全 文 ：但常规煎剂组与膨化浸剂组相比较则无显著性差异 (P <
0. 01)。
3　 讨　论　以往的研究证明 ,部分中药材膨化后 ,
体积增加 3. 1～ 9. 3倍 ,水溶性浸出物增加 1. 9～ 18. 4倍 ,
醇溶性浸出物增加 1. 9～ 3. 7倍 ,提取时间缩短 70～
85% ;膨化后中药材的组织结构发生了显著变化 ,薄壁细
胞破裂 ,厚璧细胞散离等变化 [4 ]。 本实验从动物实验证
明 ,麦冬膨化后对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能、溶血
素含量以及外周血 WBC数目等指标都有显著的恢复作
用 ,与麦冬常规煎剂相比较 ,两者效果相似 ,说明麦冬膨
化处理后增强免疫的药效没有降低 ,证明将膨化技术用
于麦冬加工是可行的。
参考文献
1　陈奇 .中药药理实验 .贵州: 光明贵州人民出版
社 , 1988. 187
2　李仪奎 .中药药理研究方法学 .上海:上海科学技
术出版社 , 1991. 159
3　徐叔云 .药理实验方法学 .北京: 人民卫生出版
社 , 1992. 445
4　王盛民 .中药膨化的实验研究 .陕西中医学院学
报 . 2001; 24(增 ): 45- 46
(收稿 2005-08-31;修回 2005-12-21)
半边旗提取物对 HepA荷瘤小鼠的抑瘤作用及对免疫功能的影响*
戴　滨　 崔　燎　 吴　铁　 邓亦峰　 吴科锋
广东医学院药理教研室 广东天然药物研究与开发实验室 (湛江 524023)
　　摘　要　目的: 观察半边旗提取物 5F体外、体内抗肿瘤活性及其毒性。方法: 用 MT T
法观察 5F注射液对 SPCA- 1, K562瘤株的体外抗肿瘤作用 ;采用荷瘤小鼠
瘤重、抑瘤率检测提取物 5F对小鼠移植性肿瘤 HepA肝癌抑制作用 ;观察 5F
对荷艾氏腹水癌小鼠的生命延长率 ;胸腺指数、肝脏指数、脾脏指数、白细胞数
等指标观察 5F免疫器官的影响。结果: 5F注射液对 SPCA- 1、 K562瘤株有
显著的体外抗肿瘤作用 ;对小鼠 HepA肝癌也有抗肿瘤活性 ; 对荷艾氏腹水
癌的小鼠生命有延长作用 ;同时对免疫系统有一定抑制作用。结论: 半边旗
有效成分 5F一定的体内、体外抗肿瘤活性 ;对荷瘤小鼠功能有抑制作用。
　　主题词　@半边旗 /药效学　动物 ,实验　鼠　肿瘤
　　半边旗 ( Pteris semipininnata L , PsL )属凤尾蕨科植
物 ,广泛分布于南方各省 ,民间常用于治疗蛇伤、外伤出
血、菌痢、肠炎、肝炎等 [1 ]。 本课题组在筛选抗肿瘤植物药
时发现 ,半边旗的乙醇及水提取物显示良好的体内外抗
肿瘤活性 [2, 3 ] ,随后从醇提物中分离纯化得到 5个成分:
4F, 5F, 6F, A及 B,经结构鉴定 , B是一个倍半萜类化合
物。其余 4个均为二萜类化合物 [4 ]。经以体外究证明 5F、
6F、 A有抗肿瘤活性 ,而 4F、 B无此作用 [5～ 8 ]。本文旨在用
体外、体内研究方法观察半边旗提取物 5F抗肿瘤活性及
对荷瘤鼠毒性影响 ,为临床应用打下实验基础。
1　 材料和方法
1. 1　 材料　 半边旗有效成分 5F原料药 由天然药
物研究与开发实验室邓亦峰老师提供 ,药物为白色结晶 ,
* 国家自然科学基金资助课题 ( No39870900)和广东省科
委重大科技攻关项目 ( No9622007002)
其中 5F含量 46% ,其余为 4F,药物中不含 6F。
半边旗有效成分的提取 参考张晓 [4] ,邓亦峰老师改
进 ,半边旗全草 5kg ,洗净风干 ,以体积分数为 95%的乙
醇回流提取 3次 ,合并提取液 ,减压浓缩至原体积的三分
之一 ,上活性碳柱 ,以 EtO H- CHCl3( 10∶ 1)洗脱 ,减压
浓缩得淡黄色固体 ( 120g )。取此固体 10g ,经硅胶柱层析 ,
以氯仿 -甲醇系统分段洗脱 ,在 CHCl3- CHCl3O H( 90∶
2～ 90∶ 6)洗脱部分分别得到 6F ( 99. 7mg ) , B( 60mg ) ,
4F( 80. 7mg ) , 5F( 9. 5g )及 A( 200mg )。
动物和瘤株 清洁级昆明种小白鼠 18～ 22g ,雌雄各
半 ,购自广东医学院实验动物中心 ; SPCA- 1, K562瘤株
和 Hep A肝癌、艾氏腹水癌购自中山医科大学 ,本教研室
传代。
试剂 5- FU上海旭东海普药业有限公司生产。
1. 2方　法
1. 2. 1　 SPCA- 1、 K562细胞培养　 癌细胞贴壁培
370 陕西中医 2006年第 27卷第 3期
养于含 10%灭活小牛血清、 100u /mL青霉素和 100μg /
m L链霉素的 RPMI- 1640完全培养基中 , 置 37℃ , 5%
CO2饱和湿度孵箱内培养。 细胞经 0. 25%胰酶分散传代
和收获 , 取对数生长期细胞进行实验。 K562细胞培养同
上 ,但不用胰酶消化。 直接传代和收获 , 取对数生长期细
胞进行实验。
1. 2. 2　 半边旗提取物 5F对 SPC A- 1瘤株的抑瘤
作用　 SPC A- 1瘤株生长于含体积分数为 10% 灭活小
牛血清、 1× 105U· L- 1青霉素和 100mg· L- 1链霉素的
RPM I- 1640完全培养基中 ,置 37℃、 5% CO2饱和湿度
孵箱内培养 [9]。 M TT法参照 Hanse等 [10 ]的方法。取对数
生长期细胞 ,以台盼蓝染色 ,要求活细胞数大于 95% ,以 7
× 108· L- 1活细胞数接种于 96孔培养板中。待其完全贴
壁后 ,更换含不同浓度药物的 1640完全培养基 100μl·
w ell- 1 ,继续培养 24、 48、 72h后 ,加入 5mg· L- 1 M TT试
剂 20μl· well- 1 ,孵育 5h,吸去培养基 ,加 DM SO150μl,待
其完全溶解后 ,用酶标仪测定吸光度 ( A)。 按公式计算细
胞生长抑制率 ,药物半数抑制浓度 IC50按改良 Karber公
式计算。 实验重复 3次。
1. 2. 3　半边旗提取物 5F对 K562瘤株的抑瘤作用
本试验方法与上述方法基本相同 ,不同之处在于每孔加
入 7× 108· L- 1活细胞悬液 90ul,立即加入含不同浓度药
物的 PPM I1640完全培养基 100μl· w ell- 1 ,加入 M TT后
不用吸去培养基 ,直接加入 DM SO150ul。 实验重复 3次。
细胞生长抑制率= 〔 1- 给药组吸光度 ( A) 〕 /对照组
吸光度 ( A )× 100%
1. 2. 4　荷瘤小鼠模型及抑瘤作用、胸腺指数、肝脏
指数、脾脏指数、白细胞数指标观察观察 小鼠移植瘤接种
方法参考现代药理实验方法 [11] ,实验之 0d,取接种于昆明
小鼠腹腔内 8～ 10天的含瘤细胞腹水制成 ( 1～ 2)× 107 /
ml细胞悬液 ,每只小鼠右腋下皮下接种 0. 2ml,瘤株细胞
悬液进行细菌培养。 第 1d检查瘤细胞培养情况 ,确定无
污染后将小鼠随机分组 ,每组 10只 ,每日小鼠在电子天
平 ( Acs- 3D)上称重后 ,按体重腹腔每日上午给药一次 ,
连续给药 10d。11d小鼠称体重、 处死动物 、分离瘤块、 肝
脏、 脾脏 、胸腺在电子天平 ( JHANGPING FA 21. 4S)称
重。
抑瘤率= (对照组瘤重? 用药组瘤重 ) /对照组瘤重×
100%
肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数用该器官重量除以体
重。 1. 2. 5　 腹水瘤模型及生命延长作用观察　 小鼠移
植瘤接种方法参考现代药理实验方法 [11] ,实验之 0d, 选
择腹腔接种艾氏腹水癌细胞后 8天的小鼠 ,抽取含瘤腹
水 ,用生理盐水配制成 1. 5× 107 /ml瘤液 ,在无菌条件下
于小鼠腹腔接种 0. 2ml瘤细胞悬液液 , 瘤细胞悬液做细
菌培养。实验第 1d,检查瘤细胞培养情况 ,未见污染 ,动物
随机分成组。每日腹腔注射给药一次 ,共 10天。给药结束
后停药 ,每日观察记录小鼠一般药理反应及死亡情况 ,对
未见瘤株生长的动物给予剔除。
生命延长率= (用药组生存时间? 对照组生存时间 ) /
对照组生存时间× 100%。
2　治疗结果
2. 1　 提取物 5F对 SPCA- 1瘤株的抑瘤作用　 药
物作用后在相差显微镜下观察 ,细胞皱缩 ,变圆 ,从培养
板上脱落下来 ,随着时间的延长逐渐发展为细胞膜破裂 ,
细胞溶解。表 1结果显示提取物 5F对肿瘤细胞有明显的
抑制作用 ,并且呈剂量、时间依赖关系 ,对 SPC A- 1瘤株
24、 48、 7h的 IC50分别是 100 . 9、 52 . 0、 25. 5μmol· L-
1。
　　 2. 2　提取物 5F对 K562瘤株的抑瘤作用　 药物作
用后 , K562细胞生长受抑制 ,随着时间的延长逐渐发展
为细胞膜破裂 ,细胞溶解。 表 2结果显示 ,提取物 5F对
K562细胞的抑瘤作用随着时间的延长、剂量的增加逐渐
加强 , 24、 48、 72h的 IC50分别是 174. 1、 30. 7、 21. 4μmo l·
L- 1。
　　 2. 3　提取物 5F对荷瘤小鼠的抑瘤作用　 表 3结果
显示 ,提取物 5F对荷瘤小鼠肿瘤生长有抑制作用 ,三个
剂量组的 5F溶液对 HepA肝癌的抑瘤率分别是 27. 8% 、
29. 1% 、 42. 1% ,差异有显著性 (P < 0. 05)。三个剂量组的
5F溶液对小鼠的白细胞数没有影响 ,常用抗肿瘤药物 5
- FU则表现出白细胞降低的效应 ;高剂量的 5F溶液小
鼠胸腺萎缩 ,体积、重量均降低 ,差异显著 (P < 0. 01) ;三
个剂量组的 5F溶液组小鼠脾脏重量增加 ,差异显著 (P <
0. 05)。 5F溶液对小鼠肝脏指数没有影响。
表 1　提取物 5F对 SPCA- 1瘤株的抑瘤作用
药物 药物浓度
(μmol· L- 1) 　
抑瘤率 (% )
24h 48h 72h
5F 149. 7 　 47. 4 75. 0 85. 3
　 74. 9 　 32. 8 61. 7 76. 2
　 37. 4 　 23. 6 36. 4 69. 9
　 18. 7 　 9. 2 16. 2 43. 0
　 9. 4 　 0 7. 1 28. 5
　 IC50 (μmol· L- 1 )　 96. 7± 14. 654. 2± 4. 7625. 9± 3. 46
5- FU 384. 6 　 25. 9 61. 5 89. 0
　 192. 3 　 23. 6 54. 3 80. 2
　 96. 2 　 21. 8 44. 5 60. 3
　 48. 1 　 15. 8 39. 2 56. 3
　 24. 0 　 15. 5 34. 0 53. 6
　 IC50 (μmol· L- 1 )　267. 1± 19. 2107. 8± 25. 251. 6± 11. 5
371陕西中医 2006年第 27卷第 3期
表 2　 提取物 5F对 K562瘤株的抑瘤作用
药物 药物浓度
(μmol· L- 1) 　
抑瘤率 (% )
24h 48h 72h
5F 149. 7 　 57. 0 82. 6 91. 7
　 74. 9 　 48. 8 76. 8 88. 3
　 37. 4 　 35. 3 67. 6 83. 7
　 18. 7 　 10. 3 37. 0 51. 6
　 9. 4 　 0 14. 3 15. 6
　 IC50 (μmol· L- 1)　174. 1± 33. 430. 7± 10. 621. 4± 5. 11
5- FU 384. 6 　 17. 8 47. 8 77. 3
　 192. 3 　 10. 5 36. 5 68. 9
　 96. 2 　 6. 17 32. 5 57. 6
　 48. 1 　 3. 50 30. 5 54. 6
　 24. 0 　 2. 54 24. 5 47. 8
　 IC50 (μmol· L- 1)　 411± 59. 3 165± 50. 2 65. 4± 7. 54
表 5　 提取物 5F对荷艾氏腹水癌小鼠
的生命延长作用
组　别 剂量
( mg /kg )
生存时间
(天 )
生命延长率
%
对照组 10 13. 5± 1. 60 0
5FU 50 28. 1± 6. 83 108. 1* *
5F 50 23. 3± 8. 65 72. 6* *
5F 25 18. 2± 3. 40 34. 8*
5F 12. 5 15. 8± 1. 49 17. 0*
　　注: * P < 0. 05* * P < 0. 01 V S contr ol
表 3　 提取物 5F对荷瘤小鼠的抑瘤作用
组　别 剂量
( mg /kg )
实验前体重
( g )
实验后体重
( g )
瘤重
( g )
抑瘤率
(% )
对照组 　 20. 0± 1. 35 30. 2± 1. 78 1. 51± 0. 462 0
5- FU 10 20. 1± 1. 34 25. 9± 2. 61* 0. 871± 0. 315* 52. 3
5F 25 1. 98± 1. 42 28. 3± 1. 39 1. 09± 0. 260* 27. 8
5F 50 1. 99± 1. 37 26. 1± 1. 29 1. 07± 0. 292* 29. 1
5F 100 20. 1± 1. 52 27. 3± 1. 91 0. 874± 0. 243* 42. 1
　　注: * P < 0. 05* * P < 0. 01 V S contr ol
表 4　提取物 5F对荷瘤小鼠免疫器官及白细胞的影响
组　别 剂量
( mg /kg )
白细胞数
(× 108· L- 1 )
胸腺指数
(× 10- 3 )
脾脏指数
(× 10- 3 )
肝脏指数
(× 10- 3 )
对照组 　 11. 5± 2. 32 2. 96± 0. 681 5. 29± 0. 900 65. 7± 8. 28
5- FU 10 7. 68± 2. 04* * 1. 85± 0. 565* * 3. 83± 0. 695* * 61. 3± 9. 51
5F 50 11. 5± 3. 20 1. 80± 0. 823* * 6. 45± 1. 64* 72. 0± 7. 93
5F 25 12. 4± 2. 56 2. 42± 0. 834 6. 12± 1. 51* 74. 7± 9. 01
5F 12. 5 10. 5± 3. 15 2. 74± 0. 473 6. 67± 1. 51* 70. 0± 8. 23
　　注: * P < 0. 05* * P < 0. 01 V S contr ol
　　 2. 4　 提取物 5F对荷艾氏腹水癌小鼠生命延长作用
　 表 5显示结果显示 ,提取物 5F对荷艾氏腹水癌的小鼠
生命有延长作用 ,三个剂量组的 5F溶液对荷艾氏腹水癌
小鼠的生命延长率是 72. 6% 、 34. 8% 、 17. 0% ,差异有显
著性。
　　 3　讨　论　本课题组在筛选抗肿瘤植物药时发现半
边旗的乙醇及水提取物显示良好的体内外抗肿瘤活性。为
发掘其中的有效成分 ,对其水提物和醇提物进行进一步的
分离提纯 ,从醇提物中分离纯化得到 5个成分: 4F、 5F、
6F、 A及 B,经结构鉴定 , B是一个倍半萜类化合物 ,其余 4
个均为二萜类化合物。 本试验所提到的 5F含量是 46% ,
由于是动物试验需要的药量较多 ,因此未进一步提纯。 提
取物中 5F含量最多 ,体外试验抗肿瘤活性较强 ,为较理想
的目标化合物。
抗肿瘤药物的筛选方法中 ,我们选择了四氮唑蓝法
[M T T法 ]。 1983年由 Mosmann在免疫学研究中应用于
372 陕西中医 2006年第 27卷第 3期
鼠淋巴细胞系研究 IL- 2等细胞因于对细胞存活和增效
的影响 ,而建立 M TT方法 [12 ] ,随后 , Denizot和 carmichael
等作了进一步改进并获得更好的效果 ,使之运用于人类肿
瘤细胞体外药敏试验 [13, 14 ]。本研究采用标准抗肿瘤药物 5
- FU对 K562瘤株实验结果与文献 [15]报道结果一致 ,符
合检验要求 ,因此本试验的方法可行、实验结果可靠。
从体外试验中我们观察到提取物 5F有较强的抗肿瘤
活性 ,并且成剂量、时间依赖关系 ,药物作用 24小时后即
表现出明显的抑瘤作用 , 48h和 72h抑瘤作用明显 ,与阳
性药 5- FU相比 ,提取物 5F量效曲线陡直 , 而阳性药 5
- FU量效曲线则较平缓 ,反应出两药的不同特点 ,提取
物 5F最低药效浓度大于 5- FU的最低有效浓度 ,但高药
物浓度时提取物 5F的抑瘤率较 5- FU高 ,提取物 5F在
24、 48、 72h的 IC50均小于阳性药 5- FU ,表明提取物 5F
在体外有较强的抗肿瘤活性。
从癌细胞体外培养实验中 ,可得出提取物 5F具有抑
制和杀伤体外培养的癌细胞作用。但在体外实验中对癌细
胞有抑制和杀伤作用的药物 ,在活体中由于各种综合因素
的作用不一定具有抗肿瘤作用。为此进行了腹水型小白鼠
生存时间和荷瘤小白鼠瘤体生长抑制实验。在荷 HepA肝
癌小白鼠瘤体生长抑制实验中 ,观察到对照组肿瘤重大于
1. 0g ,阳性对照药 5- FU抑瘤作用为 52. 3% ,因此动物模
型可靠 ,用药组较对照组瘤体重量轻 ,表明提取物 5F同样
具有体内抗肿瘤活性。 在腹水型小白鼠生存时间实验中 ,
用药组比对照组小白鼠平均生存时间延长 ,表明提取物
5F能够抑制腹腔内小白鼠肿瘤细胞的生长。 试验中我们
观察到在有效的剂量下提取物 5F对小鼠的进食、活动、体
重影响较小 ,而阳性对照组 5- FU对小鼠的进食、活动影
响较大 ,体重也有明显降低。 常用抗肿瘤药物临床应用中
常常会引起患者白细胞降低的副作用 ,严重的病例不得不
停药 ,本试验中小鼠在使用 5- FU后体重降低的同时 ,白
细胞数也有明显的降低。而提取物 5F在治疗剂量下 ,对白
细胞数没有影响 ,为该药的一个显著特点 ,这一特点对其
开发成临床用药非常有利。同时我们也观察到有效剂量下
提取物 5F对小鼠的胸腺有抑制作用 ,用药后小鼠胸腺明
显萎缩 ,而脾脏重量则轻度增加。
综上所述 ,半边旗提取物 5F体外、体内均有抗肿瘤作
用 ,有效剂量下对荷瘤小鼠体重、白细胞数影响较小 ,具有
开发成新药的价值。
参考文献
1　丁恒山 ,主编 ,中国药用孢子植物 ,上海科学技术
出版社 , 1982: 104
2　崔　燎 ,梁念慈 ,陈志东 ,等 . 半边旗体内外抗癌
作用及急性毒性研究 .中国药材 , 1996; 19( 1): 29～ 32
3　张　 晓 ,崔　 燎 ,田中信寿 ,等 . 半边旗有效成分
及抗肿瘤活性研究 . 中国药学杂志 , 1997; 32( 1): 37～ 8
4　张　 晓 ,李金华 ,何承伟 ,等 半边旗中二萜化合物
的植化及抗肿瘤活性初步研究 . 中国药学杂志 , 1999; 34
( 8): 512～ 514
5　崔　 燎 ,张　 晓 ,梁念慈 ,等 . 一种新二萜类化合
物的体外抗肿瘤研究 .中国药理学通报 , 1998; 14( 1): 50～
2
6　何承伟 ,梁念慈 ,莫丽儿 ,等 . 半边旗提取物对 HL
- 60细胞的细胞毒作用及对细胞周期的影响 . 肿瘤防治
杂志 , 2001; 8( 4): 348～ 350
7　何承伟 ,梁念慈 ,莫丽儿 ,等 . 半边旗抗肿瘤有效
成分对 HL- 60细胞及淋巴细胞的体外杀伤作用及其构
效关系 .中草药 , 1999; 30增刊: 117～ 118
8　李金华 ,梁念慈 ,莫丽儿 ,等 半边旗 5种成分体外
细胞毒活性比较及构效关系分析 . 药学学报 , 1998; 33
( 9): 641～ 644
9　鄂　征 主编 ,组织培养技术 (修订本 ) ,北京: 人民
卫生出版社 , 1998: 29
10　 Hansen M B, N ielsen S E, Berg K. Reexamina-
tion and fuether development o f aprecise and rapid dye
methodformeasuring cell g r ow th /cell kill. J Immrno l
Methods, 1989; 119( 2): 203～ 10
11　徐叔云 ,卞如濂 ,陈修主编 . 药理实验方法学 ,第
2版 ,北京:人民卫生出版社 , 1991: 1426～ 8
12　 Mosmann T , Rapid colonim etric assay fo r cellu-
lar g row th and surv iv al : application to pro lifera tion and
eyto tox icithy essa y. J Immuno l M eth , 1983. 65: 55
13　 Denizo t F, Lang R, Rapid colorimet ric a sa yfo r
cell g rowth and surviva l, Modification to the tetrs zolium
dye procedure giv ing improved sensitivity and reliability. J
Immuno l Methods, 1986, 89: 271～ 277
14　 Ca rmichael J, Draff WG , Gazdar AF, e t a l. E-
valua tion o f a tet razolium based semiautomsted co lo rimet-
ric assay : assessment o f ch emosensitivity testing. Cancer
Res, 1987, 47: 936
15　姜圣亮 ,谭江平 ,石林祥 ,等 M T T法检测肝癌细
胞化疗敏感性方法学探讨同济大学学报 (医学版 ) 2002,
23( 4): 296- 298
(收稿 2005-08-31;修回 2005-07-21)
373陕西中医 2006年第 27卷第 3期