全 文 ：不同光照条件对槲蕨组织培养
外植体褐化的影响
刘闻川,俞慧娜,戎华磊,刘 鹏
(浙江师范大学植物学实验室,浙江 金华 321004)
摘 要:采用组织培养方法,探讨了黑暗、1000lx、2000lx和3000lx等4种不同光照条件对槲蕨外植体褐变程度的
影响。结果表明:随着光照时间的延长,槲蕨外植体的PPO、POD和总酚含量均表现为先增加后减少的趋势;在相同培养时
间下,随着光照强度的增加,槲蕨外植体的PPO和POD活性也同时增加,其中光照强度1000lx处理的PPO和 POD的活
性均低于其他光照强度处理;光照对槲蕨外植体的总酚含量在相同培养时间下影响并不直接,但1000lx处理下的槲蕨
外植体的总酚含量积累较少,说明1000lx是槲蕨的组织培养较为适宜的光照条件。
关键词:槲蕨;光照;外植体;褐化
中图分类号:S682.35 文献标识码:A 文章编号:1004-874X(2008)08-0022-04
EfectofdiferentiluminationonbrowningofDrynariafortunei
LIUWen-chuan,YuHui-na,RONHua-lei,LIUpeng
(KeyLaboratoryofBotany,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)
Abstract:Withthemethodoftissueculture,studiesonthechangelawofexplantbrowningatthediferenttreatmentof
light(dark,1000lx,2000lxand3000lx).TheresultshowedthatthePPO,PODandtotalphenolscontentincreasedfirstand
decreasedlaterduringthelighttime.Atthesameculturetime,withtheincreaseoflightintensity,theactivityofPPOandPOD
increasing,andthevalueofPODof1000lxtreatmentweresmalerthanotherlight.Thetotalphenolscontentdidnotdisplay
directlytoluminance.However,likePPOandPOD,thecontentof1000lxtreatmentalsoshowedsmalest.Therefore,the
appropriateconditioninthetissuecultureofDrynariafortuneiwasthelightof1000lx.
Keywords:Drynariafortunei;iluminance;explant;browning;
槲蕨〔Drynariafortunei(Kunze)J.Sm〕为槲蕨科槲
蕨属植物,其根茎是中药骨碎补的主要来源,具有补肾
强骨、续伤止痛等功效,常用于治疗肾虚腰痛、耳鸣耳
聋、牙齿松动、跌扑闪挫、筋骨折伤及外治斑秃、白癜
风[1]等疾病。槲蕨主要分布在长江以南各省,附生于低
山丘陵的岩石或树干上。槲蕨在浙江省主要分布于鄞
县、东阳、淳安以南的东部、中部、西部和南部[2-3]。近年
来,随着人们保健意识的增强,对骨碎补药材的需求量
日益增大,而槲蕨占骨碎补商品药材的 70%以上[4]。目
前,国内外对槲蕨的研究主要集中在化学成分、药理以
及生药鉴定等方面。如周铜水等[4-7]研究了槲蕨根茎总
黄酮和柚皮甙的含量测定及生药鉴定;刘振丽等[8]研究
了骨碎补挥发油成分的分析;沈秋仙[9]研究了槲蕨根茎
黄酮类物质提取;赵湘洪[10]研究了骨碎补对关节炎的
治疗作用;王维信等[11]研究了骨碎补的双氢黄酮对心
血管的作用;董福慧等[12]研究了骨碎补对骨愈合过程
中相关因素表达的影响;国外学者研究了槲蕨对骨细
胞活动的影响[13-14]。但是,对槲蕨生物学和栽培繁殖学
特性上的研究较少,目前只有吴艳芳等[15]研究了光照
强度、温度、激素、pH值对槲蕨配子体发育的影响。因
此,加强对槲蕨的繁殖生物学特性的研究具有十分重
要的意义。
组织培养是扩大生产和保存物种的一种有效途
径,但在植物组织培养中经常会遇到外植体褐变现
象。引起外植体褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化
物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等,但最主要的是
PPO。PPO是催化褐变反应的关键酶,能催化酚类物质
到联苯酚的羟基化以及羟基酚到醌的脱氢反应。醌在
植物体内自身聚合,或与细胞内的蛋白质反应,产生黑
收稿日期:2008-04-15
基金项目:国家科技攻关项目(2004BA525B06);国家自然科学
基金项目(30540056);浙江省自然科学基金项目(303461,304185);
浙江省新苗人才计划项目(2007G60G2030063)
作者简介:刘闻川(1988-),男,在读本科生
通讯作者:刘鹏(1965-),男,博士,教授,E-mail:sky79@zjn
u.cn
广东农业科学 2008年第8期22
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2008.08.030
色或褐色的沉积物,被认为是植物体酶促褐变的主要
原因[16]。POD则是植物防御中的第一道防线。许传俊等[17]
在研究蝴蝶兰外植体褐变发生与总酚含量 PPO、POD
和PAL的关系时发现,褐变发生前期PPO和POD的
活性皆升高,褐变发生后2种酶的活力下降。而张盛林
等[18]研究发现外植体褐变程度与 PPO活性呈正相关,
褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基变褐,而且对许
多酶有抑制作用,从而影响培养材料的生长与分化,严
重时甚至导致其死亡。晏本菊等[19]研究了苍溪梨、金花
梨外植体的PPO活性、总酚含量和组培褐变率变化规
律及其关系,结果表明,PPO活性、总酚含量与组培褐
变率均存在一定关系,组培褐变率的高低取决于PPO
活性和总酚含量。为寻求槲蕨组织培养的较适宜光照
条件,我们开展了不同光照强度对槲蕨外植体褐变的
影响研究,现将初步研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试用的槲蕨幼嫩走茎采自浙江师范大学叠翠园
旁的马尾松干。将槲蕨幼嫩走茎去除表皮,切成长约1
cm的小段作为外植体。外植体用75%酒精消毒 15～30
s,再放入1%升汞中消毒2min,然后用无菌水冲洗干
净,备用。
1.2 试验方法
将经消毒的槲蕨外植体接种于 MS培养基中,分
别置于黑暗和光照强度 1000、2000、3000lx下培
养,培养温度白天(12h)为25℃、晚上(12h)为20℃。
每个处理3次重复,每个重复3瓶,每个三角瓶接种
4～5段外植体。试验于接种前(0d,CK)和培养后1、3、
6、7、9d测定外植体的POD、PPO活性和总酚含量。
1.3 测定方法
1.3.1 PPO活性 PPO活性参考毕玉蓉等[20]的方法进
行测定:称取外植体样品0.1g,加入pH7.8的磷酸缓
冲液冰浴中研磨,然后于4℃低温下离心(6000r/min)
20min。取上清液 0.2mL,加入pH6.0的磷酸缓冲液
和0.1mol/L儿茶酚溶液,37℃下保温10min后,倒入
比色皿中,于波长410nm处读取吸光值(每分钟记录
1次,共记录 6次)。以每分钟吸光度变化值表示酶活
性的大小,酶活性单位为ΔA410/min·g)。
1.3.2 POD活性 称取外植体样品0.1g,加入磷酸
缓冲液和 1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)混合液 2mL于
冰浴中研磨,然后于 4℃低温下离心(6000r/min)20
min。取上清液0.2mL,与比色皿中的反应混合液(磷酸
缓冲液+过氧化氢+愈创木酚)混合后,置于波长 470
nm处读取吸光值(每分钟记录 1次,共记录 6次)。以
每分钟吸光度变化值表示酶活性的大小,酶活性单位
为ΔA470/min·g。
1.3.3 总酚含量 称取外植体样品 0.1g,用 50%乙
醇-HCl(pH3.0)提取后,置于波长280nm处读取吸光
值,最后以没食子酸作标准曲线,计算总酚含量(mg/g)。
2 结果与分析
2.1 不同光照处理对槲蕨外植体PPO活性的影响
PPO是植物体中普遍存在的一种末端氧化酶,是
催化褐变反应的关键酶,其可以催化酚类物质形成醌
类物质,醌类物质再经非酶促聚合,形成红棕色物质,
逐渐扩散到培养基中,对外植体产生毒害。从图1可以
看出,槲蕨外植体在黑暗条件下培养 1d后PPO活性
达到最大值,且与对照(接种前)差异显著;之后随着黑
暗培养时间的延长,槲蕨外植体的 PPO活性减小,但
变化不大,与对照相比差异不显著。从图1还可以看
出,槲蕨外植体在光照强度1000、2000、3000lx条
件下培养,培养前期的PPO活性也随着光照时间的延
长而增加,其中光照强度 1000、3000lx处理的PPO
活性在培养后 3d达到最大值,2000lx处理在 6d
后达到最大值;之后随着光照时间的延长,PPO活性下
降,但与对照差异不明显。从同一培养时间下不同光照
处理的槲蕨外植体PPO活性调查结果 (图1)可以发
现,除培养后3d在黑暗条件下的PPO活性最小外,
其他培养时间均在 1000lx光照条件下的 PPO活性
最小。
2.2 不同光照处理对槲蕨外植体POD活性的影响
有关研究表明,PPO和 POD共同氧化酚而形成
醌,醌转变成缩合型鞣质,最后形成褐色的聚合体。从
图2可以看出,槲蕨外植体在黑暗条件下培养,前期的
图1不同光照处理对槲蕨外植体PPO活性的影响
23
图2不同光照处理对槲蕨外植体POD活性的影响
POD活性增加,并在培养后 3d达到最大值,之后随
着黑暗处理时间的延长,POD活性有所减小,但与对
照差异不显著。从图2还可以看出,槲蕨外植体在光照
条件下培养,前期的POD活性仍然增大,其中 1000、
2000lx光照处理在培养后 3d达到最大值,3000
lx光照处理在培养后4d达到最大值,之后随着光照
时间的延长,POD活性减小。从同一培养时间不同光
照处理的槲蕨外植体 POD活性调查结果(图 2)可以
发现,除培养后 1d在 3000lx光照条件下的 POD
活性最小外,其他培养时间均在1000lx光照条件下
的POD活性最小。
2.3 不同光照处理对槲蕨外植体总酚含量的影响
对槲蕨外植体总酚含量的测定结果(图 3)表明:
在黑暗条件下,外植体总酚含量随着培养时间的延长
而增加,并在培养7d后达到最大值且与对照差异显
著,但在培养后9d时总酚含量又有所减小;在光照条
件下,槲蕨外植体的总酚含量均有所增加,其中
1000、2000lx处理在培养后7d达到最大值,3000
lx处理在培养后6d达到最大值,之后随着槲蕨外植
体各处理光照时间的延长,总酚含量又有所减少。从同
一培养时间不同光照处理的槲蕨外植体总酚含量调查
结果来看,各光照处理的总酚含量变化规律不太明显,
其中培养后1d在黑暗条件下酚类含量最少,培养后
3d和6d在1000lx光照条件下酚类含量最少,培
养后 7d和 9d在 3000lx光照条件下酚类含量最
少。
3 结论与讨论
在组织培养过程中,外植体褐变的直接原因是酚
类物质与PPO的区域化分布被打破,以致PPO能催化
酚类物质氧化引起褐变;如果酚类物质与PPO的区域
化分布没有被打破,即使 PPO活性再高,酚类物质含
量再多,也不会发生褐变反应。许传俊等[21]研究证实,
在外植体褐变中,酚类产生鞣质,鞣质对细胞有毒害作
用,同时细胞结构被破坏,代谢发生紊乱,导致培养失
败。因此,在组织培养中影响褐变的主要因素是酚类含
量和相关酶活性。
本研究结果显示,在同一天培养时间内,随着光照
强度的增加,槲蕨外植体的PPO活性也同时增加,其
中以 1000lx光照处理的外植体 PPO活性最小,
2000lx光照处理次之,而3000lx光照处理的 PPO
活性最大,说明部分酚类氧化酶活性是受光的诱导,这
些酶在光照条件下生长的外植体内比较活跃。但比较
不同光照处理对槲蕨外植体总酚含量的影响发现,其
变化规律并不明显,就酚类含量变化的差异来看,黑暗
处理及 2000、3000lx光照处理在培养后 3d就出
现显著性变化,而 1000lx光照处理则在培养7d后
酚类含量才出现显著性变化,其含量由 285.9mg/g增
加至 842.4mg/g。从槲蕨外植体在 1000lx光照条件
下酚类氧化酶系的活力较低且酚类含量在培养后1～6
d内变化不明显的情况可以推断,槲蕨外植体的酚类
合成与氧化同样受到光的诱导;而槲蕨外植体在黑暗
条件下培养后1d时总酚含量减少,说明一段时间的
黑暗处理可能是减缓酚类合成的因素之一。但是,连续
长时间的黑暗处理会降低外植体的生理活力,而弱光
1000lx与黑暗交替处理能够抑制 PPO活性及控制
酚类产生鞣质,从而控制褐变的发生,却不会降低外植
体的生理活力。因此,本研究认为,1000lx是槲蕨组
织培养中较适宜的光照条件。
在槲蕨组织培养过程中,接种后外植体的PPO和
POD活性都有所增加,但褐变发生后PPO和POD活性
下降,说明这2种酶均参与褐变的开始;随着褐变发生,
24
外植体的总酚含量增加,说明褐变过程是酚类积累的
过程,总酚含量在褐变前期与酶活性呈相同的趋势,但
在培养后9d有一定程度的下降,表明除PPO和POD
外,可能还有其他因素影响总酚含量。在植物组织培养
中,褐变与外植体材料的总酚含量关系密切。本试验结
果表明,槲蕨外植体在褐变发生过程中酚类物质并没
有随着褐变程度的加重而氧化减少,而在培养后1～7d
内总酚含量为逐渐增加的过程,与酚类氧化酶系活性
的增强呈现相同的趋势,说明这段时间并不只是存在
酚类氧化成醌参与褐变的过程,也同样存在着酚类合
成的过程。有研究证实,抑制酚类的合成可以抑制褐变
的发生[22],抑制 PAL活性时褐变发生也会被抑制[22-23]。
本研究仅对氧化酚类的酶活性进行了测定,而酚类合
成酶(如PAL等)活性的变化则仍需进一步探讨。
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西双版纳植物园成为国内数字化植物园建设的先行者
经过近5年的不断探索和发展,中国科学院西双版纳植物园
从软件、硬件及技术平台的利用上对其数字植物园建设进行了重
新部署和科学设计,数据质量得到明显提升,自动化程度显著提
高,形成了较为完善的数字植物园系统,成为国内数字化植物园建
设的先行者。已建成的数字植物园系统主要由“植物信息网络实时
记录系统(植物信息数据库)”、“植物信息户外采集系统”、“植物园地
理信息系统平台”等几个部分组成。目前已完成大部分园区的植物
定位工作,定位精度由原来误差的3~5m提高到0.1m以内。并且
实现对园区内收集的植物数据采集的自动化,分别建立了基于桌
面和移动设备及网络环境的植物园地理信息系统,为园区植物管
理、科普旅游和广大公众提供了方便的数字化信息共享平台。
数字化植物园是世界一流植物园的重要标志。它是植物园
的一种虚拟表现形式,使人们能够探究和管理植物园的大量信
息。是以互联网为基础,以空间数据为依托,以虚拟现实技术为
特征,具有三维界面和多分辨率浏览器的面向公众的开放系
统。可使植物园的信息实现数字化管理,并为公众提供身临其
境的交互或访问平台。通过该系统可查询园内各区面积、植物
物种数等基本信息,以及详细的各个区的景观,作为数字植物
园的一部分,构建了网上虚拟植物园,任何人只要点击网址便
可在线游览各个园区的全景图。
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