全 文 ：半边旗二菇类活性成分的提取分离研究
邓亦峰 , 梁念慈(广东医学院 、广东省天然药物研究与开发重点实验室 , 广东 湛江 5 240 2 3 )
摘要 : 目的 建立一种高效的提取和富集分 离半边旗中二菇类活性成分的方法 。 方法 用超临界 c q 与 改性剂 乙醉组成 的
复合流体萃取半边旗中二花类活性成分 , 采用正交实验法优化苹取条件 ; 采用 1D 0I 大孔吸附树脂吸附 、 乙醇阶梯洗脱的方法
分离富集半边旗中二裕类活性成分 ; 以高效液相色语 ( l护 LC ) 一大气压化学电离源 ( Al { I ) 一质谱 ( M )S 联用的分析方法跟踪检测 ,
以主要的二花类活性成分 5F 为监测 目标 , 采用准分子 离子【M 一 H」一`为选择 离子监测 离子 , 以 色谱保留时间和选择监测 离子流
峰面积定量 。 结果 超临界流体萃取的最佳条件为 25 MPa ,印℃ , 巧% 甲醇 , 流量 3 . O mL ·而 n 一 ’ ;采用 35 % 乙醉洗脱 DI 01 大孔
吸附树脂可除极性杂质 , 45 % 一 5 % 乙醇洗脱流份可富集分离半边旗中二菇类活性成分 。 结论 采用超临界 Cq 萃取与大孔
吸附树脂吸附分离相结合 , 提取分离半边旗中二花类活性成分 , 具有效率高、 不使用有毒有害溶剂 、 环境污染程度低的特点 ,
该方法易于工业化 。
关键词 :超临界 c姚 萃取 ; 大孔吸附树脂 ;半边旗 ;二格类活性成分
中图分类号川2 84 . 2 文献标识码 : A 文章编号 : 10 1一 2 494 ( 2 (X碎 ) or ~ ()7 4 2 一 03
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)为凤尾蔽科植物 , 收载于
《中药大辞典》 , 民间认为有解毒 、 消肿及治疗蛇伤的功效 , 文
献 [’ 〕报道其含二菇和倍半菇等化合物 。 梁念慈等图首先发
现半边旗中具有 。 , 俘亚甲基环戊酮基团结构的贝壳衫烷型
二菇类化合物具有强烈的抗癌作用 , 并对它们作了分离鉴
定 。 半边旗中二菇类活性化合物主要以 SF ( e nt 一 1 1-a h y d or x y -
15
一
ox , ak -ur 1吞 e -n 19 一 iol c ` id )形式存在 。 现有的半边旗中二
菇类化合物的提取分离方法主要是乙醇回流提取 、 活性炭和
硅胶柱分离方法 ,效率低 、 共存组分多 、分离难度大 、使用有
毒有害溶剂 、难以工业化 。 本实验采用超临界 c q 流体萃取
与大孔吸附树脂分离富集相结合的方法 , 以 S F 为目标成分 ,
在 HP以二~ A」兀L MS 联用分析方法的检测下 , 对半边旗中二菇
类化合物的提取分离作了研究 。
1 仪器与材料
1
.
1 仪器
惠普 76 80 1 1, 型超临界流体萃取仪 , 安捷伦 n o 型改性剂
添加泵 ;岛津 CL Ms 一 80 1〕 。 型高效液相色谱一质谱联用仪 (含
在线脱气机 , 两台 比 一 10 AvP 高压输液泵 , sDP 一 I o A v ,紫外检
测器 ,柱温箱 , 月 { I电离源接口 , 四极杆质谱检测器 ) ;广州轻
工研究所 24 L 超临界二氧化碳萃取仪 ;上海精科实业有限公
司 Z 型色谱柱 (50 ~ x l 《XX) ~ )
、
1D 01 大孔吸附树脂 (天津
农药股份有限公司 ) 。
甚金项目 : 国家自然科学基金资助项 目 (3 9 87 淇 , )
作者简介 : 邓亦峰 , 男 ,高级工程师 elT : ( 0’7 5 9) 238 今拍5
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7 4 2
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中国药学杂志 2仪岭年 10 月第 39 卷第 10 期
1
.
2 试剂
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3
Nc ( H p l天:级 ,美国 iF hs er 公司 ) 、醋酸钱 (分析纯 ) 、 三
重蒸馏水 ,供分析测定用 ; 分析纯乙醇 、 甲醇 、 丙酮 、 醋酸乙
醋 ,氯仿等 , 试剂级 c q (南海清越气体公司 ) , 供 76 8a l, 型超
临界流体萃取仪用 ;食品级无水乙醇和 C仇 气体 ,供中试实
验用 。
1
.
3 对照品和药材
5F 对照品 (本课题组分离纯化 , 由日本东京理科大学药
学部和广东医学院医用生化研究所鉴定 ) ;半边旗生药材采
集于广州市郊 , 由湛江海洋大学杨燕君副教授鉴定为几而
s e m邢朋 2奴功1 L . 。
2 方法与结果
2
.
1 S F 的 HP LC一 M S 测定方法
参照文献 3l[ ,色谱条件 :色谱柱为 钱
~
1 1C 8 (5 娜 , 4 . 6
~
x l 50 ~ )
; 流动相 A 为 C玩 c N , 流动相 B 为 Z ll ll l lo l . L 一 ’
N氏A c 水溶液 , A 一 B 二 35 : 75 ; 流速 l nrL · 而n 一 ’ , 进样 5 匹 。
质谱条件 : A峨二1离子源 , 电极温度 粼】)℃ , 电晕 ( oC~ )电压 一 4 . 0 kV ,离子传输电压 十 5 V , 温度 25 0℃ , 偏转电压 一 40
v
,检测器电压 1 . 6 Vk , 喷雾氮气流速 2 . 5 .L 而 n 一 ` 。 以 色谱
保留时间约 4 . 5 而 n , m / : 一 331 为 SF 的选择监测离子峰 ,采
用选择监测离子流 ( M I )C 峰面积进行定量 。
该方法对 SF 的检测线性范围为 0 . 05 一 2 . 5 滩 , 相关系数
优于 。 , 更〕 , 检出限达 0 . 4 ng (进样 5 匹 ) 。 5F 的加标回收率
为叨 . 8% ( n = 3 ) 。
.2 2 超临界 C伍 萃取方法
2
.
2
.
1 正交试验法优选萃取条件 在 76 8 0 T 超临界流体萃
取仪上探索萃取条件 : 选取萃取温度 、 萃取压力 、 改性剂甲醇
在超临界流体的体积百分数三因素三水平作正交实验 , 以萃
取得到的 S F 提取量作为评价指标 , 优化超临界流体萃取条
件 。 正交试验因素及水平设计表见表 l 。
表 1 正交试验因素及水平设计表
T a b 1 F
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影响 因素水平—fl /阳 、 6 / ℃ 勺/ %1 25 40 52 刃 5() 103 35 印 15称取干燥的半边旗地上部分粉末 (40 目 ) 0 . 50 9 ,装人7 6剐) T 超临界流体萃取仪的萃取柱 ( 7 nrL )中 ; 按正交试验表条件 , 静态萃取 2 而n ,动态萃取 8 倍柱体积 , 超临界流体流量为 2 . o nrL ·而 n 一 ’ ;萃取流体流经装有 1C 8柱填料的收集阱减压 、然后流人收集容器 ;萃取完成后 , 以 1 . o mL · 而n 一 ’的甲醇洗涤收集阱 ,洗脱液并人收集容器 , 定容 or . o rnL , 采用 I IP LC -MS 方法测定萃取产物中 SF 的浓度 。 正交试验结果分析见表 2 。
极差分析结果表明 , 以萃取产物中 S F 的浓度为考察指
标 ,改性剂甲醇在超临界流体的体积百分数 (几)是影响萃取
的主要因素 , 其次是萃取温度 (fz) 和萃取压力 ( fl ) 。正交试验
中国药学杂志 2仪瞬年 10 月第 39 卷第 10 期
表 2
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正交试验结果分析表
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实验序号 实验水平场 几 几 评价指标 SF提取量 /呢
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.
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0
.
276
0
.
102
4235679一lK蝇凡
得到的最佳萃取条件为 25 Ml 、 ,印℃ , 超临界 c仇 与甲醇体
积比为 85二 15 。
2
.
2
.
2 归一化法选择改性剂 以正交试验优选出的参数为
萃取条件 ,用甲醇 、乙醇 、丙酮 、 醋酸乙醋 、氯仿为改性剂以及
不加改性剂 (对照 )分别进行萃取实验 。 采用 1 1PLC一 M S 方法
以扫描方式测定萃取产物的总离子色谱图 ( IT )C 峰面积和 5F
的选择监测离子色谱图 ( M CI )峰面积 ( m / : 二 331 ) , 以选择监
测离子峰面积及其在总离子流图峰面积百分比 (归一化法 )
对所选改性剂的萃取率和选择性进行比较 。
H PL C
一
M S扫描条件 : 11 PLC 作梯度洗脱 , 0 一 8 而 n 为 0 %
一 10 % 流动相 B , 8 一 25 而n 为 10 % 流动相 ;B MS 作负离子
扫描 , m / : 范围为 50 一 70 , 流动相组成及其他条件同 “ 2 . 1 ”
项 。 结果见表 3 。 实验表明 : 以甲醇为改性剂的萃取率和选
择性最佳 ,不加改性剂萃取效率最低 。 考虑到甲醇的毒性 ,
放大实验采用乙醇为改性剂 。
表 3 归一化结果表
1知b 3 R e s Ld ts of on n l l a iaZ t io n
改性剂 5F 峰面积 / x l护 / % 归一化
甲醇 3 93 4 . 88
乙醇 1 . 75 2 . 卯
丙酮 1 . 32 2 . 5 1
醋酸 乙酷 1 . 8 2 . 28
氯仿 2 .以 2 48
对照 0 . 33 0 一肠
2
.
2
.
3 萃取率的评价 称取与超临界 C仇 萃取所用相同的
半边旗样品 5 . 0 9进行索氏 (3 〕油、e t) 提取 , 平行 4 份 , 在 80 ℃
水浴中以甲醇为溶剂 ,持续回流提取 s h 。 提取液以甲醇定
容 l o nrL ,按 ,’2 . 1” 项下的 HP LC一 M S测定方法测定提取液中
S F的含量 。 测得试液中 5F 的平均浓度为 0 . (双〕 3 gm · nrL 一 ’
(
n = 4)
。 与该结果相比 , 在优选条件下超临界 Cq 萃取 S F
的提取率为 97 . 2 % 。
.2 .2 4 中试实验 在 24 L 超临界 c仇 萃取仪上作中试实
验 。 取半边旗地上部分 , 晾干 , 打成 20 一 4D 目的粉状 ,将药
粉投人超临界 c仇萃取釜中 ,按正交试验得到的最佳萃取条
hC 认 外往 7nI J , 2伏月 凸力衣罕 , 1匕1 . 了夕从 〕. 了口 · 7 4 3 ·
件进行 ,采用乙醇作改性剂 , c q 萃取流量为 80 .L h 一 ’ , 二级
解析釜的压力分别为 8 和 5 . 5 M l b ,动态萃取 3 h 。 收集解析
出的乙醇液 。
.2 3 大孔 吸附树脂分离
将超临界萃取得到的乙醇溶液制成 20 % 乙醇水混悬液 ,
以 I VB · h 一 ’的流速流过预处理好并以 20 % 乙醇平衡的 1D 01
大孔吸附树脂柱 ,至有色层约 l乃 By 。 用 20 % 一 30 % 乙醇以
I VB
·
h
一 `流速洗脱 3倍柱体积 ;然后用 35 % , 45 % , 5 % , 75 %
乙醇以 I VB · h 一 ’流速依序阶梯洗脱 3 倍柱体积 ,洗脱液每
50 毗为一流份依序收集 、备测 。
对乙醇水溶液阶梯洗脱得到的流份中 SF 含量进行检
测 , 以 S F 的含量对阶梯洗脱体积作图 , 见图 1。 从图中可 以
看到 : 35 % 乙醇洗不出 5 ;F 45 % 乙醇起 , 5F 开始被洗脱 , 5 %
乙醇 、 总洗脱体积约 10 峨狱〕mL 时 5F 含量最高。
3匡旧 自以】 驯以】 12口 )
洗脱体积 / m L
图 1 SF 含量 一洗脱体积曲线
l 一 SF 含量 ; 2 一 乙醇浓度
瑰 1 SF onC et n t 一 e lu et VO IneUI cVletr
1 一 SF ; 2 一 目仪研幻」
实验表明 , 可以采用 35 % 乙醇洗脱吸附了样品大孔吸附
树脂 、 除去极性部分杂质 ,再以 45 % 一 5 % 乙醇洗脱 、合并含
有 SF 的洗脱液 ,减压脱醇 、 除去水分 , 然后以乙醇重结晶 。
结晶产物中有效成分 SF 的含量可达 57 % , 达到新药报批规
定的有效成分含量要求。
3 讨 论
3
.
1 改性剂是影响萃取的关键因素 ,采用超临界 Cq 与改
性剂组成的流体萃取半边旗中二菇类化合物的性能比单纯
的超临界 c q 为萃取剂的性能大为提高 ;但在加入改性剂提
高萃取效率的同时 、 萃取的选择性也会发生改变 , 共存组分
增加 ,对后续的分离带来负面影响匡 。 改性剂的选取必须同
时考察其对萃取率和萃取选择性的影响。
压力和温度对萃取也有较大的影响 。 压力增加可增加
c仇 的极性 ,也增加 c仇 密度 、降低其传质性能叫 。 本实验中
萃取产物中的 SF 含量随压力增高而有所下降 ,说明传质性
能在本实验中的影响更大 。
3
.
2 利用大孔吸附树脂的吸附和分子筛作用 、 以乙醇阶梯
洗脱的提取工艺 , 可提高活性成分 5F 在半边旗提取物中的
比例 , 克服提取物中 S F 的含量因生药产地和季节变化带来
的不稳定因素 , 实现提取工艺的质量控制 。
3
.
3 采用 H pLC一 M S 跟踪监测 目标成分 , 既能发挥其强大的
分离识别能力 , 又具有质谱检测器的广泛响应性和高灵敏
度 , 能快速准确地检测 目标成分汉 , 与 u v 检测器相比 , 不需
要精细的色谱分离 , 在保证选择性的同时 , 可缩短分析时间 ,
灵敏度大为提高 。
采用 】护 LC一MS 方法以扫描方式获得的萃取产物总离子
流图 ( IT )C 峰面积包含萃取产物总量及其极性分布信息 , 选
择离子峰面积在总离子流峰面积的百分比 (归一化法 )在一
定程度上反映了目标产物在总萃取产物中的相对含量 。 本
实验利用这一特性对所选改性剂的萃取率和选择性进行了
对比和选择 , 简捷而直观 。
参考文献
「1 ] M a ll r 3k anu T , T an ak a N
.浅 e~ 二
e , s tme 恤 and taxon iom e i l l lp l i -
cat ions of fe m con ist tu
e m
s 石J〕. 了、 呀 ` ,盈口倪 之婚功比 aNt 子伙“ , 195 8 ,
54 : 1
.
〔2 ] 梁念慈 ,崔燎 , 吴铁 . 半边旗提取物及其医药组合物〔P ] . 中
国 : ZL 95 1 193 80 . 5 .
仁3〕 邓亦峰 ,梁念慈 ,梁统 . H l〕 LC一护C l一MS 分析半边旗中二菇类化
合物 [ J〕. 药学学报 , 2仪粗 , 3 7( 6) : `协 4 .
〔4」 张镜澄 . 超临界流体萃取【M 〕. 北京 : 化学工业出版社 , 2 (xX) :
10 3
.
汇别 hZ 田 SL , H欲 I山 I J德 e r M泊 pp li ca it on ` il qu 记 c h n 〕m a t , 歹 a p ll一~
-
sp卜e ir e p r e s s t ler ion iatZ ion ~
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(收稿日期 : 2田 3一肠一 16 )
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通过多学科基础与应用基础研究 ,为具有我国独特优势的中药 、草药 、 海洋药物 、 生化药物 、微生物药物 、 民族药物 、 民间药物
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