全 文 ：实验设计-响应面法优化大叶当归中阿魏酸的闪式提取工艺
许代福， 方应权*
(重庆三峡医药高等专科学校，重庆 万州 404020)
收稿日期:2013-08-22
基金项目:重庆市教委自然科学基金项目 (kt121805)
作者简介:许代福 (1979—)，男，硕士，讲师，主要从事中医临床药物的应用与开发研究。Tel:13996580576，E-mail:xudaifu1026@
126． com
通信作者:方应权 (1973—)，男，硕士，副教授，主要从事中草药资源开发与应用研究。Tel:13594468289，E-mail:862120258@
qq． com
摘要:目的 优选大叶当归中阿魏酸的闪式提取工艺。方法 采用 Box-Behnken 实验设计，结合响应面法，以阿魏酸
得率为响应值，考察影响闪式提取的主要因素，并与传统的提取方法进行比较。结果 闪式提取的最佳工艺为:用
13 倍 (m/v)64%乙醇，提取时间 100 s。在上述条件下，阿魏酸平均得率为 0. 029 2%，这一结果与模型预测值符合
良好。结论 闪式提取法提取得率高、操作简便，可用作大叶当归的开发利用。
关键词:闪式提取;大叶当归;阿魏酸;实验设计;响应面
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2014)02-0422-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 02. 050
当归为伞形科植物当归 Angelica sinensis (Oliv．)Diels
的干燥根，具有调经止痛，活血补血的功效［1］。大叶当归
(A． megaphylla)是我国特有的伞形科当归属植物，分布于
四川等地，在三峡库区的巫溪、巴东、石柱和巫山等地区
尤为常见，当地民间常用作当归的代用品。本品含有与正
品当归相同的藁本内酯、挥发油、阿魏酸等活性成分［2-3］。
阿魏酸 (ferulic acid)作为大叶当归的主要活性成分之一，
具有抑制血小板聚集、抗血栓、抗心肌缺血、抗氧化，抗
癌等作用。此外，阿魏酸在食品、医药、化妆品及添加剂
等领域均有广泛的用途［4-6］。阿魏酸的传统提取方法包括渗
漉法［7］、乙醇回流法［8］和超声提取法［9］等。这些方法存在
能量消耗大、所需溶剂多，操作时间长等缺点。现代提取
方法如超临界 CO2 萃取法
［7］、加速溶剂萃取法［10］以及微波
辅助提取法［11］等用于提取当归中的阿魏酸也已见文献报
道，但这些方法也存在设备成本高，能耗大等缺点。
闪式提取法，又名组织破碎提取法，是近年来发展起
来的一种新型提取技术，具有高效、迅速和节能等优
点［12-13］，该方法利用高速剪切力和超分子渗滤技术在短时
间内将药材粉碎至细微颗粒，使药材中有效成分迅速达到
溶解平衡，从而实现高效提取。本实验首次采用实验设计
结合响应面法优选闪提法提取大叶当归中阿魏酸的工艺条
件，并与传统的提取方法进行比较。
1 仪器与材料
Agilent 1200 系列高效液相色谱仪，Agilent ChemStation
B． 04. 02 工作站 (美国安捷伦公司);JHBE-50S 型中草药
闪式提取器 (河南金鼎科技发展有限公司);ＲE 52-86A 旋
转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);Millipore simplicity-185
超纯水器 (美国密里博公司);Sartorius BS110S 分析天平
(北京赛多利天平有限公司)。
大叶当归，采自巫溪大宁河畔 1 500 米高山上，由三
峡中药研究所付绍智教授鉴定为 A． megaphylla 的根。阿魏
酸对照品 (中国食品药品检定研究院提供，批号 110773-
200611);甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 大叶当归中阿魏酸测定方法 参考文献［1，14］，测
定大叶当归中阿魏酸的量。色谱条件为:安捷伦 SB C18高
效液相色谱柱 (150 mm × 4. 6 mm，5 μm);以甲醇-水-磷
酸 (30 ∶ 70 ∶ 0. 3)为流动相;检测波长为 316 nm;体积流
量为 1. 0 mL /min;柱温 35 ℃;进样量 20 μL;在 1. 98 ～
99. 00 μg /mL范围内阿魏酸质量浓度与峰面积呈线性关系
(r = 0. 999 9);精密度 ＲSD ＜ 0. 96%;平均加样回收率为
97. 26%，ＲSD为 1. 75%。
2. 2 实验设计
2. 2. 1 考察因素和水平的确定 参考相关文献报道及前期
预试验结果［9-11，15］，采用甲醇或乙醇提取当归中阿魏酸的
效果较好，考虑安全因素，本研究选用乙醇为溶剂，并保
持粉末粒径为粗粉，闪提工作电压 120V，考察乙醇体积分
数、乙醇体积 (液料比)和提取时间对提取得率的影响。
取干燥大叶当归根茎，干燥，制成粗粉 (20 目)，称
取 20 g，进行闪式提取，提取完成后过滤提取液，滤液加
70%甲醇-盐酸 (100 ∶ 1)稀释至 500 mL，密塞，称定质
量，加热回流 30 min，放冷，再称定质量，用 70%甲醇-盐
酸 (100 ∶ 1)补足质量，摇匀，静置，取上清液，以
0. 45 μm孔径滤膜滤过，按“2. 1”项测定阿魏酸的含有
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量，以阿魏酸得率作为考察指标，采用单因素法考察乙醇
体积分数、料液比和提取时间对闪式提取的影响。结果显
示，当 15 倍量 (v /m)65%乙醇提取时间 80 s时，闪式提
取大叶当归中阿魏酸得率较高。
2. 2. 2 Box-Behnken实验设计及响应面分析 选取影响闪
式提取工艺的三个因素，即乙醇体积分数 (x1) ，乙醇体积
倍数 (x2) ，提取时间 (x3)为考察因素，以阿魏酸得率
(Y)为响应值，进行 Box-Behnken试验，各因素取 3 水平，
分别记为 －，0， +，各因素和水平编码及实际值见表 1，
实验方案及结果见表 2。
表 1 Box-Behnken试验因素水平
因素
水平
－ 0 +
乙醇体积分数 (x1) /% 60 65 70
乙醇体积倍数 (x2) 12 15 18
提取时间 (x3) / s 60 80 100
表 2 Box-Behnken试验结果
编
号
模式
(x1 x2 x3)
乙醇体积分
数 (x1) /%
乙醇倍数
(x2)
提取时间
(x3) / s
得率 (Y)
/ (%)
1 － 0 + 60 15 100 0. 026 1
2 + 0 － 70 15 60 0. 021 0
3 + － 0 70 12 80 0. 017 1
4 0 + + 65 18 100 0. 029 9
5 － + 0 60 18 80 0. 019 2
6 000 65 15 80 0. 025 9
7 + + 0 70 18 80 0. 025 5
8 － 0 － 60 15 60 0. 017 1
9 000 65 15 80 0. 025 0
10 0 － － 65 12 60 0. 011 5
11 —0 60 12 80 0. 012 1
12 + 0 + 70 15 100 0. 029 2
13 0 + － 65 18 60 0. 027 1
14 000 65 15 80 0. 025 9
15 0 － + 65 12 100 0. 028 9
采用 Design Expert 7. 0. 0 (Stat-Ease Inc． Minneapolis)
软件对表 2 中不同试验条件下所得到的阿魏酸收率进行回
归分析，得拟合方程:
Y = β0 + β1 x1 + β2x2 + β3x3 + β12 x1x2 + β13x1x3
+ β23x2x3 + β11x1
2 + β22x2
2 + β33x3
2 (1)
其中 Y为响应值，βi代表不同的回归系数，应用统计
分析软件 Design Expert 7. 0. 0 对数据进行多元回归和方差
分析，结果如表 3 所示。
表 3 Box-Behnken实验设计方差分析
Source 平方和 自由度 均方 F P值 (P ＞ F)
Model 5. 09 × 10 － 4 9 5. 65 × 10 － 4 68. 45 0. 000 1*
x1-乙醇体积分数 4. 19 × 10 － 5 1 4. 19 × 10 － 5 50. 71 0. 000 8*
x2-乙醇倍数 1. 29 × 10 － 4 1 1. 29 × 10 － 4 156. 03 ＜ 0. 000 1*
x3-提取时间 1. 75 × 10 － 4 1 1. 75 × 10 － 4 211. 80 ＜ 0. 000 1*
x1 x2 4. 23 × 10 － 7 1 4. 23 × 10 － 7 0. 51 0. 506 4
x1 x3 1. 60 × 10 － 7 1 1. 60 × 10 － 7 0. 19 0. 678 1
x2 x3 5. 33 × 10 － 5 1 5. 33 × 10 － 5 64. 55 0. 000 5*
x12 6. 09 × 10 － 5 1 6. 09 × 10 － 5 73. 82 0. 000 4*
x22 3. 46 × 10 － 5 1 3. 46 × 10 － 5 41. 95 0. 001 3*
x32 1. 21 × 10 － 5 1 1. 21 × 10 － 5 14. 69 0. 012 2*
Lack of Fit 3. 59 × 10 － 6 3 1. 20 × 10 － 6 4. 43 0. 189 7
注:* P ＜0. 05，表明具有统计学显著意义
可见考察因素与响应值之间呈二次二项式模型，该模
型呈现统计学极显著意义 (P = 0. 001)。因素 x1、x2 和 x3
对响应值 (得率)均具有显著影响;各因素交互作用项
中，乙醇倍数 (x2)与提取时间 (x3)的交互作用对阿魏
酸得率的影响呈现统计学显著意义，其它交互作用项的作
用不显著;各因素的二次项对响应值都具有显著性影响。
为简化方程求解，在保证拟合度的前提下，进行了相应的
方程简化，在 P ＜ 0. 1 水平上拒绝无显著相关的项目后，响
应值与试验因素的拟合方程为:
Y = － 0. 850 + 0. 022x1 + 0. 016x2 + 4. 21 × 10
－4x3 －
6. 08 × 10 －5x2x3 － 1. 63 × 10
－4x1
2 －
3. 40 × 10 －4x22 + 4. 53 × 10
－6x23 (2)
上述方程中，模型 P ＜ 0. 001，表明建立的模型具有极
显著意义，校正决定系数 (Adj． Ｒ2)为0. 981 6，说明该
方程拟合程度好。模型失拟值 (lack of fit)检验结果为:F
值为 3. 09，P = 0. 262 5，即模型失拟不具有统计学显著意
义［16］。各因素与响应值的 3D响应面和等高线图见图 1。
图 1 乙醇体积分数、乙醇体积和提取时间对阿魏酸提取得率作用的响应面 (3D)和等高线图
2. 3 最佳工艺条件的确定和验证实验 采用 Derringer渴求
函数 (Derringers desirability function)评价阿魏酸得率、溶
剂消耗的综合作用，其公式如下:
D = ［dp11 × d
p2
2 × … × d
pn
n］
1 / n
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其中，pi为响应值的权重;n 为响应值的数目;di为单
个响应值的渴求函数。D值在 0 ～ 1 之间，D 值越接近 1 则
说明所确定的最优条件越接近全局最优条件。本研究设响
应值目标为:得率最高，溶剂消耗最少，其中以得率为主
要目标，因此本实验阿魏酸得率权重取 10，乙醇体积分数
和乙醇体积倍数权重均取 1。利用 Design-Expert软件整合渴
求函数的计算功能，得最大化总体渴求值 (D)为 0. 796，
因素的最佳水平组合为:乙醇 64%，体积为药材 13 倍
(v /m) ，提取时间 100 s。在此工艺条件下，根据模型预测
阿魏酸得率为 0. 029 9%。
为验证优选工艺的可靠性和模型的预测性，取大叶当
归 30 g，按最优工艺进行闪式提取，平行操作 3 份，按
“2. 1”项下测定，阿魏酸得率均值为 0. 029 2%，ＲSD 为
1. 20%，与模型预测值的偏差为 － 2. 31%。表明该工艺稳
定可行，具可操作性和重复性，且模型预测性好。
2. 4 与其他提取方法的比较 根据文献［7-9］，分别采用渗
漉法、乙醇回流法和超声提取法提取大叶当归中的阿魏酸，
每种方法重复 3 次，结果见表 4。
表 4 提取方法比较
方法 乙醇 /% 液料比
(v /m) 提取时间 得率 /%
渗漉法 70 2. 5 2. 5 d 0. 020 6 ± 0. 002 4
乙醇回流法 70 24 3 h 0. 031 7 ± 0. 003 1
超声提取法 60 12 50 min 0. 028 5 ± 0. 001 8
闪式提取法 64 13 100 s 0. 029 2 ± 0. 001 8
3 讨论
近年来，实验设计 (design of experiment，DoE)结合响
应面法 (response surface methodology，ＲSM)在中药提取和
制备中应用日益广泛［17-18］。本研究在参考文献和前期实验
的基础上，通过实验设计-响应面法，结合计算渴求函数
值，得到了闪式提取大叶当归中阿魏酸的最佳工艺条件，
药材制成粗粉 (20 目) ，以 13 倍 (m/V)的 64%乙醇为提
取溶剂，工作电压 120 V，提取时间 100 s。该方法操作简
单稳定，重现性好，提取率较高。
比较闪式提取法和传统提取方法可见 (表 4) ，乙醇回
流法得率高，但液料比也高，闪提法和超声辅助提取法的
溶剂消耗量比较接近，为乙醇回流法的一半左右，得率分
别为乙醇回流法的 92. 1%和 89. 9%。渗漉法溶剂消耗最
少，但提取前需要浸泡 2 d，因此操作时间最长，得率也相
对较低。闪提法在提取时间上具有明显优势，超声辅助提
取法、乙醇回流法和渗漉法所需时间分别是其 30 倍、108
倍和 2 160倍。综合考虑，闪提法不失为提取大叶当归中阿
魏酸的一种良好方法。
从实验和文献［9，12，14］中可以看到，大叶当归中阿魏酸
的含有量低于正品当归，因此在使用上，可适当增大中药
的用量，以保证治疗效果。而大叶当归中其它有效成分的
量也有待于进一步考察，以保证用药安全。
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