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半边旗中二萜类化合物5F对K562细胞MAPK活性、表达的影响



全 文 :半边旗中二萜类化合物 5F对 K562细胞
MAPK活性 、表达的影响*
王京滨 梁念慈 莫丽儿1
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所 、1 化学教研室 , 湛江 524023)
2002-01-05收稿 , 2002-02-15修回
*广东省科委重大科技攻关项目 , No 9622007-002;国家自然科学基
金资助课题 , No 39870900
作者简介:王京滨 , 女 , 28 岁 , 硕士 , 研究方向为生化药理学。 Tel:
0759-2388582-4;Fax:0759-2284104 , E-mail:gdmcsh @
gdmc.edu.cn;
梁念慈 ,男 , 61岁 ,教授 ,博士生导师 , 主要从事生化药理
学的研究
中国图书分类号 R 282.71;R 284.1;R 730.52;R 733.7;
R 979.1
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(2002)03-0294-04 
摘要 目的 研究半边旗中二萜类化合物 5F(11α-羟基-15-
氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19 酸)对 K562 细胞MAPK 活性 、表
达的影响。方法 5F 作用 K562 细胞 24 h 后 ,以 MBP 为底
物检测 MAPK 的活性 、用蛋白印迹法测定 MAPK 的表达。
结果 半边旗中二萜类化合物 5F 作用于 K562 细胞使
MAPK 活性增强 ,表达增多 , 且有量效关系。结论 推测异
常激活和表达的 MAPK 是化合物 5F抗肿瘤的机制之一。
关键词 半边旗;二萜类;丝裂原活化蛋白激酶;K562 细胞
  半边旗(Pteris semipinnata L , PsL),别名凤凰
尾巴草 、半凤尾草 、半边梳 、甘草蕨等 ,是凤尾蕨科凤
尾蕨属植物 ,产于四川及长江以南各省区 ,具有疏解
风寒 、化湿消肿 、清热解毒的功效。民间用来治疗菌
痢肠炎 、肝炎 、毒蛇咬伤 、外伤出血等[ 1] 。我们课题
组经过多年的研究发现 ,半边旗有效成分有强的抗
肿瘤作用[ 2~ 5] 。本文以髓鞘碱性蛋白(Bovine
myelin basic pro tein , MBP)为底物检测丝裂原活化
蛋白激酶(mitogen-activated pro tein kinase , MAPK)
的活性 、蛋白印迹法测定 MAPK 的表达 ,研究半边
旗中二萜类化合物 5F(11α-羟基-15-氧-16-烯-对映
贝壳杉烷-19 酸 ,以下简称 5F)对 MAPK 细胞信号
转导通路的影响 ,探讨半边旗有效成分抗肿瘤的可
能机制。
1 材料与方法
1.1 半边旗 1997 年夏天采摘于广西省南宁郊
区 ,并经分离提取 、纯化 、鉴定 ,得到有效成分二萜类
化合物 5F(结构式如 Fig 1 所示)。5F 用 DMSO 配
制成原液 ,分装冻存 ,临用前用培养基稀释成所需浓
度 。处理细胞时 , DMSO 的最终体积分数小于或等
于 0.001 ,实验表明该浓度对细胞的生长没有影响 。
1.2 试剂和仪器 RPM I-1640培养基为美国 Gib-
co公司产品;小牛血清为杭州四季青生物工程材料
研究所产品;[ γ-32P] -ATP 购自北京亚辉生物工程
公司;Leupeptin 、Aprotinin 、Hepes 、 Tris 、Na3VO4 、
MBP 、丙烯酰胺均为Sigma公司产品;MAPK兔 IgG
多抗 、HRP标记山羊抗兔 IgG 、ECL 试剂均为 Santa
cruz公司产品 ,北京中山生物技术有限公司代理。
其余均为国产分析纯试剂 。Mini-PROTEAN Ⅱ
Elect rophoresis Cell 、Mini T rans-Blot Electrophoretic
T ransfer Cell 、 MODEL 1000/500 POWER SUP-
PLY 、Model 543 Gel Dryers均为美国 Bio-Rad公司
产品。
Fig 1 The structure of compound 5F
1.3 细胞系及培养条件 人慢性髓原白血病细胞
系(chronic myelogenous leukemia)K562购于中山医
科大学动物实验中心 。K562细胞生长于含体积分
数为 0.10灭活小牛血清 、1×105 U·L-1青霉素和
100 mg·L -1链霉素的 RPMI-1640 完全培养基中 ,
置 37℃、0.05 CO2 饱和湿度孵箱内培养。细胞经传
代和收获 ,取对数生长期细胞进行实验。
1.4 K562细胞裂解液的制备[ 6]  半边旗提取物
5F 作用于白血病 K562 细胞(1 ~ 2×107 cells)一定
时间 ,500 ~ 1 000× g 室温离心 10 min收集细胞 ,
以冰冷的 PBS洗涤细胞 2次 ,离心 ,小心去除 PBS。
加入 5倍体积冰冷的新鲜配制的细胞裂解液(Hepes
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50 mmol·L-1 pH 7.5 , NaCl 150 mmol· L-1 ,
Na3VO4 2 mmol · L-1 , NaF 100 mmol · L-1 ,
NaH2PO4 10.0 mmol·L-1 , DTT 2.0 mmol·L-1 ,
PMSF 1.0 mmol·L-1 , aprot inin 1 ×105 U·L-1 ,
Leupeptin 20 μmol·L-1 , 体积分数为 0.01 Tri ton
X-100),轻轻混匀 。将细胞置于冰上孵育 30 min ,
冰浴条件下超声波破碎细胞 ,每次 10 s ,共 3 次 。
4℃,13 000×g离心 10 min ,小心吸出上清液体 ,置
于另外的 Eppendorf管中 ,贮存于-70℃备用。
1.5 细胞裂解液蛋白浓度测定 取少量上清用考
马斯亮蓝法蛋白定量[ 7 ]
1.6 丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性测定
1.6.1 以 MBP 为底物检测 MAPK 的活性 参考
文献[ 8 ,9] ,略有改动。K562 细胞裂解液(30 μg 蛋
白)与 20μl激酶缓冲液[ 20.0 mmol·L-1 Hepes , pH
7.2 , 10.0 mmol·L-1 MgCl2 , 2.0 mmol·L-1 MnCl2 ,
2.0 mmol·L-1 DT T , 0.5 mmol·L-1 Na3VO4 , 0.1
g·L-1 BSA , 10 g·L-1 MBP , 3.7×107 Bq [ γ-32P]-
ATP ,50 μmol·L-1 ATP·Na2] 30℃反应 15 min(此
条件为直线反应)。加入 6倍电泳上样缓冲液终止
反应 , 100℃水浴 3 ~ 5 min ,用于 SDS-聚丙烯酰胺凝
胶电泳 、凝胶染色及脱色 、干胶 、放射自显影。
1.6.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)[ 10]  采用 Bio-Rad公司微型垂直板电
泳槽 。制备分离胶 、浓缩胶 ,按预定顺序加样 ,恒压
200 V电泳 ,当溴酚蓝到达分离胶底部时关闭电源 。
小心剥离凝胶。至此 ,凝胶可被固定并用考马斯亮
蓝染色 ,进行 Western blo tting 或干胶后放射自显
影。
1.6.3 用考马斯亮蓝法对 SDS-聚丙烯酰胺凝胶染
色及脱色[ 10]  用至少 5倍体积的考马斯亮蓝染色
液浸泡凝胶 ,放在平缓摇动的摇床上室温染色 30
min。取出凝胶 ,将凝胶浸泡于含脱色液[体积分数
为 0.45甲醇 ,0.45水 ,0.10冰醋酸]的平皿中 ,脱色
至凝胶无色 ,蛋白条带呈清晰可见的蓝色为止 。
1.6.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶的干燥[ 6]  选择合适
的条件(温度:80℃,时间:2h),干燥凝胶。
1.6.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶的放射自显影[ 10]
1.7 Western blot 参考文献[ 10] ,略有改动。蛋白
质从 SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体:依次
放置预先用电转移缓冲液饱和的海绵层※3层滤纸
※凝胶※转印膜※3层滤纸※电转移缓冲液饱和的
海绵层※透明的多孔塑料夹 ,合拢好夹子后放入电
转移槽中 ,正确连接电极 , 90 mA 4℃冷柜中电转移
过夜 。按膜面积配制封闭液(质量分数为0.05脱脂
奶粉 ,0.02 NaN3 ,体积分数为 0.02 Tw een-20 ,溶
于 PBS 中),封闭 3h 。加入封闭液和适量的第一抗
体(用封闭液 1∶1 000 ~ 1∶2 000稀释),于 4℃孵育 2
h 。磷酸盐缓冲液漂洗膜 4次 ,每次 15 min ,最后用
漂洗液(150 mmol·L-1 NaCl , 50 mmol·L-1 Tris-
Cl , pH 7.5)洗膜 1次 ,10 min 。按膜面积加入封闭
液(质量分数为 0.05脱脂奶粉 , 150 mmol·L-1 Na-
Cl , 50 mmol·L-1 Tris-Cl , pH 7.5)和第二抗体(用
封闭液 1∶2 000稀释),将膜与第二抗体温育 2 h。
漂洗膜 15 min(150 mmol·L-1 NaCl , 50 mmol·L-1
T ris-Cl , pH 7.5),重复 3 ~ 4次。用 ECL 试剂发光
底物显迹。
2 结果
2.1 化合物 5F对MAPK活性的影响 如Fig 2所
示 ,观察 X 光片上 MBP 条带 ,化合物 5F 作用 24 h
后 ,随着用药浓度增高(8.875 μmol·L-1 、35.5 μmol
·L -1 、142 μmol·L -1),MBP 条带逐渐变粗 ,说明随
着用药浓度增大 , MAPK 对底物 MBP 的磷酸化反
应增强。说明在化合物 5F 的作用下 , MAPK 的活
性升高 。
Fig 2 Effect of compound 5F on the activi ty of MAPK of K562 cells
  A:Untreated cells;B:8.875 μmol·L -1 compound 5F;C:35.5
μmol·L -1 com pound 5F;D:142μmol·L -1 compound 5F.
2.2 化合物 5F对MAPK表达的影响 如Fig 3所
示 ,化合物 5F 作用 24 h 后 , 随着用药浓度增高
(8.875 μmol·L-1 、35.5μmol·L-1 、142μmol·L-1),
MAPK条带的黑度和面积增大 ,说明在化合物 5F
·295·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin  2002 Jun;18(3)
Fig 3 Effect of compound 5F on the expression
of MAPK of K562 cel ls
  A:Untreated cells;B:8.875 μmol·L -1 compound 5F;C:35.5
μmol·L -1 compound 5F;D:142μmol·L-1 compound 5F.
的作用下 ,MAPK的表达增多。
3 讨论
细胞信号转导通路是连接细胞膜蛋白 、细胞质
中的酶和细胞核的通信系统 ,刺激作用于细胞膜受
体 ,细胞膜受体把信号传递给细胞质中的信号转导
蛋白 ,这些蛋白把信号通过核膜传递到合适的核受
体 ,最初的刺激导致转录因子的改变和基因表达的
调节。MAPK是脊椎动物体内广泛存在的丝氨酸/
苏氨酸蛋白激酶 ,属于细胞外信号调节激酶(ext ra-
cellular signal-regulated kinases , ERKSs),是多种影
响基因表达的胞内信息传递的共同通路[ 11] 。
MAPK 具有两个显著特征:(1)通过苏氨酸 、酪氨酸
双位点磷酸化活化;(2)是由脯氨酸介导的 Ser/Thr
蛋白激酶 ,具有最小共同靶序列 Ser/ Thr-Pro[ 12 , 13] 。
MAPK 受多种信号活化 ,这些信号包括生长因子 、
蛋白激酶 C和 G蛋白偶联的受体等 ,MAPK 的完全
激活需要其 Ty r和 Thr残基都发生磷酸化[ 14] 。从
细胞外刺激作用于细胞 ,至细胞出现相应的生理学
效应 ,通过 MAPK 信号转导通路多级激酶的级联效
应 ,其中包括 3 个关键激酶:MAPK 、MAPKK 和
MAPKKK 。MAPKKK 使 MAPKK 磷酸化而将其
活化;进而 MAPKK使MAPK 进行磷酸化而将其活
化。MAPK 的细胞内底物有多种 ,如:蛋白激酶 、细
胞膜受体 、细胞骨架蛋白 、核内转录因子(c-Jun 、c-
Myc、c-Myb 、c-Fos 、NF-IL6 、ElK-1等),底物的多样
性表明包括基因转录 、细胞骨架重排 、各种代谢过程
等细胞的许多生理过程都可被 MAPK 调节[ 15] 。
MAPK 家族不仅参与了细胞生长 、发育 、分裂及细
胞间功能的同步等多种生理过程 ,并在细胞恶性转
化等过程中起重要作用。
  MAPK 是丝氨酸/苏氨酸激酶 ,位于许多生长
因子信号级联系统的下游 ,它对于触发细胞增殖或
分化具有重要意义[ 16 ~ 18] 。研究表明 MAPK 失活
与结肠癌发病有关[ 19] ,但是在乳腺癌中 MAPK 过
度表达 ,活性升高[ 20] 。用佛波酯诱导 K562细胞向
巨核细胞分化 ,发现细胞周期停滞 , MAPK 活性升
高[ 21] 。MBP 是极好的 MAPK 的体外底物 , MAPK
使 MBP 的苏氨酸磷酸化 ,用质谱法鉴定 , MBP 的磷
酸化位点是在保守的三脯氨酸环的苏氨酸 97 ,其部
分序列是:-Thr-Pro-Arg-Thr97-Pro-Pro-Pro-[ 22 ] 。化
合物 5F 8.875 μmol·L-1作用 24 h , MBP 磷酸化程
度显著增强 ,X光片上的 MBP 条带增黑增宽 ,表明
MAPK 活性增强 , MAPK 被异常激活 。Western
blot ting 显示 MAPK 的条带增宽 ,提示 MAPK表达
增多 。Watabe[ 23]报道 ,用中药蟾蜍作用于 U937细
胞 ,发现异常和持续激活的 MAPK 是蟾蜍抗肿瘤的
机制之一 ,他发现蟾蜍还能使 MAPK的上游 Raf激
活 。推测化合物 5F 作用于 K562 细胞后 , 通过
MAPK信号转导通路使 MAPK 异常激活和表达 ,
引起转录因子的改变和基因表达的调节 ,从而发挥
抗肿瘤作用 。是否化合物 5F 能使 Raf激活 ,值得进
一步研究 。我们还发现化合物 5F 能使核内转录因
子(c-Jun 、c-Fos)的表达增多(另文待发表)。本文试
图从细胞信号转导途径来解释化合物 5F 抗肿瘤的
可能机制 ,开展这方面的研究 ,对阐明半边旗抗肿瘤
的机理和将来临床应用都具有重要意义。
参考文献
1  丁恒山.中国药用孢子植物.上海:上海科学技术出版社 , 1971:
104
2  张 晓 ,崔 燎 ,田中信寿 et al.半边旗有效成分及抗肿瘤活性
研究.中国药学杂志 , 1997;32(1):37~ 8
3  崔 燎 ,张 晓 ,梁念慈 et al.一种新二萜类化合物的体外抗肿
瘤研究.中国药理学通报 , 1998;14(1):50~ 2
4  李金华 ,梁念慈 , 莫丽儿 et al.半边旗 5种成分体外细胞毒活
性比较及构效关系分析.药学学报 , 1998;33(9):641~ 3
5  Li JH , He CW , Liang NC et al.Ef fects of antitumor compounds
isolated f rom Pteris semipinnata L.on DNA topoisomerases and cell
cycles of H L-60 cells.Acta Pharmacol Sin , 1999;20(6):541~ 5
6  李田昌 ,庞永政 ,苏静怡 et al.丝裂原活化蛋白激酶活性测定.
基础医学与临床 , 1996;16(2):158~ 60
7  Bradford BM.Rapid and sensitive method for the quat itation of
microg ram quanti ties of protein utilizing the p rinciple of protein-
dye binding.Anal Biochem , 1976;72:248~ 54
8  刘秀华 ,庞永政 ,苏静怡 et al.生长抑素抑制内皮素刺激的家兔
血管平滑肌细胞增殖.基础医学与临床 , 1996;16(5):33~ 6
9  Granot Y , Erikson E , Fridman H et al.Direct evidence for tyro-
sine and th reonine phosphorylation and act ivation of mi togen-acti-
vated protein kinase by vasopressin in cultured rat vascular smooth
muscle cells.J Biol Chem , 1993;268(13):9564~ 9
·296· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin  2002 Jun;18(3)
10 SambrookJ , Fritsch EF , M aniat is T.MOLECULAR CLONING ,
A Laboratory Manua l.(2nd ed).New York:Cold Spring Harbor
Laboratory Press , 1989:1847~ 75
11 Seger R , Krebs EG.The MAPK signaling cascade.FASEB J ,
1995;9(9):726~ 35
12 Davis RJ.T he mi togen-activated protein kinase signal t ransduction
pathw ay.J Biol Chem , 1993;268(20):14553~ 6
13 Waskiewicz AJ.Cooper JA.Mitogen and st ress response path-
w ays:MAP kinase cascades and phosphatase regulat ion in mam-
mals and yeast.Curr Opin Cell Biol , 1995;7(6):798~ 805
14 Cobb MH , Robbins DJ , Boulton TG.ERKs , ex tracellular signal-
regulated MAP-2 kinases.Curr Opin Cell Biol , 1991;3(6):
1025~ 32
15 Cam pbell JS , Seger R , Graves JD.The MAP Kinase Cascade.
Recent Prog Horm Res , 1995;50:131~ 59
16 Pages G , Lenormand P , G L Allemain et al.Mitogen-Activated
Protein Kinases p42mapk and p44mapk are Requi red for Fibroblast
Prolif eration.Proc Nat l Acad Sci , 1993;90:8319~ 23
17 Troppmai r J , Brudder JT , Munoz H et al.Mitogen -activated
protein kinase/ extracellular signal-regulated protein kinase act iva-
t ion by oncogenes , serum , and 12-o-tetradecanoylphorbol-13-ac-
etate requires Raf and is necessary for t ransformation.J Biol
Chem , 1994;269(9):7030~ 5
18 Frodin M , Peraldi P , Obberghen EV.Cyclic AMP activated the
mitogen-activated protein kinase cascade in PC12 cells.J Biol
Chem , 1994;269(8):6207~ 14
19 Eggstein S , Franke M , Kutschka I.Expession and activiry of mi-
togen activated protein kinases in human colorectal carcinoma.
Gu t , 1999;44(6):834~ 8
20 Salh B , Marot ta A , Mat thew son C et a l.Invest igation of the
Mek-MAP Kinase-Rsk pathway in human breast cancer.Anti-
cancer Res , 1999;19(1B):731~ 40
21 Herrera R , Hubell S , Decker S et a l.A role for the MEK/MAPK
Pathw ay in PMA-induced cell cycle arrest:modulation of megakary-
ocyt ic dif ferentiation of K562 cells.E xp Cel l Res , 1998;238(2):
407~ 14
22 Enrickson AK , Michael Payne D , Mart ino PA.Identi fication by
mass spectromet ry of Threonine 97 in bovine myelin basic protein
as a specif ic phosphorylat ion site for mitogen-act ivated protein ki-
nase.J Biol Chem , 1990;265(32):19728~ 35
23 Watabe M , M asuda Y , Nakajo S et al.T he cooperative interactim
of tw o dif ferent signaling pathway in response to bufalin induces
apoptosis in Human Leukemia U937 cells.J B iol Chem , 1996;271
(24):14067~ 73
The effects of a diterpenoid compound 5F isolated from
pteris semipinnata L on the activity and expression of
mitogen activated protein kinase in K562 cells
WANG Jing-Bin , LIANG Nian-Ci , MO Li-Er1
(Insti tute of Biochem istry and Molecular Biology , Guangdong Medical College ,
1
Department of Chemistry , Guangdong Medical College , Zhanjiang 524023)
ABSTRACT AIM To study the effects of a diter-
penoid compound 5F (ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-
16-en-19-oic acid)isolated from pteris semipinnata L
on the the activity and expression of mitogen activat-
ed protein kinase of K562 cells.METHODS K562
cells w ere treated with compound 5F for 24 hours ,
then MAPK activity w as determined using MBP as
subst rate ,Western blo tting was used to detect the ef-
fect of compound 5F on the expression of MAPK.
RESULTS The activity and expression of MAPK
increased af ter the t reatment of 5F.CONCLUSION
 One mechanism of the anti-tumor ef fect of com-
pound 5F is through abno rmal activation and abnor-
mal expression of MAPK.
KEY WORDS pteris semipinnata L;diterpenoid;
mitogen activated protein kinase;K562 cells
◎消 息◎
《中国药理学通报》将改为月刊
  近年来 , 《中国药理学通报》对来稿和用稿的要求越来越严 ,然而来稿数量仍不断增加 ,高质量论文积压
严重 ,目前的双月刊已不能适应我国药理学研究不断增长的论文发表的要求。鉴于此 ,经研究决定 ,《中国药
理学通报》自 2003年起改为月刊 ,页码不变 ,信息量将增加 1倍 。中药药理和临床药理的内容将扩大刊用范
围 ,增加刊用比例 ,还将增设学术争鸣和院士论坛栏目 。
《中国药理学通报》编辑部
2002-01-10
·297·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin  2002 Jun;18(3)