全 文 ：研究报告
Research Report
半边旗二萜类成分 PAG通过 ROS诱导肝癌细胞凋亡的作用研究
巫鑫 1 廖红波 2* 仇双利 1 朱晓辉 1 张森旺 1 卢晓芬 1 何晓虹 1 崔燎 1 吴科峰 1
1广东医科大学广东天然药物研究与开发实验室,湛江, 524023; 2广东医科大学药学院药理学教研室,湛江, 524023
*通讯作者, 154609954@qq.com
摘 要 探讨半边旗二萜类成分 Pteisolic acid G (PAG)对人肝癌细胞 HepG2增殖和凋亡的影响及作用机
制。用不同浓度的 PAG处理 HepG2细胞后，采用MTT法检测细胞存活率；采用 PI单染法检测细胞周期分
布；采用 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；采用 RT-PCR和Western Blotting检测细胞内 mRNA
和蛋白表达情况；采用 DCFH-DA法检测细胞内 ROS水平，采用 ROS抑制剂乙酰半胱氨酸(NAC)评价 PAG
细胞增殖抑制作用对 ROS的依赖性。结果表明，在 24 h、48 h和 72 h时，PAG可剂量依赖性地抑制 HepG2
细胞的增殖(p<0.05)，IC50分别为 64.8 μmol/L、38.5 μmol/L和 24.8 μmol/L；用药 24 h时 PAG可剂量依赖性地
使 HepG2细胞阻滞在 G2/M期，同时增加 HepG2细胞凋亡率(p<0.05)；PAG可剂量依赖性地降低 HepG2细
胞内 Bcl-2 mRNA和 caspase 3、PARP、Bcl-2蛋白的表达(p<0.05)，增加 Bax mRNA 和 actived-caspase 3、
cleaved-PARP、Bax蛋白的表达(p<0.05)。当使用 1 mmol/L的 ROS抑制剂 NAC预处理 HepG2细胞时，PAG
对 HepG2细胞增殖抑制作用被显著阻断。上述结果表明，半边旗二萜类成分 PAG可提高 Bax/Bcl-2的基因
和蛋白表达比值，从而诱导肝癌细胞 HepG2凋亡，该作用可能是通过升高细胞内 ROS水平来实现的。
关键词 半边旗,贝壳杉烷型二萜, PAG,肝癌, HepG2
Induction of Apoptosis by PAG from Pteris semipinna in Hepatocarcinoma
Cells through ROS
Wu Xin 1 Liao Hongbo 2* Qiu Shuangli 1 Zhu Xiaohui 1 Zhang Senwang 1 Lu Xiaofen 1 He Xiaohong 1
Cui Liao 1 Wu Kefeng 1
1 Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs, Guangdong Medical University, Zhanjiang, 524023; 2 Department of
Pharmacology, GuangdongMedical University, Zhanjiang, 524023
* Corresponding author, 154609954@qq.com
DOI: 10.13417/j.gab.035.001288
Abstract This study was aimed to investigate the effects and mechanisms of PAG from Pteris semipinna on
proliferation and apoptosis of human hepatocarcinoma HepG2 cells. Cell growth inhibition of PAG was evaluated
by MTT assay after treated with different concentrations of PAG HepG2 cells. Cell-cycle distribution and
apoptosis were analyzed by flow cytometry after treatment of PI and Annexin V-FITC/PI, respectively. The
expression of apoptosis-related proteins and mRNA were measured by Western bolt and RT-PCR, respectively.
ROS generation was also measured by flow cytometry after treatment of DCFH-DA. The ROS dependence of the
cytotoxicity of PAG was evaluated by pre-treatment of NAC. The results showed that at 24 h, 48 h and 72 h, PAG
was dose dependent to inhibit the proliferation of HepG2 cells (p<0.05), and IC50 was 64.8 μmol/L, 38.5 μmol/L,
24.8 μmol/L, respectively. When taking drugs for 24 h, PAG was dose dependent to make the HepG2 cells block
to G2/M, and the apoptosis rate was increased (p<0.05). PAG could significantly reduce the protein expression of
caspase 3, PARP and Bcl-2, and the mRNA expression of Bcl-2 (p<0.05), while increase the protein expression of
actived-caspase 3, cleaved-PARP and Bax, and the mRNA expression of Bax (p<0.05). When using 1 mmol/L ROS
inhibitors NAC pretreatment HepG2 cells, cell proliferation inhibition of PAG to HepG2 was blocking
基金项目：本研究由国家自然科学基金青年基金(81503226)和广东大学生科技创新培育专项资金项目(pdjh2015b0299)共同资助
基因组学与应用生物学，2016年，第 35卷，第 6期，第 1288-1293页
Genomics and Applied Biology, 2016, Vol.35, No.6, 1288-1293
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
半边旗(Pteris semipinnata L.)是凤尾蕨科半边旗
属植物，在我国南方各省分布广泛，常用于外伤出
血、跌打损伤、抗菌痢、肠炎、肝炎等疾病的治疗(丁
恒山, 1992)。由于半边旗中的主要成分——贝壳杉
烷型二萜具有显著的细胞毒性，自上世纪 90年代以
来，本实验室对其化学成分、抗肿瘤活性和作用机制
等开展了较为系统的研究(吴科锋和梁念慈, 2010;叶华
等, 2014)。在此基础上，本课题组对半边旗的化学成
分进行了进一步的探索，并从中分离得到了一系列
的二萜类成分。本研究就其中的主要成分之一 PAG
对人肝癌细胞 HepG2 的增殖和凋亡的影响及其作
用机制进行了初步的探讨，从而为半边旗二萜类成
分在肝癌治疗中的应用提供实验基础。
1结果与分析
1.1 PAG对 HepG2细胞增殖的影响
MTT结果表明，与对照组相比，作用 24 h、48 h
和 72 h 时，PAG可剂量依赖性地抑制 HepG2 细胞
的增殖，IC50 分别为 64.8 μmol/L、38.5 μmol/L 和
24.8 μmol/L (图 1)。
1.2 PAG对 HepG2细胞周期的影响
细胞周期测定结果显示，与对照组相比，用药 24 h
时 PAG (25μmol/L, 50 μmol/L和 75μmol/L)可剂量依
赖性地降低HepG2细胞在G1期的分布，增加在G2/M
期的分布(p<0.05)，而对其在 S的分布影响不明显，也就
是说 PAG可以使细胞阻滞在G2/M期(p>0.05) (图 2)。
1.3 PAG对 HepG2细胞凋亡的影响
Annexin V-FITC/PI双染的流式细胞仪检测结果
显示(图 3)，与对照组相比，用药 24 h时 PAG可浓度
依赖性(25 μmol/L,50μmol/L,75μmol/L)地增加HepG2
细胞凋亡率(p<0.05)。
1.4 PAG 对HepG2 细胞 caspase 3 和 PARP 蛋白表
达的影响
Western Blotting检测结果表明，PAG可剂量依
赖性地(25μmol/L,50μmol/L和 75μmol/L)降低HepG2
图 2 PAG对 HepG2细胞周期分布的影响(x ±SD, n=3)
注: *:与对照组相比, p<0.05
Figure 2 The effect of PAG on the cell cycle distribution of
HepG2 cells (x ±SD, n=3)
Note: *: Compared with control group, p<0.05
图 1 PAG的结构及其对 HepG2细胞增殖的影响( x±SD, n=3)
注: *:与对照组相比, p<0.05
Figure 1 The structure of PAG and its effect on the growth of
HepG2 cells ( x ±SD, n=3)
Note: *: Compared with control group, p<0.05
significantly. These results indicated that PAG from Pteris semipinna could induce apoptosis in hepatocarcinoma
cells by upregulated the ratio of Bax/Bcl-2 both in gene and protein level, which might be related with its
intracellular ROS generation effect.
Keywords Pteris semipinnata, ent-kaurane diterpenoids, PAG, Hepatocarcinoma cell, HepG2
1289
细胞凋亡蛋白 caspase 3和 PARP的表达，增加 ac-
tived-caspase 3和 cleaved-PARP的表达(图 4)。
1.5 PAG 对 HepG2 细胞 Bax 和 Bcl-2 蛋白表达的
影响
Western Blotting检测结果表明，Bax和 Bcl-2的
蛋白表达研究表明，PAG可浓度依赖性地(25 μmol/L,
50 μmol/L 和 75 μmol/L) 显著提高 HepG2 细胞中
Bax/Bcl-2的蛋白比值(图 5)。
1.6 PAG 对 HepG2 细胞 Bcl-2 和 Bax 基因 mRNA
表达的影响
RT-PCR结果表明，与对照组相比，PAG作用于
HepG2细胞后，可剂量依赖性地(25 μmol/L,50 μmol/L
和 75 μmol/L)降低 Bcl-2 基因，上调 Bax 基因 (p<
图 3 PAG对 HepG2细胞凋亡率的影响( x±SD, n=3)
注: *:与对照组相比, p<0.05
Figure 3 The effect of PAG on the apoptosis of HepG2 cells ( x±
SD, n=3)
Note: *: Compared with control group, p<0.05
图 4 PAG对 HepG2细胞 caspase 3和 PARP蛋白的影响
Figure 4 The effect of PAG on the protein expression of caspase
3 and PARP
0.05) (图 6)。
1.7 PAG对 HepG2细胞内 ROS的影响
DCFH-DA检测结果表明 PAG可浓度依赖性地
(25 μmol/L, 50 μmol/L和 75 μmol/L)显著增加HepG2
细胞内 ROS水平(图 7)。
图 6 PAG对 HepG2细胞 Bax和 Bcl-2 mRNA表达的影响(x±
SD, n=3)
注: *:与对照组相比, p<0.05
Figure 6 The effect of PAG on the mRNA expression of Bax and
Bcl-2 ( x±SD, n=3)
Note: *: Compared with control group, p<0.05
半边旗二萜类成分 PAG通过 ROS诱导肝癌细胞凋亡的作用研究
Induction of Apoptosis by PAG from Pteris semipinna in Hepatocarcinoma Cells through ROS
图 5 PAG对 HepG2细胞 Bax/Bcl-2的影响( x±SD, n=3)
注: *:与对照组相比, p<0.05
Figure 5 The effect of PAG on the protein expression of Bax and
Bcl-2 ( x±SD, n=3)
Note: *: Compared with control group, p<0.05
1290
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
1.8 NAC对 PAG抑制 HepG2细胞增殖的影响
MTT检测结果表明，当使用 1 mmol/L的 ROS
抑制剂 NAC对 HepG2细胞预处理 1 h时，各测试浓
度的 PAG在 24 h、48 h和 72 h三个时间点对HepG2
细胞的细胞毒性均被不同程度地抑制(图 8)。
2讨论
近年来，原发性肝癌的全球发病率逐步升高，已
成为临床常见恶性肿瘤之一。由于其具有起病隐匿，
早期无症状或症状不明显，进展迅速等特点，导致大
多数患者在确诊时已到局部晚期或发生远处转移，
已错过最佳的手术治疗窗口，只能进行辅助性综合
治疗(中华人民共和国卫生部, 2011)。因此，化疗成为
肝癌综合治疗的重要手段之一。寻找和开发能有效
抑制肝癌细胞增殖的药物对肝癌的临床治疗具有极
其重要的意义。
图 7 PAG对 HepG2细胞内 ROS水平的影响(x ±SD, n=3)
注: *:与对照组相比, p<0.05
Figure 7 The effect of PAG on intracellular ROS generation of
HepG2 cells (x ±SD, n=3)
Note: *: Compared with control group, p<0.05
众所周知，多数药物的抗肿瘤作用是通过促进
细胞凋亡来实现的。Caspase家族成员介导的蛋白酶
级联反应是细胞凋亡的主要途径之一。在凋亡诱导
信号的作用下，启动型 caspases与特异辅因子结合
后，激活下游效应型 caspases，从而水解细胞内的靶
物质，最终导致细胞不可逆的走向死亡(Shi, 2002)。
作为 caspase 家族中的主要效应成员，Caspase-3是
多种凋亡途径的共同下游效应因子，在细胞凋亡过
程中占据主导地位，因此，又被称为“死亡执行蛋白
酶”(Odonkor and Achilefu, 2009)。caspase-3活化后
可切割其主要底物聚腺苷二磷酸核糖多聚酶
(PARP)，该酶可影响 DNA复制、转录和损伤修复，从
而导致细胞凋亡(Hashimoto et al., 1997)。本研究表明
半边旗二萜类成分 PAG降低了 HepG2细胞 caspase
3 和 PARP 的蛋白表达，增加 actived-caspase 3 和
cleaved-PARP 的蛋白表达，其促凋亡作用明显有
caspase 3的参与。作为 Caspase-3的上游调控因子，
Bcl-2和 Bax在细胞凋亡过程中发挥着关键调节作
用,被认为是细胞凋亡开关(丛义梅等, 2008)。Bcl-2
基因和蛋白主要发挥抗凋亡作用，可阻止许多因素所
诱导的细胞凋亡，而 Bax基因和蛋白主要起促凋亡作
用，二者的比例是决定细胞发生凋亡与否的重要调控
因素(Burguillos et al., 2011)。本研究表明，半边旗二萜
类成分 PAG正是通过增加 Bax/Bcl-2蛋白和基因的
比值来实现促进肝癌细胞 HepG2发生凋亡的。
作为细胞通路中的重要第二信使，活性氧自由
基(reactive oxygen species, ROS)对正常的生理过程
具有重要的作用。但是其过度表达可以直接或间接
氧化或损伤 DNA、蛋白质和脂质，进而导致细胞凋
亡或坏死。研究表明，肿瘤细胞更易产生 ROS，从而
使得其更易受到促氧化剂的损伤。所以，利用促氧化
剂抗肿瘤被认为是一种有效的策略(Martin-Cordero
et al., 2012)。本研究表明，半边旗二萜类成分 PAG是
一种有效的 ROS促生成剂，且其抗肿瘤作用可被
ROS抑制剂 NAC阻断。
综上所述，半边旗中的贝壳杉烷型二萜类成分
PAG对人肝癌细胞 HepG2具有显著的细胞毒性，其
作用机制可能与增加细胞中 ROS水平，从而诱导细
胞凋亡有关。但是其具体的作用机制还有待更深入
的研究，其在肝癌治疗中的作用也有待进一步的体
内试验证实。
3材料与方法
3.1研究材料及所用试剂
PAG由广东医科大学天然药物开发与开发实验
图 8 NAC对 PAG的增殖抑制作用的影响(x ±SD, n=3)
注: *:与对照组相比, p<0.05
Figure 8 The effect of NAC on the growth inhibition of NAC in
HepG2 cells (x ±SD, n=3)
Note: *: Compared with control group, p<0.05
1291
室从半边旗地上部位中分离纯化，并鉴定为贝壳杉
烷型二萜类成分 Pteisolic acid G (PAG)；人肝癌细胞
HepG2 由广东医科大学病理生理教研室馈赠；
DMEM高糖培养基(Invitrogen)、胎牛血清(Gibco)购
于赛默飞世尔科技公司。Annexin V-FITC试剂盒购
于 BD公司；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、活性
氧检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂
解液、ECL化学发光液、抗体稀释液等均购于碧云天
生物技术有限公司；β-actin、caspase 3、actived-cas-
pase 3、PARP、cleaved-PARP、Bcl-2、Bax抗体购于美
国 Cell Signaling Tecchnolgy公司。
3.2细胞培养
将HepG2细胞接种于含 10%胎牛血清、100μg/mL
青霉素和 100 μg/mL链霉素的高糖 DMEM培养基
中，置于 37℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞生长至
80%融合度时，用 0.25%胰蛋白酶消化，传代。
3.3 MTT细胞增殖抑制实验
取对数生长期的 HepG2细胞，经胰酶消化后，
用含 10%胎牛血清的 DMEM培养基配成活细胞密
度为 3×104个/mL的细胞液，按每孔 90 μL接种于
96孔培养板中，培养过夜后每孔加入 10 μL含 PAG
的药液，使其终浓度分别为 0 μmol/L、3.125 μmol/L、
6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L
和 75.0μmol/L，每个浓度设 6个复孔。继续培养 24 h、
48 h 或 72 h 后每孔加 MTT (5 mg/mL) 20 μL，继续
孵育 4 h后弃去培养液，每孔加入 200 μL二甲基亚
砜(DMSO)，在摇板机上震荡 10 min，用酶标仪测定
各孔光密度值(570 nm)。
3.4 PI法检测细胞周期分布
将对数生长期的人肝癌 HepG2 细胞以细胞数
1×105/孔接种于 6孔板中，加药 24 h后收集细胞于
EP管中，用 PBS洗涤 2次，4℃预冷的 70%乙醇过夜
固定细胞，次日离心弃上清，再次用 PBS洗涤细胞 1
次，每管细胞样品中加入 0.6 mL PI染色液(1×PBS,
50 μg/mL PI, 2.5 μg/mL RNase)，缓慢重悬细胞沉淀，
37℃避光染色 30 min，400目滤布过滤，用流式细胞
仪检测细胞周期分布。
3.5 Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率
取对数生长期的 HepG2细胞，以细胞数 1×105/孔
接种于 6孔板中，加药 24 h后收集细胞，PBS洗涤 2
次，将细胞重悬于 195 μL的 Annexin V-FITC结合
液中，室温避光孵育 15 min 后加入 5 μL Annexin
V-FITC、5μL PI，最后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
3.6 Western Blotting检测相关蛋白的表达
将对数生长期的人肝癌 HepG2细胞以细胞数 5×
105/孔接种于 6孔板中，加药 24 h后收集细胞，根据
需要用不同的蛋白提取方法提取细胞的总蛋白。BCA
法进行蛋白定量，以 10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋
白质，将分离后的蛋白质转移至 NC膜上，用 5%脱脂
奶粉封闭 2 h，TBST洗涤 10 min，一抗 4℃摇床过夜，
TBST洗涤 3次，每次 15 min，HRP标记的二抗室温
孵育 2 h，TBST洗涤 3次，每次 15 min，最后在暗室进
行 ECL化学发光显色和曝光。
3.7 RT-PCR检测相关 mRNA的表达
将对数生长期的人肝癌 HepG2细胞接种于培养
瓶中，加药 24 h后收集细胞，Trizol试剂提取细胞总
RNA。RT-PCR法检测采用染料法(SYBRGreenⅠ)进
行，数据以 2－△△Ct对 Bax mRNA和 Bcl-2 mRNA (引
物设计合成 Bax上游引物为 5-TTTGCTTCAGGGT
TTCATCCA-3,下游引物为 5-CATCCTCTGCAGC
TCCATGTT-3; Bcl-2上游引物为 5-CATGTGTG
TGGAGAGCGT CAA-3,下游引物为 5-GGGCCG
TACAGTTCCACAAA-3;内参基因 GAPDH上游引
物 为 5-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3,
下游引物为 5-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATG
TTC-3)行相对定量分析(刘盛楠等, 2015)。
3.8细胞内 ROS的测定
根据试剂盒说明进行检测，PAG给药 6 h后，收
集细胞，用 10 μmol/LDCFH-DA于 37℃、5% CO2培
养箱中处理 30min，流式细胞仪检测细胞内ROS水平。
3.9 NAC对 PAG细胞毒性的作用测定
按 3.2法处理细胞，PAG给药前 1 h，加入终浓度
为 1 mmol/L的 NAC进行预保护，其它步骤同 3.3测
定细胞活性。
3.10数据处理
所有实验结果源自 3次独立实验，数据采用 x ±
SD表示。采用 GraphPad Prism 5.0软件处理数据结
果；用 SPSS 19. 0 统计软件中的单因素方差分析
(One-way ANOVA)进行检验，先用 Levenes test对数
据进行方差齐性检验，如方差齐则采用 LSD检验方
法，如方差不齐则采用 Dunnett T3检验方法，p<0.05
表示差异有显著性。
半边旗二萜类成分 PAG通过 ROS诱导肝癌细胞凋亡的作用研究
Induction of Apoptosis by PAG from Pteris semipinna in Hepatocarcinoma Cells through ROS 1292
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
作者贡献
仇双利、朱晓辉、张森旺、卢晓芬和何晓虹完成数
据分析，论文初稿的写作；崔燎和吴科峰参与实验设
计、实验结果分析；巫鑫和廖红波是项目的构思者及
负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。
全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金青年基金(81503226)
和广东大学生科技创新培育专项资金项目(pdjh2015b
0299)共同资助。
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