全 文 ：2010 , Vol.27 No.4化学与生物工程
Chemistry &Bioengineering48　
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(5300953)
收稿日期:2009-12-31
作者简介:巩育军(1955-),男 ,陕西西安人 , 教授 ,研究方向:应用化学。 E-mail:mmgy j95@sohu.com。
溪黄草黄酮在聚乙二醇/磷酸钠双水相
体系分配行为的研究
巩育军 ,薛元英 ,刘杰凤 ,罗振清
(茂名学院化学与生命科学学院 ,广东 茂名 525000)
　　摘　要:利用分光光度法研究了溪黄草黄酮在聚乙二醇/磷酸钠双水相体系的分配行为 , 探讨了质量配比(mPEG/
mNa3 PO4)、温度和溪黄草黄酮浓度对双水相及萃取率的影响。结果表明 ,在一定的温度和浓度下 , 随着 mPEG/ mNa3 PO4的增
大 ,萃取率上升;在一定的质量配比和浓度下 , 当 mPEG/ mNa3 PO4 ≤1.50 时 , 萃取率随温度的升高显著降低;当 mPEG/
mNa
3
PO
4
≥2.50 时 , 萃取率基本保持不变;在一定的质量配比和温度下 , 溪黄草黄酮浓度对分配系数 K(cU/ cL)和萃取率
基本没有影响。在 mPEG/mNa3PO4 =3.00 、T=60℃时 ,平均萃取率可达 76.69%。
关键词:溪黄草黄酮;聚乙二醇;双水相;萃取率
中图分类号:TQ 91　R 284　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1672-5425(2010)04-0048-03
　　近年来 ,由于双水相萃取技术在微生物 、有机化合
物等的分离和纯化 、预浓集过程中表现出相当好的性
能 ,并有望用于大规模提取和纯化生物活性物质 ,因此
越来越受到人们的关注和重视[ 1 ～ 5] 。我国粤西地区盛
产的中草药溪黄草 ,性味苦凉 ,具有清肝热 、利湿毒 、明
双目 、健脾活血和抗癌等功效 ,临床可用于治疗肝胆湿
热 、脾失健运所致的胁胀疼痛 、食欲不振等症 ,对眼赤
目痛 、肠胃消化不良亦有较好疗效。溪黄草主要含有
黄酮类化合物 、二萜化合物等[ 6 , 7] 。
作者在此研究了溪黄草黄酮在聚乙二醇/磷酸钠
双水相体系的分配行为 ,探讨了聚乙二醇和磷酸钠的
用量 、温度 、溪黄草黄酮浓度等对双水相及萃取率的影
响 ,为黄酮类化合物的提纯和富集提供了一些有意义
的信息。
1　实验
1.1　材料 、试剂与仪器
溪黄草 ,购于茂名市医药公司 。
聚乙二醇 4000 、磷酸钠 、结晶氯化铝 、无水乙酸
钠 、乙醇(95%)等 ,均为分析纯。
WFZ-26A型紫外分光光度计 ,天津市光学仪器厂。
1.2　方法
1.2.1　溪黄草黄酮提取液的制备[ 8]
称取一定量干燥的溪黄草粉末 ,在索氏抽提器中
用石油醚脱脂至无色 ,冷却后蒸出石油醚 ,加入一定量
的 75%乙醇抽提至无色 ,即得溪黄草黄酮提取液。将
提取液全部移至 100 mL 容量瓶 ,备用。
1.2.2　样品溶液的制备
取溪黄草黄酮提取液 5 mL 于 50 mL 容量瓶中 ,
加入 5 mL 0.1 mol·L -1 AlCl3 溶液和 7.5 mL 1 mo l
·L-1 NaA c溶液 ,用 75%乙醇稀释至刻度 ,即得样品
溶液 。
1.2.3　双水相的配制
称取一定量的磷酸钠于比色管中 ,加入 15 mL
0.05 mo l·L-1 PEG4000 水溶液 ,在一定的温度下溶
解静置 ,形成双水相 。
1.2.4　分配行为的研究
用移液管移取 3 mL 样品溶液加入到聚乙二醇/
磷酸钠双水相体系中 ,搅拌均匀 ,静置分层 ,待分配达
平衡后 ,分别吸取上下相溶液 ,用紫外分光光度计测定
其在 420 nm 的吸光度[ 9] 。根据吸光度的比值 ,按下
式计算溪黄草黄酮在双水相体系中的分配系数(K)和
溪黄草黄酮的萃取率(Y)。
R=V U/V L
K =cU/ cL
Y =cUVU/(cUVU +cLVL)
式中:R 为相体积比;V U 、VL 分别为上下相体积;
cU 、cL 分别为溪黄草黄酮在上下相的浓度 。
巩育军等:溪黄草黄酮在聚乙二醇/磷酸钠双水相体系分配行为的研究/ 2010 年第 4 期 49　
2　结果与讨论
2.1　质量配比(mPEG/mNa
3
PO
4
)对双水相萃取溪黄草黄
酮的影响(表 1)
表 1 质量配比(mPEG/mNa3 PO4)对溪黄草黄酮萃取的影响
Tab.1 　Effect of mass ratio(mPEG/mNa
3
PO
4
)on extraction
of flavones from Rabdosia serra (Maxim)Hara
T/ ℃ mPEG/mNa3 PO4 R K Y/ %
1.50 1.39 1.23 63.09
1.36 1.21 1.28 60.77
50
1.25 1.05 1.26 56.95
1.15 0.94 1.29 54.80
1.50 1.16 1.27 59.57
1.36 0.98 1.27 55.44
60
1.25 0.90 1.28 53.53
1.15 0.83 1.33 52.47
1.50 1.02 1.29 56.82
1.36 0.90 1.41 55.93
70
1.25 0.83 1.18 49.48
1.15 0.75 1.23 47.98
注:溪黄草黄酮浓度为 1.8×10-4 g·mL-1
由表 1可以看出:
(1)在一定温度下 ,溪黄草黄酮的分配系数 K 均
大于 1。这是因为溪黄草黄酮是具有 α-或 β-苯基苯稠
吡喃酮的强疏水性物质 ,由于“相似相溶原理” ,它较多
地分配在富含 PEG4000 的强疏水性上相中[ 10] ,因此
其 K 大于 1。
(2)随着磷酸钠相对含量的增加(即 mPEG/mNa
3
PO
4
的减小),相体积比 R 逐渐下降 ,这和文献[ 10] 、[ 11]
结论一致 。这是因为强电解质磷酸钠在水中离解为正
负离子之后 ,由于有较强的形成水合离子的能力 ,从而
部分夺取因“范德华引力”受聚乙二醇的醚键氧束缚的
水分子之故。
(3)在一定温度下 ,溪黄草黄酮的分配系数 K 基
本上随着磷酸钠相对含量的增加而上升 。这与文献
[ 12]结论一致。这是由于磷酸钠的盐析作用部分夺取
聚乙二醇的醚键氧的“束缚水”之后 ,使得聚乙二醇分
子排列更为整齐和紧密 ,熵值减少 ,疏水性更强 ,更有
利于溪黄草黄酮分配之故 。70℃时的某些反常情况 ,
可能与接近双水相分相“浑浊点”80℃有关[ 12] 。
(4)溪黄草黄酮萃取率Y 随着磷酸钠相对含量的
减少(即 mPEG/mN a
3
PO
4
的增加)而上升 ,这是相体积比R
逐渐增大和溪黄草黄酮分配系数 K 逐渐减小的综合
效应 ,由此可见 ,R 增大的效应占优。
2.2　温度对双水相萃取溪黄草黄酮的影响(表 2)
表 2 温度对溪黄草黄酮萃取的影响
Tab.2 Effect of temperature on extraction of flavones from Rabdosia serra (Maxim)Hara
mPEG/mNa3PO4 T/ ℃ R K Y/ % mPEG/mNa3 PO4 T/ ℃ R K Y/ %
1.50 50 1.66 1.41 70.07 3.33 50 2.10 1.26 64.00
70 1.16 1.10 56.06 70 1.50 1.28 62.46
1.36 50 1.33 1.39 64.89 3.00 50 1.50 1.06 61.38
70 1.00 1.11 52.61 70 1.18 1.21 58.81
1.25 50 1.16 1.45 62.71 2.73 50 1.41 1.02 55.48
70 0.90 1.18 51.50 70 1.04 1.55 54.22
1.15 50 1.07 1.20 56.22 2.50 50 1.21 1.03 51.13
70 0.80 1.15 47.92 70 0.94 1.06 49.82
注:溪黄草黄酮浓度为 9.0×10-5g·mL-1
　　由表 2可以看出:
(1)在相同 mPEG/mNa3PO4和溪黄草黄酮浓度下 ,相
体积比 R 随着温度的升高而下降 。这主要是因为温
度升高时 ,PEG 在水中的溶解度增加 , PEG分子部分转
移到富含水的下相 ,导致上相体积减小 、下相体积增大 。
(2)溪黄草黄酮的分配系数 K 在m PEG/mNa
3
PO
4
≤
1.50时 ,随温度的升高而下降;而在 mPEG/mNa
3
PO
4
≥
2.50时 ,却随温度的升高而上升 。这是因为温度升高
时 ,体系粘度减小 ,扩散系数增大 ,由浓度差所推动的
“扩散作用”增强 ,溪黄草黄酮在上下相的浓度趋于相
等 ,导致K 降低而趋于1;另一方面 ,温度升高 ,分子的
热运动加剧 ,溪黄草黄酮脱离亲水性强的下相而进入
疏水性强的上相概率增加 ,同时 PEG醚键氧束缚水的
能力下降 ,疏水作用更强 ,导致溪黄草黄酮在上相的浓
度增加 ,K 升高。质量配比不同时的分配系数变化规
律是两方面作用综合的结果。
(3)在 mPEG/mNa
3
PO
4
≤1.50时 ,萃取率Y 随温度的
升高显著降低 ,这是相体积比 R 和分配系数K 都下降
巩育军等:溪黄草黄酮在聚乙二醇/磷酸钠双水相体系分配行为的研究/2010 年第 4 期50　
的加合效应的结果;而在 mPEG/mNa
3
PO
4
≥2.50时 ,温度
升高萃取率Y 变化很小 ,这是相体积比 R 下降和分配
系数K 上升的相消效应的结果。
2.3　溪黄草黄酮浓度对溪黄草黄酮萃取的影响(表 3)
表 3 溪黄草黄酮浓度对溪黄草黄酮萃取的影响
Tab.3 Ef fect of concentration on extraction of flavones fromRabdosia serra(Maxim)Hara
mP EG/mNa
3
PO
4 T/ ℃
c黄酮
×10-4 g·mL -1 R K Y/ %
mPEG/mNa
3
PO
4 T/ ℃
c黄酮
×10-4 g·mL-1 R K Y/%
0.9 1.16 1.45 62.71 0.9 1.50 1.06 61.38
1.25 50 1.2 1.07 1.40 59.92 3.00 50 1.2 1.57 1.26 61.33
1.8 1.05 1.26 56.95 1.8 1.50 1.19 64.09
0.9 1.09 1.24 54.97 0.9 2.72 1.35 78.60
1.25 60 1.2 1.00 1.23 55.16 3.00 60 1.2 2.65 1.23 76.52
1.8 0.90 1.28 53.53 1.8 2.44 1.22 74.85
0.9 0.90 1.18 51.50 0.9 1.18 1.43 62.46
1.25 70 1.2 0.85 1.21 50.70 3.00 70 1.2 0.90 1.34 54.67
1.8 0.83 1.18 49.48 1.8 1.02 1.33 50.74
　　由表 3可以看出:
(1)在相同 mPEG/mNa
3
PO
4
和温度下 ,随着溪黄草黄
酮浓度的升高 ,相体积比 R 逐渐下降 。这是由于溪黄
草黄酮是强疏水性的物质 ,有较强的吸附 、加溶或排布
在非离子型表面活性剂 PEG 周围区域的趋势 ,以促进
Gibbs自由能降低 、体系稳定。溪黄草黄酮的加入 ,必
然会改变或破坏上相 PEG的较为有序的状态 ,使上相
物质相互之间的疏水作用 、加溶作用 、静电作用等发生
了改变 ,部分 PEG转入下相 ,从而导致上相体积减小 、
下相体积增大[ 2] 。
(2)在相同 mPEG/mNa3PO4和温度下 ,分配系数 K 基
本是一个常量 ,差别最大是在 mPEG/mNa
3
PO
4
=3.00 、T
=70℃时 ,其■K/K = 7.3%。这一结果符合 Bron-
sted所提出的统计势力学公式[ 13] 。
(3)在 mPEG/mNa3PO4较大 、温度较高的条件下 ,溪
黄草黄酮萃取率较高 ,如在 mPEG/mN a
3
PO
4
为 3.00 、温度
为 60℃时 ,平均萃取率为 76.69%。
3　结论
利用分光光度法研究了溪黄草黄酮在聚乙二醇/
磷酸钠双水相体系的分配行为 。结果表明 ,在一定的
温度和溪黄草黄酮浓度下 ,随着 mPEG/mNa3PO4的增大 ,
萃取率上升;在一定的质量配比和浓度下 ,当 mPEG/
mNa
3
PO
4
≤1.50 时 ,萃取率随温度的升高显著降低;当
mPEG/mN a
3
PO
4
≥2.50时 ,萃取率基本保持不变;在一定
的质量配比和温度下 ,溪黄草黄酮浓度对分配系数 K
(cU/cL)和萃取率基本没有影响 。在 mPEG/mN a
3
PO
4
=
3.00 、T =60℃时 ,平均萃取率可达 76.69%。
参考文献:
[ 1] 　巩育军 ,朱 瑶 ,赵国玺.DT AB-月桂酸钠体系表面活性剂双水相
研究[ J] .物理化学学报 , 2001 , 17(11):1027-1030.
[ 2] 　巩育军 ,薛元英 ,李东升 ,等.丝裂霉素在表面活性剂双水相中的
分配规律[ J] .应用化学 , 2000 , 17(6):657-659.
[ 3] 　周红航 ,王维香.聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取猪胰蛋白酶
[ J] .化工进展 , 2009 , 28(2):305-308.
[ 4] 　Chethana S , Nayak C A , Raghavarao K S M S.Aqueous tw o
p hase ext raction for purifi cation and concent ration of betalains
[ J] .Journal of Food Engin eering , 2007 , 81(4):679-687.
[ 5] 　Babu B R , Rastogi N K , Ragh avarao K S M S.Liquid-liquid ex-
t ract ion of bromelain and polyphenol oxidase usin g aqueous tw o-
phase sys tem[ J] .C hemical E ngineering and Processing , 2008 , 47
(1):83-89.
[ 6] 　中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[ M ] .
北京:化学工业出版社 , 1985:826.
[ 7] 　居学海 ,翟宇峰 ,翟锦库 ,等.溪黄草中三种活性组分的电子结构与
抗癌活性[ J] .郑州大学学报(自然科学版), 1997 , 29(3):80-86.
[ 8] 　黎或 ,吴志谊 , 吴川 ,等.可见光及紫外光分光光度法测定溪黄草
总黄酮[ J] .精细石油化工 , 2006 , 23(1):51-53.
[ 9] 　程昆木 ,王斌 ,曾伟芹 ,等.刺五加总黄酮含量的分析[ J] .人参研
究 , 2006 , 18(2):17-19.
[ 10] 　赵晓莉 ,岳红 , 张颖 ,等.柿叶黄酮在双水相体系中的分配行为
[ J] .林产化学与工业 , 2006 , 26(1):83-86.
[ 11] 　张春秀 ,胡小玲 ,卢锦花 ,等.双水相萃取法富集分离银杏叶浸取
液的探讨[ J] .化学研究与应用 , 2001 , 13(6):686-688.
[ 12] 　杜振宁 ,胡卓逸.聚乙二醇双水相体系在分离纯化蛋白质中的应
用[ J] .中国医药工业杂志 , 1990 , 21(10):468-471.
[ 13] 　Alberts son P A.Parti ti on of Cel l Part icles and Macrom olecu les
[ M ] .New York:Wiley In terscienece Divi sion , 1971:14-15.
(下转第 56页)
刘洁丽等:一株纤维素降解细菌的筛选 、鉴定及特性研究/2010 年第 4 期56　
　　由图 4可以看出 ,菌株 L13在 pH 值 5.0时产酶
效果最好 ,CMCase酶活最高达到5.21 U ·mL-1 。这
可能是因为 ,偏酸性的环境是菌种的适宜生长条件 。
3　结论
(1)应用 PCR扩增 、16S rDNA 测序及序列分析
等技术 ,初步鉴定纤维素降解细菌为枯草芽孢杆菌 。
(2)在 50℃、pH值为5.0的条件下 ,菌株 L13产酶
效果最好 ,酶活最高达到 5.21 U· mL-1 。说明枯草芽
孢杆菌对纤维素有较好降解能力 ,在处理农村大量秸秆
和城市有机废弃物方面有非常广阔的应用前景。
参考文献:
[ 1] 　蔡燕飞 ,李华兴 ,彭桂香 ,等.纤维素分解菌的筛选及鉴定[ J] .林
　　 产化学与工业 , 2005 , 25(2):67-70.
[ 2] 　李日强 ,王爱英 ,孔令冬.一株纤维素分解菌的分离选育[ J] .山西
大学学报(自然科学版), 2006 , 29(3):317-320.
[ 3] 　QB 2583-2003 ,纤维素酶制剂[ S] .
[ 4] 　安明泉.纤维素降解菌的筛选分离与产纤维素酶的特性研究[ D] .
北京:中国石油大学(北京), 2008.
[ 5] 　叶姜瑜.一种纤维素分解菌鉴别培养基[ J ] .微生物通报 , 1997 ,
24(4):251-252.
[ 6] 　Teather Ronald M ,Wood Peter J.Use of Congo red-polysaccha-
ride interact ions in enumerat ion and characterization of celluloly tic
b acteria f rom the bovine rumen [ J] .Appl Envi ron Microbiol ,
1982 , 43(4):777-780.
[ 7] 　刘秋云 ,罗樨 ,何康泽 ,等.快速制备酵母质粒和基因组 DNA PCR
模板[ J] .微生物学通报 , 2001 , 28(5):77-84.
Screening , Identif ication and Characterization of A Cellulose-Degrading Bacterium
LIU Jie-li , WANG Jing , LI Ming
(S chool o f Chem ical Science &Engineering , China Universi ty o f Petroleum , Bei j ing 102249 , China)
Abstract:O ne st rain which w as capable of producing cel lulase , was f irst isolated f rom w o rmy lemon w i th
CMC-Na as the so le carbon source.The bacterium was identified as Baci llus subt i lis by mo rpholo gical and 16S
rDNA sequence , and w as named L13.In order to obtain the best conditions for cellulase production , the ef fects
of temperature and initial pH value on the cellulase production w ere studied.The results showed that the maxi-
mum enzyme act ivity of CMCase reached 5.21 U ·mL -1 at optimum conditions of 50℃, pH value 5.0.The re-
sults w ill expand the scope o f the screening and applicat ion of cellulo se-deg rading m icro organisms.
Keywords:cellulase;deg radation;CMC-Na;enzyme activity ;Baci l lus subt i li s
(上接第 50页)
Partitional Behaviors of Flavones from Rabdosia Serra (Maxim)Hara
in PEG/Phosphate Aqueous Two-Phase System
GONG Yu-jun , XUE Yuan-ying , LIU Jie-feng , LUO Zhen-qing
(Chemistry and Li fe Science Insti tute , Maoming College , Maoming 525000 , China)
Abstract:Partit ional behaviors of f lavone s f rom Rabdosia serra (Maxim )Hara in PEG/phosphate aqueous
tw o-phase sy stem we re studied by spect rophotometry.Effects of mass ratio(m PEG/mN a
3
PO
4
), temperature and
concentration o f flavones f rom Rabdosia serra (Maxim )Hara on the aqueous two-phase sy stem and the ex t rac-
tion rate w ere invest igated.The experiments resul ts show ed that the ext ract ion rate of the f lavones w as in-
creased w ith mPEG/mNa
3
PO
4
under a certain temperature and concentration;under a certain mPEG/mNa
3
PO
4
and con-
centration , the ext ract ion rate of the f lav ones w as obviously decreased wi th temperature w hen mPEG/mNa
3
PO
4
≤
1.50 , and w as nearly unchanged when mPEG/mN a3 PO4 ≥ 2.50;unde r a cer tain mPEG/mNa3 PO 4 and temperature , the
ext ract ion rate of the flavones w as also nearly unchanged w ith concentration o f the f lavone s , and the ext raction
rate of the flavones reached 76.69%when mPEG/mN a
3
PO
4
=3.00 and T =60℃.
Keywords:flavones f rom Rabdosia serra (Maxim )Hara;poly ethylene g lycol(PEG);aqueous tw o-phase
sy stem ;ex t raction rate