 12 9 75． 00 0． 286 8 0． 415 0
ME8－EM2 11 7 63． 64 0． 230 9 0． 3373
ME8－EM12 15 13 86． 67 0． 311 9 0． 465 9
ME8－EM15 14 12 85． 71 0． 274 6 0． 420 8
ME8－EM16 12 8 66． 67 0． 245 3 0． 358 0
ME11－EM10 10 7 70． 00 0． 209 5 0． 325 3
ME11－EM17 8 6 75． 00 0． 065 1 0． 122 6
Average 10． 88 8． 88 81． 61 0． 241 8 0． 367 7
2． 2 三桠乌药居群遗传多样性
在物种水平上，多态位点百分率(PPL)为
81． 61%，H值为 0． 254 8，I值为 0． 385 2，说明山东省
三桠乌药具有较高的遗传多样性。在居群水平上，多
态位点百分率(PPL)为 42． 82%，H 值为 0． 063 6 ～
0． 258 3，I值为 0． 091 6 ～ 0． 385 3(表 4)。各居群遗
传多样性由高到低依次为崂山、蒙山、塔山、徂徕山。
表 4 三桠乌药 4 个居群的遗传多样性
居群
多态位点
比率 /% 等位基因
有效等位
基因数
Nei’s基因多样
性指数(H)
Shannon’s
信息指数(I)
崂山 77． 01 1． 770 1 1． 448 3 0． 258 3 0． 385 3
蒙山 56． 32 1． 563 2 1． 317 8 0． 186 6 0． 281 3
塔山 22． 99 1． 229 9 1． 159 2 0． 089 5 0． 131 4
徂徕山 14． 94 1． 149 4 1． 116 1 0． 063 6 0． 091 6
居群水平 42． 82 1． 428 2 1． 260 5 0． 149 5 0． 222 4
物种水平 81． 61 1． 816 1 1． 431 5 0． 254 8 0． 385 2
2． 3 居群遗传结构与遗传一致度分析
对三桠乌药 4 个自然居群的遗传结构分析表明，
总基因多样度(Ht)为 0． 218 9，其中居群内(Hs)为
0． 149 5，居群间(Dst)为 0． 069 4，居群内基因多样度
明显高于居群间。居群间遗传分化系数(Gst)为
0． 317 1，表明有 31． 71%的遗传变异存在于居群间，
68． 29%的遗传变异存在于居群内，因此居群内遗传
分化远高于居群间。在居群遗传学研究中，将基因流
划分为为高(≥1． 0)、中(0． 25 ～ 0． 99)、低(0 ～
0． 249)3 个等级水平［8］，三桠乌药各居群间基因流
(Nm)大小为 1． 076 8，表明居群间有较强的基因流。
为进一步分析三桠乌药居群的遗传结构，用
POPGENE软件统计三桠乌药各居群间的 Nei’s遗传
距离 GD 和遗传一致度 GS。4 个居群间遗传距离 GD
为 0． 058 4 ～ 0． 159 0，遗传一致度 GS 为 0． 853 0 ～
0． 943 3。其中蒙山与崂山居群的遗传距离为
0． 058 4，是 4 个居群间的最小值，说明两者具有最高
的遗传一致度，但在地理位置上距离最远;相反，蒙山
与塔山地理距离最近，但遗传一致度反比蒙山与崂山
的低。这说明三桠乌药居群间的遗传距离和地理位
置间没有直接相关性。
2． 4 聚类分析
UPGMA聚类结果(图 1)显示，徂徕山居群 63 和
64 号样品遗传相似度最高，为 0． 97;崂山居群 17 和
30 号样品相似度最低，为 0． 754。在相似系数为 0． 8
时所有样品可以分为 5 大类:第Ⅰ大类包含 55 个样
品，来自崂山、蒙山、塔山和徂徕山 4 个居群;第Ⅱ、Ⅲ
大类均含 4 个样品，第Ⅳ、Ⅴ大类均仅 1 个样品，全部
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 应用研究
20 林业科技开发 2013 年第 27 卷第 6 期
来自崂山。第Ⅰ大类在相似系数为 0． 82 处又可分为
3 个亚类，除崂山样品外，来自同一居群的样品优先
聚在一起。
由聚类图可看出，崂山居群的样品分布在 5 个大
类中，而且有 4 个大类中的样品全部来自崂山，这反
映出崂山居群丰富的遗传多样性。
注:1 ～ 39:崂山;40 ～ 57:蒙山;58 ～ 61:塔山;62 ～ 65:徂徕山
图 1 65 份三桠乌药遗传相似系数的 UPGMA聚类图
3 讨 论
在物种水平上三桠乌药的多态位点百分率为
81． 6%，樟科其他植物如乌药为 80． 0%［9］，厚壳桂为
88． 1%［10］，表明三者多态性水平相当，三桠乌药与其
他樟科植物都有较高的遗传多样性。
三桠乌药为异花授粉植物，居群内的遗传分化远
高于居群间。居群间遗传分化系数(Gst)为0． 317 1，低
于云南红豆杉的 0． 333［11］和多叶重楼的0． 362 5［12］，
高于腊梅的 0． 172 5［13］和樟树的0． 285 5［14］。这与
Hamrick和 Goldt提出的大范围连续分布的异交植物
的遗传变异大部分存在于居群内［15］的结论一致。
在居群水平上，徂徕山的遗传多样性最低，应与
其居群较小有关。该地三桠乌药为近年发现的新分
布地点，个体数量有限。而对于有限居群而言，即使
随机交配也会造成一部分等位基因的纯合，其结果必
定是居群的纯合性增加，杂合性比率减少，等位基因
的随机消失，造成遗传多样性信息的降低［16］。
崂山居群的遗传多样性最为丰富，可能与三桠乌
药的生境类型复杂多样有关。崂山较山东省其他地
区拥有更为优越和复杂的气候条件、地理环境和植被
类型，南坡和北坡气候迥异，土壤类型多样，群落植物
组成上南坡拥有较多的亚热带成分，而北坡则以长白
区系成分为主。由此可以推测崂山三桠乌药居群丰
富的遗传多样性是对崂山复杂的生态环境长期适应
的结果。
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( 责任编辑 史 洁)
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗