全 文 ：第３８卷第６期
２０１１年１１月
浙　江　大　学　学　报（理学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｓｃｉ
Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２０１１
收稿日期：２０１０－１１－２６．
基金项目：国家科技部“国家科技攻关计划引导项目”（２００５ＢＡ７４１Ｃ）．
作者简介：顾地周（１９７３－），男，讲师，主要从事长白山区珍稀濒危植物和药用植物研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｄｉｚｈｏｕ＠１６３．ｃｏｍ．
ＤＯＩ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－９４９７．２０１１．０６．０１６
山荷叶离体培养和种质试管保存技术研究
顾地周１，陆　爽１，朱俊义１，陈　霞２
（１．通化师范学院 生物系，吉林 通化１３４００２；２．吉林大学 生命科学学院，吉林 长春１３００２１）
摘　要：以山荷叶新生嫩叶为外植体，基于均匀设计法筛选其最适宜的离体培养和种质试管保存各阶段培养基．结
果表明，最适合愈伤组织诱导的培养基为 ＭＳ＋６－ＢＡ　１．００ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０８ｍｇ·Ｌ－１，诱导率为９９．７％；愈伤
组织再分化培养基为 ＭＳ＋６－ＢＡ　２．８０ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋ＧＡ３０．９０ｍｇ·Ｌ－１，分化率为９９．５％；生根
培养基为１／６ＭＳ＋ＩＡＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０４ｍｇ·Ｌ－１，生根率达９９．２％以上；试管保存培养基为１／４ＭＳ＋６－
ＢＡ　０．１０ｍｇ·Ｌ－１＋根皮苷２．５０ｍｇ·Ｌ－１，通过２７个月的保存，芽苗生长率仅在７．９％以下．试验结果证明，成功
建立了山荷叶离体培养体系，常温条件下利用延缓生长的方法在试管内保存山荷叶种质是可行的．
关　键　词：山荷叶；种质试管保存；均匀设计；根皮苷
中图分类号：Ｑ　９４９．７５１；Ｑ　９４５．５１；Ｑ　９４３　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１００８－９４９７（２０１１）０６－６８９－０６
ＧＵ　Ｄｉ－ｚｈｏｕ１，ＬＵ　Ｓｈｕａｎｇ１，ＺＨＵ　Ｊｕｎ－ｙｉ　１，ＣＨＥＮ　Ｘｉａ２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｏｎｇｈｕａ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｔｏｎｇｈｕａ１３４００２，Ｊｉｌｉｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ）
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ），２０１１，３８（６）：６８９－６９４
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｔｅｎｄｅｒ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｅｘｐｌａｎｔｓ，ａｌ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｍｅｄｉａ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ
ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ　ＭＳ＋６－ＢＡ１．００ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ０．０８ｍｇ·Ｌ－１　ｗａｓ　ｍｏｓｔ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ
９９．７％；ＭＳ＋６－ＢＡ２．８０ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋ＧＡ３０．９０ｍｇ·Ｌ－１　ｗａｓ　ｍｏｓｔ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｓｈｏｏｔｓ　ｒｅｇｅｎｅｒａ－
ｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　９９．５％；１／６ＭＳ＋ＩＡＡ０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ０．０４ｍｇ·Ｌ－１　ｗａｓ　ｍｏｓｔ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｒｏｏ－
ｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｏｆ　９９．２％；１／４ＭＳ＋６－ＢＡ０．１０ｍｇ·Ｌ－１＋ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ　２．５０ｍｇ·Ｌ－１　ｗａｓ　ｍｏｓｔ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ
ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｏｒ　２７ｍｏｎｔｈｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｏｆ　７．９％．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｄｅｆｅｒｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ
ｗａｓ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｆｏｒ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｔ　ｎｏｒｍａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ；ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ；ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ；ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ
　　山荷叶Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ别
名佛爷伞、大叶子、大脖梗子，是虎耳草科山荷叶属
多年生草本植物，国家三级重点保护植物．《中国珍
稀濒危保护植物名录（第一册）》中定为渐危种［１］，
《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》中定为省级
一类重点保护植物．由于山荷叶在自然条件下不易
形成种子，自然更新能力极差，山荷叶的数量越来越
少，在长白山区数量十分稀少，分布区域十分狭窄，
仅呈零星分布于吉林通化、柳河、浑江、靖宇和长白
县等地．因其常规繁殖难度极大，开发和利用受到极
大限制．通过组织培养技术对山荷叶再生芽苗的研
究已有过报道，张恒庆等［３］以嫩叶柄为外植体，诱导
并成功诱导出不定芽，但分化的芽苗较细弱，也没有
提到具体的种质保存方法和效果．因此，在保护好现
有野生资源的同时，本试验以扩大种群数量和试管
保存为目标，利用植物组织培养方法对这一野生珍
贵稀有植物进行离体培养和试管保存的系统性研
究，同时，为缩短培养基配方的摸索周期，本试验应
用均匀设计分析处理数据，以期得到山荷叶离体培
养和试管保存各阶段的培养基．迄今未见国内外关
于利用山荷叶嫩叶为外植体的离体培养和种质试管
保存的报道．
１　材料与方法
１．１　外植体材料的处理
２００６年７月于长白山国家级自然保护区北坡
海拔８７０～９８０ｍ的林下采山荷叶新生嫩叶．在超
净工作台上用体积分数为７５％酒精涮洗３０ｓ，用含
质量分数为３．０％的次氯酸钠溶液浸泡５ｍｉｎ，无菌
水冲洗８次，再用无菌滤纸吸干表面水分，切割成
０．５ｃｍ左右的小叶蝶作为外植体备用．
１．２　嫩叶愈伤组织的诱导
以 ＭＳ为基本培养基，附加蔗糖３０ｇ·Ｌ－１，琼
脂粉６．８ｇ·Ｌ－１，调节ｐＨ值为６．０，将外植体接种
到添加细胞分裂素６－ＢＡ和生长素ＩＢＡ（由预试验
可知质量浓度分别为０．２０～１．００和０．１０～０．３０ｍｇ
·Ｌ－１）培养基上，在温度为（２２±２）℃、光照强度为
１０００ｌｘ和光照周期１２ｈ·ｄ－１的条件下进行培养．
为了提高嫩叶愈伤组织的诱导率和诱导速度，采用
均匀设计法［４－６］，选用 Ｕ５（５２）均匀表，每个处理接
种外植体数为１０，重复３次取平均值（下同）．考察
不同质量浓度６－ＢＡ和ＩＢＡ交叉配比对嫩叶愈伤组
织诱导率的影响．
１．３　愈伤组织芽苗的再分化
以 ＭＳ为基本培养基，附加蔗糖３０ｇ·Ｌ－１，琼
脂６．８ｇ·Ｌ－１，ｐＨ值为６．０，温度（２４±２）℃，光照
强度１　４００ｌｘ，光照周期１４ｈ·ｄ－１．为提高愈伤组
织芽苗的分化率，选用 Ｕ１０（１０２）均匀表，每个处理
接种愈伤组织块数为３０，重复３次，考察细胞分裂
素、６－ＢＡ生长素ＩＢＡ和赤霉素ＧＡ３（由预试验可知
质量浓度分别为１．７０～２．５０、０．０２～０．１０和１．００～
１．５０ｍｇ·Ｌ－１）质量浓度交叉配比下对芽苗分化率
的影响．
１．４　再生芽苗的生根培养和移栽
通过预试验可知，采用１／６ＭＳ培养基对组培苗生
根效果较好，添加蔗糖１５ｇ·Ｌ－１，琼脂７．０ｇ·Ｌ－１，
ｐＨ值为５．８，温度（２５±２）℃，光照强度８００ｌｘ，光
照周期８ｈ·ｄ－１．待苗长至２．５０ｃｍ时，将生长健壮
的苗切下接种到附加不同质量浓度的ＩＡＡ、ＩＢＡ和
ＮＡＡ的１／６ＭＳ培养基中进行生根培养，由预试验
确定３种生长素质量浓度分别控制在ＩＡＡ　０．０７～
０．１２ｍｇ·Ｌ－１、ＩＢＡ　０．１０～０．１５ｍｇ·Ｌ－１和ＮＡＡ
０．０３～０．０７ｍｇ·Ｌ－１．为提高山荷叶组培苗的生根
速度和生根率，选用Ｕ１０（１０３）均匀表，每个处理接种
苗数为３０，重复３次，同时考察生长素ＩＡＡ、ＩＢＡ和
ＮＡＡ质量浓度交叉配比下对生根率的影响．
待苗生根并长至４．００ｃｍ后，从培养瓶中取出
试管苗，在含有５ｍｇ·Ｌ－１高锰酸钾溶液中洗去苗
上残留的琼脂，然后植入经消毒过的泥炭土、河砂和
腐烂松针（３∶１∶１）混合的基质中，用薄膜覆盖以保
湿保温，每天保持自然光照并通风换气．
１．５　试管苗的保存
采用“延缓生长”的方法［７－８］，以１／４ＭＳ作为基
本培养基，添加蔗糖２０ｇ·Ｌ－１，琼脂６．５ｇ·Ｌ－１，
ｐＨ值为６．２，附加不同质量浓度的６－ＢＡ与根皮苷
（由预实验可知，６－ＢＡ和根皮苷质量浓度分别控制
在０．５０～１．３０和１．５０～２．５０ｍｇ·Ｌ－１），在温度为
（２０±２）℃，光照强度８００ｌｘ，光周期８ｈ·ｄ－１条件
下，将丛生芽接种到不同培养基上进行试管保存．为
确定合理降低芽苗生长的６－ＢＡ和根皮苷最佳质量
浓度配比，选用 Ｕ１０（１０２）均匀表，每个处理接种数
为１０，重复３次，同时考察６－ＢＡ和根皮苷质量浓度
交叉配比对下生长率（芽苗生长长度与生长后总长
度的比值）的影响．
１．６　数据分析与处理　
采用均匀设计法进行初步规律性试验设计，同
时筛选各阶段最合适的培养基．数据分析与处理直
接采用均匀设计软件（Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｖ３．０）分析．
２　结果与分析
２．１　ＭＳ培养基中６－ＢＡ和ＩＢＡ不同质量浓度配比
对山荷叶叶片愈伤组织诱导的影响
　　由表１和表５回归结果可知，回归方程显著．根
据回归方程求出Ｙ１ 的最优组合为Ｘ１＝１．００，Ｘ２＝
０．１０，在此组合基础上求得最优解ｙ＝９５．６，此解为回
归方程的解析解，需按公式Ｙ＝ｙ±ｕα·ｓ（其中ｙ为最
优组合基础上求得的最优解，ｕα为正态分布的双侧分
位数，ｓ为剩余标准差）计算出优化值区间估计为Ｙ１＝
９５．６±４．８３，即９０．７７％～１００．４３％．由各方程项对回
归的贡献率（Ｕ１／Ｕ＝２４．５％，Ｕ２／Ｕ＝１００％）说明，
ＩＢＡ远远大于６－ＢＡ对山荷叶嫩叶愈伤组织诱导的影
响，由回归方程可知，６－ＢＡ质量浓度与愈伤组织诱导
率呈正相关，ＩＢＡ质量浓度与愈伤组织诱导率呈负
相关，猜测６－ＢＡ质量浓度在１．００ｍｇ·Ｌ－１以上和ＩＢＡ
０９６ 浙 江 大 学 学 报（理学版）　 第３８卷　
表１　山荷叶嫩叶愈伤组织诱导培养基中６－ＢＡ和
ＩＢＡ的Ｕ５（５２）均匀设计试验安排及结果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｕ５（５２）ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　６－ＢＡ　ａｎｄ
ＩＢＡ　ｉｎ　ｍｅｄｉａ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ｆｒｏｍ　ｙｏｕｎｇ　ｌｅａｖｅｓ
ｏｆ　Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ
处理号
因　素／（ｍｇ·Ｌ－１）
６－ＢＡ　 ＩＢＡ
诱导率／％
Ｘ１ Ｘ２ Ｙ１
１　 ０．２０　 ０．１５　 ７６．２
２　 ０．４０　 ０．２５　 ６８．０
３　 ０．６０　 ０．１０　 ９０．２
４　 ０．８０　 ０．２０　 ７８．９
５　 １．００　 ０．３０　 ７０．６
质量浓度在０．１０ｍｇ·Ｌ－１以下的组合配比中有更
高的愈伤组织诱导率，又以６－ＢＡ为１．００～２．００ｍｇ
·Ｌ－１，ＩＢＡ为０．０２～０．１０ｍｇ·Ｌ－１做了６个处理
的补充试验，每个处理接种外植体数为１０，重复３
次，发现６－ＢＡ在１．００ｍｇ·Ｌ－１和ＩＢＡ　０．０８ｍｇ·
Ｌ－１时愈伤组织诱导率最高．因此，以优化组合６－
ＢＡ　１．００ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０８ｍｇ·Ｌ－１进行验证
试验，接种外植体数为３０，每瓶接种愈伤组织块数
为３，即重复３次，将叶蝶接种到附加６－ＢＡ　１．００ｍｇ
·Ｌ－１和ＩＢＡ　０．０８ｍｇ·Ｌ－１的 ＭＳ培养基上，培养
２１ｄ叶蝶逐渐增厚变形，继续培养至３５ｄ叶碟完全
形成致密鲜绿色的愈伤组织且局部有芽状颗粒体出
现（见图１ａ）．诱导率达９９．７％，在估计区间范围内，
且比所有实验Ｙ１ 值都大．因此，山荷叶嫩叶愈伤组
织诱导的最佳培养基为 ＭＳ＋６－ＢＡ　１．００ｍｇ·Ｌ－１
＋ＩＢＡ　０．０８ｍｇ·Ｌ－１．
２．２　ＭＳ培养基中６－ＢＡ、ＩＢＡ和ＧＡ３ 不同质量浓度
配比对山荷叶叶片愈伤组织芽苗再分化的影响
　　由表２和表５回归结果可知，回归方程显著．同
理，Ｙ２ 的最优组合为 Ｘ１＝２．５０，Ｘ２＝０．０２，Ｘ３＝
１．００，按公式Ｙ＝ｙ±ｕα·ｓ计算出优化值区间估计
为９０．０２％～１０２．５８％．由各方程项对回归的贡献
率 （Ｕ１／Ｕ ＝４４．１％，Ｕ２／Ｕ ＝１３．７％，Ｕ３／Ｕ ＝
３６．１％）可知，６－ＢＡ和ＧＡ３ 对山荷叶愈伤组织芽苗
再分化的影响显著大于ＩＢＡ，又因６－ＢＡ质量浓度
与分化率呈正相关，ＩＢＡ和ＧＡ３ 质量浓度与分化率
呈负相关，以免６－ＢＡ质量浓度在２．５０ｍｇ·Ｌ－１以
上和ＧＡ３ 质量浓度在１．００ｍｇ·Ｌ－１以下有更高的
芽苗分化率．又以６－ＢＡ为２．５０～３．００ｍｇ·Ｌ－１，ＧＡ３
为０．１０～１．００ｍｇ·Ｌ－１以及ＩＢＡ为０．０２ｍｇ·Ｌ－１做
了１０个处理的补充试验，每个处理接种外植体数为
１０，重复３次，发现６－ＢＡ在２．８０ｍｇ·Ｌ－１和 ＧＡ３
０．９０ｍｇ·Ｌ－１时愈伤组织分化率最高．因此，以优
化组合６－ＢＡ　２．８０ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１
＋ＧＡ３０．９０ｍｇ·Ｌ－１进行验证试验，将愈伤组织小
块接种到附加６－ＢＡ　２．８０ｍｇ·Ｌ－１、ＩＢＡ　０．０２ｍｇ·
Ｌ－１和ＧＡ３０．９０ｍｇ·Ｌ－１的 ＭＳ培养基上，接种愈
伤组织块数为３０，每瓶接种愈伤组织块数为３，即重
复３次，愈伤组织培养１２ｄ后，愈伤组织表面逐渐
出现小凸起，培养至３０ｄ，小凸起逐渐增多，继续培
养至４０ｄ，小凸起经由锥形逐渐伸长为芽苗并放出
叶片（见图１ｂ，ｃ），培养至５０ｄ苗高可达２．００ｃｍ，分
化率达９９．５％以上，在估计区间范围内，且比表２中
１０个处理的实验Ｙ２ 值都大．因此，山荷叶嫩叶愈伤
组织芽苗再分化的最佳培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ　２．８０ｍｇ
·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋ＧＡ３０．９０ｍｇ·Ｌ－１．
图１　山荷叶离体培养和种质试管保存各阶段培养物的形态
Ｆｉｇ．１　Ｍｏｒｐｈｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｓｔａｇｅｓ
ａ．山荷叶嫩叶诱导产生的愈伤组织；ｂ，ｃ．愈伤组织芽苗分化的培养；ｄ，ｅ．生根培养；ｆ．移栽；ｇ．种质试管保存；ｈ．解除保存后生长情况
１９６　第６期 顾地周，等：山荷叶离体培养和种质试管保存技术研究
表２　山荷叶愈伤组织芽苗分化培养基中６－ＢＡ、
ＩＢＡ和ＧＡ３ 的Ｕ１０（１０２）均匀设计试验安排及结果
Ｔａｂｌｅ　２　Ｕ１０（１０２）ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　６－ＢＡ，ＩＢＡ
ａｎｄ　ＧＡ３ｉｎ　ｍｅｄｉａ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ
Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ
处理号
因素／（ｍｇ·Ｌ－１）
６－ＢＡ　 ＩＢＡ　 ＧＡ３
分化率／％
Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｙ２
１　 １．７０　 ０．１０　 １．２０　 ７４．３
２　 １．８０　 ０．０２　 １．２０　 ７９．１
３　 １．９０　 ０．０８　 １．５０　 ７０．９
４　 ２．００　 ０．０４　 １．５０　 ７３．８
５　 ２．１０　 ０．０６　 １．１０　 ８２．７
６　 ２．２０　 ０．０６　 １．４０　 ７７．２
７　 ２．３０　 ０．０４　 １．４０　 ７９．２
８　 ２．４０　 ０．０８　 １．００　 ８９．７
９　 ２．５０　 ０．０２　 １．３０　 ９３．３
１０　 ２．５０　 ０．１０　 １．３０　 ８０．８
２．３　１／６ＭＳ培养基中生长素ＩＡＡ、ＩＢＡ和ＮＡＡ不
同质量浓度配比对山荷叶组培苗生根的影响
　　同理，由表３和表５回归结果可知，回归方程显
著．Ｙ３ 的最优组合为Ｘ１＝０．０７，Ｘ２＝０．１０，由公式
Ｙ＝ｙ±ｕα·ｓ计算出优化值区间估计为９３．６５％～
１０１．９５％．同理，通过各方程项对回归的贡献率
（Ｕ１／Ｕ＝５３．８％，Ｕ２／Ｕ＝７７．０％）说明，ＩＢＡ对山荷叶
组培苗生根的影响大于ＩＡＡ，但贡献率相差不显著，又
因ＩＡＡ和ＩＢＡ质量浓度均与生根率呈负相关，以免
ＩＡＡ和ＩＢＡ质量浓度分别在０．０７和０．１０ｍｇ·Ｌ－１以
下有较高的生根率，又以ＩＡＡ质量浓度为０．０１～
０．０７ｍｇ·Ｌ－１，以及ＩＢＡ 质量浓度为 ０．０１～
０．１０ｍｇ·Ｌ－１做了１０个处理的补充试验，重复３
次，发现ＩＡＡ 和ＩＢＡ 质量浓度分别在０．０２和
０．０４ｍｇ·Ｌ－１时再生芽苗生根率最高．因此，以优化后
的激素组合ＩＡＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０４ｍｇ·Ｌ－１
做验证试验，重复３次，待苗长至２．５０ｃｍ时，将生
长健壮的苗切下接种到附加ＩＡＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１和
ＩＢＡ　０．０４ｍｇ·Ｌ－１的１／６ＭＳ培养基中进行生根培
养，再生芽苗培养１７ｄ，在基部切口处发出４～６个
根锥并不断伸长形成不定根（见图１ｄ），继续培养至
３０ｄ后，主根变粗并肉质化产生了侧根，根长可达
２．８０ｃｍ以上，根和苗的形态、发育均正常（见图１ｅ），
生根率达９９．２％以上．在估计区间范围内，且比表３
中所有实验Ｙ３ 值都大．可见，山荷叶再生芽苗的最
佳生根培养基为１／６ＭＳ＋ＩＡＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋
ＩＢＡ　０．０４ｍｇ·Ｌ－１．
表３　山荷叶芽苗生根培养基中ＩＡＡ、ＩＢＡ和
ＮＡＡ的Ｕ１０（１０３）均匀设计试验安排及结果
Ｔａｂｌｅ　３　Ｕ１０（１０３）ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　ＩＡＡ、ＩＢＡ
ａｎｄ　ＮＡＡ　ｉｎ　ｍｅｄｉａ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔｓ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｏｆ
Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ
处理号
因素／（ｍｇ·Ｌ－１）
ＩＡＡ　 ＩＢＡ　 ＮＡＡ
生根率／％
Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｙ３
１　 ０．０７　 ０．１４　 ０．０６　 ８８．５
２　 ０．０８　 ０．１５　 ０．０５　 ８６．４
３　 ０．０９　 ０．１３　 ０．０３　 ９０．０
４　 ０．１０　 ０．１４　 ０．０７　 ８４．８
５　 ０．１１　 ０．１２　 ０．０４　 ８９．０
６　 ０．１２　 ０．１３　 ０．０４　 ８０．３
７　 ０．１０　 ０．１１　 ０．０７　 ９０．０
８　 ０．０９　 ０．１２　 ０．０３　 ９１．７
９　 ０．０８　 ０．１０　 ０．０５　 ９４．９
１０　 ０．０７　 ０．１５　 ０．０６　 ８６．８
　　待苗生根并长至４．００ｃｍ后，从培养瓶中取出
试管苗，在含有５ｍｇ·Ｌ－１高锰酸钾溶液中洗去苗
上残留的琼脂，然后植入经１００倍杀毒矾消毒过的
泥炭土、河砂和腐烂松针（３∶１∶１）混合的基质中，
用薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在８５％，温度控
制在（１８±２）℃，每天自然光照１２ｈ，３ｄ后通风换
气，７ｄ后揭膜，每天早晚喷洒清水各１次，成活率达
９５％以上（见图１ｆ）．
２．４　１／４ＭＳ培养基中６－ＢＡ和根皮苷不同质量浓
度配比对山荷叶试管苗生长的影响
　　由表４和表５回归结果可知，回归方程显著．根
据研究目的进行反向优化后求出Ｙ４ 的最优组合为
Ｘ１＝０．５０，Ｘ２＝２．５０，求得优化值区间估计为
４．７９％～１９．８１％．由各方程项对回归的贡献率
（Ｕ１／Ｕ＝８６．４％，Ｕ２／Ｕ＝１１．９％）可知，根皮苷对山
荷叶芽苗生长的影响小于６－ＢＡ，由回归方程可知，
６－ＢＡ质量浓度与生长率呈正相关，根皮苷质量浓度
与生长率呈负相关，根据研究的目的（为了降低生长
率）进行反向分析，６－ＢＡ质量浓度在０．５０ｍｇ·Ｌ－１以
下和根皮苷质量浓度在２．５０ｍｇ·Ｌ－１以上可能有更低
的芽苗生长率，又以６－ＢＡ为０．１０～０．５０ｍｇ·Ｌ－１，根
２９６ 浙 江 大 学 学 报（理学版）　 第３８卷　
皮苷为２．５０～３．００ｍｇ·Ｌ－１做了６个处理的补充试
验，重复３次，发现６－ＢＡ在０．１０ｍｇ·Ｌ－１和根皮苷
２．５０ｍｇ·Ｌ－１时生长率最低．因此，将丛生芽接种到
附加６－ＢＡ　０．１０ｍｇ·Ｌ－１和根皮苷２．５０ｍｇ·Ｌ－１的
１／４ＭＳ培养基上进行保存，保存２７个月丛生芽团
上的芽苗平均生长率仅为７．９％以下，且芽苗生长
极其缓慢，其形态、质量等均正常（见图１ｇ）．在估计
区间范围内，且比所有实验Ｙ４ 值都小，可见，山荷
叶丛 生 芽 最 佳 保 存 培 养 基 为 １／４ＭＳ＋６－ＢＡ
０．１０ｍｇ·Ｌ－１＋根皮苷２．５０ｍｇ·Ｌ－１．
经２７个月的保存后，将丛生芽转接到培养基
ＭＳ＋６－ＢＡ　２．８０ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋
ＧＡ３０．９０ｍｇ·Ｌ－１上进行解除保存再分化和生长
培养，培养２５ｄ后，丛生芽团上的芽苗恢复生长，且
苗粗壮、生长旺盛，形态和发育均正常（见图１ｈ）．
表４　山荷叶种质试管保存培养基中６－ＢＡ和
根皮苷的Ｕ１０（１０２）均匀设计试验安排及结果
Ｔａｂｌｅ　４　Ｕ１０（１０２）Ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｅｓｔ　ｐｌａｎ　ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔ　ｆｏｒ
６－ＢＡ　ａｎｄ　ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ　ｉｎ　ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ
处理号
因　素／（ｍｇ·Ｌ－１）
６－ＢＡ 根皮苷
生长率／％
Ｘ１ Ｘ２ Ｙ４
１　 ０．５０　 １．５０　 １３．５
２　 ０．６０　 １．７５　 １８．０
３　 ０．７０　 ２．００　 ２３．８
４　 ０．８０　 ２．２５　 ２１．６
５　 ０．９０　 ２．５０　 ２８．８
６　 １．００　 ２．５０　 ３１．９
７　 １．１０　 ２．２５　 ３１．０
８　 １．２０　 ２．００　 ３９．６
９　 １．３０　 １．７５　 ４０．０
１０　 １．３０　 １．５０　 ２８．４
表５　山荷叶离体培养及种质试管保存各阶段的回归分析结果
Ｔａｂｌｅ　５　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ
Ａｓｔｉｌｂｅ　ｔａｂｕｌａｒｉｓ（Ｈｅｍｓｌ．）Ｅｎｇｌｅｒ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｓｔａｇｅｓ
培养阶段 回归方程 样本容量 复相关系数 剩余标准差 检验值 临界值
愈伤组织诱导Ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　 Ｙ１＝９２．６＋１５．６　Ｘ１－１２６　Ｘ２ ５　 ０．９９５　８　 １．１２０　 １１７．９０　Ｆ（０．０５，２，２）＝１９．００
愈伤组织分化ｃａｌｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　 Ｙ２＝８３．８＋１５．６　Ｘ１－８４．５　Ｘ２－２４．７　Ｘ３ １０　 ０．９５４　２　 ２．５７０　 ２０．３６　Ｆ（０．０５，３，６）＝４．７５７
组培苗的生根Ｒｏｏｔｉｎｇ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔｓ　 Ｙ３＝１３０－１７１　Ｘ１－２０５　Ｘ２ １０　 ０．９２１　８　 １．７５０　 １９．８０　Ｆ（０．０５，２，７）＝４．７３７
试管保存Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　 Ｙ４＝１７．９＋２６．４　Ｘ１－７．５５　Ｘ２ １０　 ０．９４５　９　 ３．１８０　０　 ２９．７６　Ｆ（０．０５，２，７）＝４．７３７
　　注 显著性水平α＝０．０５
３　结论与讨论
本试验结果表明，培养基ＭＳ＋６－ＢＡ　１．００ｍｇ·Ｌ－１
＋ＩＢＡ０．０８ｍｇ·Ｌ－１对山荷叶嫩叶愈伤组织诱导效果
最好，愈伤组织诱导率达到了预期效果．当６－ＢＡ低于
１．００ｍｇ·Ｌ－１和ＩＢＡ质量浓度高于０．０８ｍｇ·Ｌ－１组合
时，愈伤组织诱导率尽管能达到９０．２％，但愈伤组
织很快变黄并凋亡，这可能是山荷叶嫩叶较容易形
成愈伤组织，过低质量浓度的６－ＢＡ是不足以保障愈
伤组织衰老的原因．当６－ＢＡ高于１．００ｍｇ·Ｌ－１和
ＩＢＡ质量浓度低于０．０８ｍｇ·Ｌ－１组合时，愈伤组织
诱导率显著降低，诱导率不足３５．０％，这可能是过高
的６－ＢＡ质量浓度在山荷叶愈伤组织诱导中起抑制作
用和过低的ＩＢＡ质量浓度满足不了愈伤组织的形成；
愈伤组织在培养基 ＭＳ＋６－ＢＡ　２．８０ｍｇ·Ｌ－１＋
ＩＢＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋ＧＡ３０．９０ｍｇ·Ｌ－１上的培养
成功诱导出芽苗，且芽苗分化率高达９９．５％．６－ＢＡ
质量浓度超过２．８０ｍｇ·Ｌ－１时分化率下降，分化率
均在４５．０％以下，说明过高质量浓度的６－ＢＡ对愈伤
组织再分化芽苗起抑制作用，在培养基中加入适当质
量浓度的 ＧＡ３ 可提高芽苗再分化的速度；培养基
１／６ＭＳ＋ＩＡＡ　０．０２ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ　０．０４ｍｇ·Ｌ－１
较适合于山荷叶嫩叶愈伤组织再生芽苗的生根，同
时使用２种低质量浓度的生长素有利于组培苗的生
根，且生根苗粗壮而利于炼苗和移栽．而过高的生长
素导致幼苗基部膨胀或产生愈伤瘤，继续培养根从
膨胀部或愈伤瘤上发出，这样的苗在移栽时，根随愈
伤瘤从苗基部脱落，移栽成活率几乎为零，可能是根
与苗茎的纤维疏导组织连接不完整所致．目前，国内
外已有很多关于植物种质保存方面的报道，大多采
取低温处理、玻璃化、包埋、低温结合弱光照等方
法［９－１０］．本研究对山荷叶的种质保存采取“延缓生
长”的方法，只需在１／４ＭＳ培养基中加入６－ＢＡ
０．１０ｍｇ·Ｌ－１和根皮苷２．５０ｍｇ·Ｌ－１延缓丛生芽
上芽苗的生长达到试管保存的目的，在培养基中辅
以适当质量浓度的６－ＢＡ有利于调控山荷叶对根皮
苷的适当吸收、促进转化和代谢，以防根皮苷及其代
谢产物对保存的试管苗造成衰老和组织细胞的凋
亡．试验发现当根皮苷超过２．５０ｍｇ·Ｌ－１时愈伤组
织很快变为黄褐色，最终导致芽苗叶片卷曲幅度极
大，最后黄化后凋亡，质量浓度低于２．５０ｍｇ·Ｌ－１
时保存时间达８个月后丛生芽团上的芽苗趋于明
显生长趋势．利用“延缓生长”的方法可在常温下
保存山荷叶种质达２７个月以上，解除保存后丛生
芽团上的芽苗很快恢复生长，并能分化出大量芽
３９６　第６期 顾地周，等：山荷叶离体培养和种质试管保存技术研究
苗且苗粗壮而生长旺盛，形态和发育均未出现异
常，这可能是愈伤组织上的细胞在保存过程中得
到了充足休眠等原因．试验结果证明，成功完成了
山荷叶的离体培养和种质试管保存培养基的筛
选，达到了预期目的．同时，应用均匀设计处理、分
析数据和再试验大大缩短了培养基配方的摸索周
期．山荷叶是我国珍稀植物资源，至今未见推广应
用．本研究结果为山荷叶的开发利用、工厂化育苗
和种质试管保存奠定了基础．
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（责任编辑　涂　红）
４９６ 浙 江 大 学 学 报（理学版）　 第３８卷