全 文 ：· 16· China Pharm acy 2005 Vol.16 No .1 中国药房 2005年第 16卷第 1期
*广西科学研究与技术开发项目(“桂科攻 0322024-5E”)
#主管药师,硕士。研究方向:生化药理学。电话:0773-2882506
Δ通讯作者。教授 , 博士研究生导师。电话:0771-5358272,
5358014。 E-mail:huangrenbin518@sohu.com
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(收稿日期:2004-02-26 修回日期:2004-03-24)
复方六月雪颗粒提取工艺研究 *
李 江 1 ,2 #,黄忠仕 1 ,蒋伟哲 1 ,林 军 1 ,黄仁彬 1Δ(1.广西医科大学药理学教研室 ,南宁市 530021;2.桂林医
学院附属医院药剂科 ,桂林市 541001)
中图分类号 R283 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2005)01-0016-04
摘 要 目的:优选复方六月雪颗粒提取工艺的最佳条件 。方法:先对处方中的药材用乙醇渗漉提取 ,药渣再用水煎煮提取 。以齐墩
果酸 、总黄酮含量为评价指标 , 用正交设计法对两步提取工艺条件进行考察 。结果:以 80%的乙醇为渗漉溶媒 ,溶媒用量为药材量
的 8倍 , 浸渍时间 24h作为乙醇渗漉提取的最佳工艺条件;以加水量为药材量的 12倍 ,每次煎煮 1.5h , 共煎煮 3次作为水煎煮提
取的最佳工艺条件 。结论:优选出的最佳工艺条件经验证其结果稳定 ,指标性成分含量高 ,可以用于投入生产 。
关键词 复方六月雪颗粒;正交设计;齐墩果酸;总黄酮
Study on Extraction Technique of Compound Liuyuexue Granules
LI Jiang , HUANG Zhong shi , JIANG Weizhe , LIN Jun , HUANG Renbin(Dept.of Pharmacolog y , Guangx i
M edical University ,Nanning 530021 ,China)
LI Jiang(Dept.of pharmacology , The Aff iliated Hospi tal of Guilin M edical University ,Guilin 541001 ,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To optimize the conditions o f the ex traction technique for compound Liuyuexue gran-
ules.METHODS :The herbs in fo rmulation were first ex tracted by e thanol percolating ,then the dregs w ere decocted with w ate r
to be ex t racted once m ore.T aking oleanolic acid and to tal f lavones as evalua tion m arkers , the ex traction technique in tw o-step
process w as evaluated by orthogonal design.RESULTS:The optimum condition o f e thanol percolating process w as tha t the
crude herb pow der w as soaked by 8-fold 80%e thanol for 24 hours and the optimum condition of wa ter decocting process w as
that the dregs w ere decocted fo r 3 times w ith 12-fold w a ter , 1.5 hour each time.CONCLUS ION :T he repeated experim ental
results are stable , and the contents o f com ponents for markers are high.The optimum conditions can be used fo r enla rged pro-
duction.
KEY WORDS Compound Liuyuexue granule;Orthogonal design;Oleano lic acid;Total flavones
中国药房 2005年第 16卷第 1期 Ch ina Pharmacy 2005 V ol.16 No.1 · 17·
复方六月雪颗粒是根据临床验方开发的一种纯中药复方
制剂 , 由白花蛇舌草 、栀子花根 、半枝莲 、垂盆草等 6味药材组
成 , 用于治疗急性黄疸性肝炎的湿热黄疸等证 。该处方中的白
花蛇舌草 、栀子花根主要含有齐墩果酸 、熊果酸等具有保肝降
酶作用的五环三萜类成分 [1 , 2 ] ,而半枝莲 、垂盆草等其余几味药
材大都含有黄酮类成分[ 3 ,4 ] 。因此 ,笔者在研究制剂工艺时以齐
墩果酸含量和总黄酮含量作为考察提取工艺条件的指标 。另
外 , 考虑到五环三萜类成分和黄酮类的苷元成分一般难溶于
水 , 为了尽可能地完全提取出药材中的活性成分 , 同时顾及中
药的传统用药习惯 ,最终决定采用醇 、水双提的方法 ,即采取先
对处方中的药材用一定浓度的乙醇进行渗漉提取 , 渗漉后的药
渣再用水进行煎煮提取的工艺 。笔者采用正交试验设计 , 对乙
醇渗漉提取和水煎煮提取两步骤的影响因素进行考察 ,对工艺
条件进行优选 , 以期为复方六月雪颗粒制剂工艺的确立提供科
学依据 。
1 仪器与试药
1.1 仪器
1525并联双泵 、 2487双波长紫外检测器 , Breeze色谱工
作站 (美国 Waters公司);TU -1800SPC 紫外可见分光光度
计(北京普析通用仪器公司);FA 2004电子天平(上海精密科学
仪器有限公司);RE-52AA 旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器
厂);T DL -5离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1.2 试药
齐墩果酸对照品(批号:0709-9803)、芦丁对照品(批号:
0080-9705),均由中国药品生物制品检定所提供 , 供含量测定
用;其余试剂均为分析纯;所用药材均购于南宁市药材公司 。
2 方法与结果
2.1 络合-分光光度法测定总黄酮含量 [5]
2.1.1 标准曲线的制备:准确称定芦丁对照品约 20mg , 用
50%乙醇定容于 100m l容量瓶中 ,制成对照品溶液 。准确量取
对照品溶液 0 、1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0ml ,分别置于 10ml容量
瓶中 , 各加入 50%乙醇适量使其为 5ml;再各加入 5%亚硝酸
钠溶液 0.3ml , 摇匀 , 放置 6min;各加入 10%硝酸铝溶液
0.3ml ,摇匀 ,放置 6min;再各加入 1%氢氧化钠溶液 4ml ,分别
用 50%乙醇稀释至刻度 ,摇匀 ,放置 15min ,制成待测对照品溶
液 。以第 1瓶为空白对照 ,在 510nm 波长处测定各浓度对照品
溶液吸收度 ,以吸光度(A)对浓度(C)进行线性回归 ,得回归方
程 C=0.08 548A —0.00 076(r=0.9 994), 表明芦丁 (总黄
酮)浓度线性范围为 0.0 190 ～ 0.0 960mg/ml 。
2.1.2 样品中总黄酮含量测定:按规定条件制备乙醇提取样
品和水提取样品 , 准确吸取各样品液 25ml , 分别进行如下操
作:乙醇渗漉提取液样品置于蒸发皿中水浴蒸干 , 用 50%的乙
醇溶解 ,定容于 100ml容量瓶中 ,备用;水煎煮提取液样品在搅
拌下缓慢加入 25ml无水乙醇使其乙醇含量达到 50%, 离心
(4 000r/min)15min后过滤 ,用 50%乙醇定容于 100m l容量瓶
中 ,备用。准确量取上述 2种备用液各 0 、1.0ml ,分别置于 10m l
容量瓶中 , 按 “2.1.1”项下方法操作 , 在 510nm 波长处测定吸
光度 , 代入回归方程计算总黄酮的含量 , 换算成处方药材总量
中总黄酮的含量 。
2.2 高效液相色谱法测定齐墩果酸的含量[ 6 ,7]
2.2.1 色谱条件:色谱柱为 Symmetry C 18柱 (150mm ×
4.6mm , 5μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(85∶15∶0.4),检
测波长为 210nm ,灵敏度为 0.01AUFS ,流速为 1.0ml/min ,柱
温为 35℃。此条件下齐墩果酸色谱峰的保留时间为 10.8min ,
理论塔板数为 11 200 ,分离度为 1.69 ,拖尾因子为 1.02 。
2.2.2 标准曲线的制备:准确称定齐墩果酸对照品约 25mg ,
以甲醇定容于 25ml容量瓶中 。精密量取对照品溶液 0.05 、
0.1 、0.2 、0.5 、1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0m l ,分别置于 10m l容量瓶
中 ,甲醇定容 ,进样 20μl。以进样量(X)对色谱峰面积(Y)进行线
性回归 ,得回归方程为 Y=227 000X+17 100(r=0.9 997),表
明齐墩果酸线性范围为 0.10 872 ～ 10.8 720μg 。
2.2.3 样品中齐墩果酸含量测定:按规定条件制备醇提取样
品 。准确吸取样品液 20ml , 水浴蒸干 , 加入氯仿 50m l和水
100m l溶解并转移至 250ml分液漏斗内 , 加入饱和氯化钠溶液
20ml ,振荡萃取 10min , 分取氯仿层。同法再用水萃取 、洗涤 2
次 ,每次 100ml 。合并氯仿层 , 水浴蒸干 , 用流动相溶解过滤后
定容于 100ml 容量瓶中 。经 0.45μm 微孔滤膜过滤后进样
20μl ,测定峰面积 ,代入回归方程计算齐墩果酸的进样量 ,换算
成处方药材总量中齐墩果酸的含量 。
2.3 工艺条件筛选的正交试验设计
2.3.1 乙醇渗漉提取工艺:乙醇渗漉提取的主要目的是提取
以齐墩果酸和黄酮苷元为代表的难溶于水的有效成分 , 因此以
齐墩果酸和总黄酮含量作为考察影响因素 、筛选工艺条件的指
标 ,选择乙醇浓度(A)、溶媒用量(B ,以药材量的倍数计算)、浸
渍时间(C)作为试验因素 ,每个因素备选了 3个水平 ,详见表 1。
表 1 乙醇渗漉提取正交试验因素水平表
Tab 1 Table of factors and leve ls for ethanol percolating
orthogonal exper iment
水平 A(%) B(倍) C(h) 空白
1 80 10 72 1
2 70 9 48 2
3 60 8 24 3
利用 L9(34)正交表安排试验 , 方法:按处方中各药材用量
比例称取各药材粗粉适量 , 根据 《中国药典》 2000版(一部)附
录“流浸膏和浸膏剂”项下渗漉操作的技术要求 ,按各次试验因
素水平的要求进行湿润 、装筒 、浸渍和渗漉操作 ,渗漉速度控制
在 3ml/min左右 。渗漉液用经过容量校正的量筒收集 ,按规定
的溶媒用量收集到预定容积后 ,保存于密闭容器中供测定 。
2.3.2 水煎煮提取工艺:水煎煮提取的目的是提取以黄酮苷
类为代表的水溶性有效成分 , 故以总黄酮含量为指标 , 以加水
量(D , 以药材量的倍数计算)、煎煮时间(E , 以沸腾时开始计
时)、煎煮次数(F)作为试验因素 ,每个因素备选了 3个水平 ,详
见表 2 。
表 2 水煎煮提取正交试验因素水平表
Tab 2 Table of factors and levels for water decocting or-
thogonal experiment
水平 D(倍) E(h) F(次) 空白
1 12 2 3 1
2 10 1.5 2 2
3 8 1 1 3
利用 L9(34)正交表安排试验 , 方法:按处方中各药材用量
比例称取各药材粗粉适量 , 以筛选的最佳乙醇渗漉提取工艺完
成渗漉操作后 , 取压榨溶媒后的药渣 , 按各次试验因素水平的
要求进行煎煮处理。煎煮液趁热用纱布过滤 ,合并各次滤液 。滤
液冷却后离心(4 000r/min)15min除去杂质 ,合并上清液 ,置
于旋转蒸发器中浓缩(温度为 65 ℃,压力为 0.09Mpa),冷却后
· 18· China Pharm acy 2005 Vol.16 No .1 中国药房 2005年第 16卷第 1期
用水转移定容于 1 000ml容量瓶中 ,离心(4 000r/min)15min
后取上清液测定 。
2.4 试验结果及分析
2.4.1 乙醇渗漉提取各次正交试验结果及方差分析详见表
3 、表 4 。
表 3 乙醇渗漉提取正交试验结果
Tab 3 The result s of ethanol percolating orthogonal ex-
periment
编号 A(%) B(倍) C(h) 空白 总黄酮含量(mg/g)
齐墩果酸含
量(mg/g)
综合
评分
1 1 1 1 1 8.48 1.03 0.70
2 1 2 2 2 8.07 0.97 0.66
3 1 3 3 3 8.87 1.30 0.85
4 2 1 2 3 17.44 0.45 0.54
5 2 2 3 1 10.84 0.50 0.46
6 2 3 1 2 10.07 0.28 0.32
7 3 1 3 2 9.78 0.28 0.32
8 3 2 1 3 10.80 0.18 0.28
9 3 3 2 1 12.80 0.21 0.33
总黄酮 Ⅰj 25.41 35.71 29.36 32.12 (∑X)2/9=1 048.74
Ⅱj 38.35 29.71 38.31 27.92
Ⅲj 33.39 31.74 29.48 37.11
Rj 12.93 6.00 8.95 9.19
齐墩果酸 Ⅰj 3.30 1.76 1.50 1.75 (∑X)2 /9=3.01
Ⅱj 1.23 1.65 1.63 1.53
Ⅲj 0.67 1.80 2.08 1.93
Rj 2.63 0.15 0.58 0.40
综合评分 Ⅰj 2.21 1.56 1.31 1.49 (∑X)2 /9=2.22
Ⅱj 1.32 1.40 1.53 1.30
Ⅲj 0.93 1.51 1.63 1.68
Rj 1.28 0.16 0.32 0.38
表 4 乙醇渗漉提取正交试验结果方差分析
Tab 4 Analysis of variance for results of ethanol perco-
lat ing orthogonal exper iment
变异来源 L j V M S F P
总黄酮 A 28.3 778 2 14.1 889 2.0 093 >0.05
B 6.2 117 2 3.1 058 0.4 398 >0.05
C 17.5 718 2 8.7 859 1.2 442 >0.05
误差 14.1 230 2 7.0 615
齐墩果酸 A 1.2 849 2 0.6 424 46.6 197 <0.05
B 0.0 038 2 0.0 019 0.1 373 >0.05
C 0.0 629 2 0.0 314 2.2 806 >0.05
误差 0.0 276 2 0.0 138 >0.05
综合评分 A 0.2 866 2 0.1 433 12.1 556 >0.05
B 0.0 045 2 0.0 022 0.1 908 >0.05
C 0.0 177 2 0.0 088 0.7 486 >0.05
误差 0.0 236 2 0.0 118
F 0.0 5(2 , 2)=19.00
由表 3可知 , 乙醇渗漉试验各因素对总黄酮提取率的影响
大小为 A >C>B ,最佳工艺条件为A 2B1C 2;对齐墩果酸提取率
的影响大小也为 A >C >B ,最佳工艺条件为 A 1B3C 3。表 4方差
分析的结果表明 ,A 因素对齐墩果酸提取率的影响具有统计学
上的显著性差异 , 而 B 、C因素对齐墩果酸提取率的影响无显
著性差异;A 、B 、C 3个因素对总黄酮的提取率的影响均无统计
学上的显著性差异 。由于乙醇渗漉提取的主要目标是更完全地
提取出药材中水不溶性的抗肝炎有效成分齐墩果酸 , 而大部分
水溶性较好的黄酮苷类成分还可通过水煎煮提取 , 故以齐墩果
酸含量权重为 70%、总黄酮含量权重为 30%进行加权综合评
分 。由综合评分的极差分析可知 , 各因素对综合评分的影响大
小为 A >C>B , 最佳工艺条件为 A 1B1C 3;方差分析的结果表
明 ,A 、B 、C 3个因素对综合评分的影响均无统计学上的显著性
差异 。对上述结果进行综合分析 , 考虑到 B因素的 B1和 B3水
平均值差异不大 , 而 B3水平比 B1水平能显著降低乙醇用量 ,
降低生产成本 ,故选择最佳工艺条件为 A 1B3C 3 ,即以 80%的乙
醇为渗漉溶媒 ,溶媒用量为药材量的 8倍 ,浸渍时间为 24h 。
按照最佳渗漉提取工艺条件进行 3次验证性试验 , 齐墩果
酸平均含量为 1.24mg/g ,总黄酮平均含量为 8.82mg/g ,证明
该工艺稳定 、可行 。
2.4.2 水煎煮提取各次正交试验结果及方差分析见表 5 、表 6。
表 5 水煎煮提取正交试验结果
Tab 5 The results of water decoct ing orthogonal experi-
ment
编号 D(倍) E(h) F(次) 空白 总黄酮含量(mg/g)
1 1 1 1 1 4.11
2 1 2 2 2 3.28
3 1 3 3 3 2.70
4 2 1 2 3 3.36
5 2 2 3 1 2.89
6 2 3 1 2 3.50
7 3 1 3 2 1.89
8 3 2 1 3 3.32
9 3 3 2 1 2.72
总黄酮 Ⅰj 10.08 9.36 10.93 9.70 (∑X)2 /9=85.60
Ⅱj 9.74 9.48 9.36 8.68
Ⅲj 7.93 8.92 7.47 9.38
Rj 2.15 0.56 3.46 1.03
表 6 水煎煮提取正交试验结果方差分析
Tab 6 Analysis of variance for results of water decocting
orthogonal exper iment
变异来源 L j V M S F P
总黄酮 A 0.8 917 2 0.4 458 4.8 599 >0.05
B 0.0 586 2 0.02 931 0.3 195 >0.05
C 2.0 004 2 1.0 002 10.9 025 >0.05
误差 0.1 835 2 0.0 917
F 0.05(2 , 2)=19.00
由表 5可见 , 水煎煮提取试验各因素对总黄酮提取率的影
响大小为 C>A >B ,最佳工艺条件为 A 1B2C 1。表 6方差分析结
果表明 ,A 、B 、C 3个因素对总黄酮提取率的影响均无统计学上
的显著性差异 。故选择最佳工艺条件为 A 1B 2C1 ,即加水量为药
材量的 12倍 ,每次煎煮 1.5h ,共煎煮 3次 。
按照最佳水煎煮提取工艺条件进行 3次验证性试验 , 总黄
酮平均含量为 4.21mg/g ,证明该工艺稳定 、可行 。
3 讨论
在采用高效液相色谱法测定供试品齐墩果酸含量中 , 在进
行氯仿与水之间的萃取操作时 , 由于存在乳化现象 , 因此氯仿
层与水层分层不明显且需静置相当长的时间 , 故导致测定周期
长且测定结果波动很大 。为此 , 笔者每次在进行萃取操作时加
入了一定量的饱和氯化钠溶液 , 基本消除了乳化现象 , 测定结
果令人满意 。
在考察乙醇渗漉提取工艺的影响因素时 , 本来渗漉速度也
为影响渗漉提取的主要影响因素之一 , 但考虑到实验室中进行
的工艺条件研究与实际生产状况相去甚远 , 本次试验不将渗漉
速度作为考察因素 , 而仅将其固定为 3m l/min左右 ,待中试阶
段或大生产时再作重点考察 。在考察水煎煮提取工艺的影响因
素时 , 原料药材的浸泡时间本来亦为主要的影响因素之一 , 但
考虑到水煎煮提取的原料药材在前一步骤的乙醇渗漉提取时
中国药房 2005年第 16卷第 1期 Ch ina Pharmacy 2005 V ol.16 No.1 · 19·
*四川省教育厅自然科学科技项目(2003A 058)
#副主任药师 , 硕士研究生导师。研究方向:制剂开发、临床药
学。电话:0830-3162076
Determination of Serum Concentrations of Chuanxiong Extract and Its Action on Ca
2+-activated K Cha_
nnel in Animals
YE Yun , FENG Bimin , ZHANG Hao(Pharmacy of Af f iliated Hospi tal of Luzhou M edical College , Luzhou
646000 ,China)
Yang Yan , YANG Yanyan(Lab.of M yocardium Elect rophy siolog y , Luzhou M edical College ,Luzhou 646000 ,
China)
ABSTRACT OBJECT IVE:To try to establish a combined serum-pharmacology and elect rophysiology method fo r the study
o f m echanism of chuanx iong ex trac t in dila tating coronary ar te ry.M ETHODS:Chuanxiong ex tract w as intragast rically g iven to
rats and mice , then t he serum con tents of te tramethy lpyrazine(TMP)w ere dete rmined by HPLC , w hich provided data fo r
electrophysiological study.The action o f chuanxiong ex t ract on Ca2 +-activa ted K channel(Kca)o f sm oo th muscle of co ronary
a rte ry in pigs w as studied by patch clamp technique.RESU LTS:The calibration curve of T MP w as linear in the range o f
0.216 ～ 54μg/ml(r=0.9 999).The recovery w as 100.7%～ 102.4%.The serum concentrations of TMP in rats and mice were
(3.56±3.01)and (8.19±6.57)μg/ml respectively.T he chuanxiong ex tract could no t m arkedly ac tivate the Kca of smoo th
muscle o f co ronary ar tery in patch clamp study.CONCLUSION :The established method fo r TM P dete rmination is feasible and
relieable.In o rder to im prove the combined electrophysio logy and serum pharmacology technique ,high quality medical m aterials
should be adopted and the bioavailability improved.
KEY WORDS Chuanxiong ;Tet ramethylpyrazine;HPLC;Serum -pharmacology ;Patch clam p technique
川芎提取液动物血药浓度测定及其对钙激活钾通道作用初探 *
叶 云 1# ,杨 艳 2 ,冯碧敏 1 ,张 昊 1 ,杨艳艳 2(1.四川泸州医学院附属医院药剂科 ,泸州市 646000;2.四川
泸州医学院心肌电生理学研究室 ,泸州市 646000)
中图分类号 R285.5;R965 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2005)01-0019-04
摘 要 目的:尝试建立电生理与血清药理学技术相结合的方法用于川芎提取液扩张冠状动脉机制的研究。方法:对大 、小鼠灌胃
给予川芎提取液后 ,用高效液相色谱(HPLC)法测定鼠血清中川芎嗪(TM P)的含量 ,为电生理实验提供依据;用膜片钳方法研究川
芎提取液对猪冠状动脉平滑肌钙激活钾通道的作用 。结果:TMP 血清浓度线性范围为 0.216 ～ 54μg/m l(r=0.9 999),回收率为
100.7%～ 102.4%,大 、小鼠血药浓度分别为(3.56±3.01)、(8.19±6.57)μg/ml;膜片钳实验结果表明鼠含药鼠血清对猪平滑肌
上钙激活钾通道没有显著激活作用 。结论:本文建立的测定 TPM 含量的方法适用 、可靠;应选用高质量药材或提高药物的生物利
用度才有望完善电生理与血清药理学技术相结合的方法。
关键词 川芎;川芎嗪;高效液相色谱法;血清药理学;膜片钳技术
已经得到充分的浸泡溶胀 , 再重复进行浸泡过程的实际意义不
大 ,故取渗漉提取后的药渣 ,榨干残余溶媒后直接进行煎煮 。
在测定制剂工艺研究的指标时 , 取样一般多采用重量法 ,
将渗漉或煎煮提取的样品浓缩 、干燥制成干浸膏 , 刮取干浸膏
并称定其总重 , 粉碎后精密称取一定量的干浸膏粉末 , 通过超
声或回流提取指标性成分 , 再经过稀释 、定容等步骤制成待测
供试品 。尽管该方法保证了取样的均一性 ,但操作步骤繁杂 ,每
一步均容易产生误差 ,操作周期很长 。因此 ,本次试验采用容量
法取样 , 在渗漉提取时用容量校正过的量筒收集样品定容 , 而
在水煎煮提取时将样品浓缩后置于容量瓶中定容后取样 , 尽管
浓缩后有少量固体析出 , 在一定程度上对定容的准确性有影
响 , 但取样前笔者对浓缩液进行了离心处理 , 保证了样品的均
一性 , 使各次试验样品之间具有等同对照性;且由于简化了操
作步骤 ,实际上累积误差应比重量法更小。
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(收稿日期:2004-01-17 修回日期:2004-03-01)