全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (8): 1305–1311　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2016.0268 1305
收稿 2016-06-28　　修定 2016-07-25
资助 云南省应用基础研究计划(2014FD066)、云南省科技惠
民计划(2014RA053)、国家观赏园艺工程技术研究中心
(2012FU125X10)、云南省农业科学院创新团队(2014-
CZYY019)和云南省生物多样性保护专项。
* 通讯作者(E-mail: gming-114@163.com)。
珍稀濒危蕨类植物金毛狗配子体发育及无配子生殖的观察
余蓉培1, 程薪宇2, 张光飞3, 李涵1, 桂敏1,*
1国家观赏园艺工程技术研究中心, 云南省农业科学院花卉研究所, 昆明650205; 2黑龙江省科学院大庆分院, 黑龙江大庆
163319; 3云南大学生态学与地植物学研究所, 昆明650091
摘要: 金毛狗[Cibotium barometz (L.) J. Sm.]为国家二级重点保护野生植物, 是珍稀濒危蕨类植物的重要类群。本研究通过
孢子无菌培养, 对金毛狗配子体发育及其无配子生殖现象进行观察。结果表明: 金毛狗孢子为黄色, 近四面体型, 三裂缝,
远极面具条状纹饰, 萌发类型为书带蕨型(Vittaria-type), 多数配子体的发育类型符合铁线蕨型(Adiantum-type)。孢子播种
约40 d后, 原叶体开始产生精子器, 颈卵器晚于精子器出现。金毛狗属于兼性无配子生殖, 无配子生殖发生于增厚原叶体的
两翼上缘。与同期有性生殖的组培植株相比, 无配子生殖组培植株的特征在于: 植株个体、复叶及小叶均小于有性生殖植
株, 三回羽状复叶特征较为明显, 复叶叶柄的毛密而长, 染色体倍性为有性生殖植株的一半。
关键词: 金毛狗; 孢子萌发; 配子体发育; 无配子生殖
金毛狗[Cibotium barometz (L.) J. Sm.], 隶属于
蚌壳蕨科(Dicksoniaceae)金毛狗属, 为多年生大型
树状蕨类植物。根状茎平卧、粗大, 端部上翘, 露
出地面部分密被金色茸毛, 状似伏地的金毛狗, 形
态独特 , 具有较高观赏价值(陆树刚2007; 石雷
2002)。在欧美地区, 金毛狗作为“树蕨” (tree ferns)
的重要类群, 广泛应用于庭院造景中(Jones 1987)。
此外, 金毛狗亦有重要药用价值, 具有消炎、镇
痛、止血以及预防骨质疏松的功效(Cuong等2009;
Wu和Yang 2009; Zhao等2011)。由于野生资源的
过度开发和自然生境的破坏, 金毛狗的野外种群
数量急剧减少, 已列入《濒危野生动植物种国际
贸易公约(附录II)》(CITES 2016)。在中国大陆地
区, 蚌壳蕨科仅金毛狗1种, 《国家重点保护野生
植物名录(第一批)》已将金毛狗列为国家二级重
点保护野生植物(陈水木等2007)。目前, 对于金毛
狗的研究主要集中于药用成分及其功效(Cuong等
2009; Wu和Yang 2009; Zhao等2011)、化感作用
(张开梅等2008)等方面, 在配子体发育方面, 郭治
友(2009)和邢建娇等(2012)进行了初步研究, 但对
孢子形态以及配子发育的深入观察还有待进一步
完善。
蕨类植物通常经有性生殖繁衍后代, 但部分
蕨类植物亦可通过无配子生殖产生后代(Fernández
和Revilla 2003)。蕨类植物无配子生殖是指不需要
经过配子的结合, 而直接产生孢子体的现象, 它主
要是由除卵细胞以外的配子体营养细胞分化形成
(陆树刚2007; 李杨等2012)。水蕨(Ceratopteris rich-
ardii Brongn.) (Cordle等2007, 2010)、傅氏凤尾蕨
(Pteris fauriei Hieron.) (沈建等2009)、金粉蕨[Ony-
chium siliculosum (Desv.) C. Chr.] (代小菲等2010)、
粉叶蕨(Pityrogramma calomelanos L.) (Martin等
2006)和舟山碎米蕨(Cheilosoria chusana) (郭严冬
等2014)等种类均被报道可以进行无配子生殖。目
前, 尚未见金毛狗无配子生殖的相关报道。本研究
以金毛狗孢子为培养材料, 对配子体发育及无配
子生殖现象进行观察, 探讨其配子体发育及无配
子生殖后代特征, 为珍稀濒危蕨类金毛狗野生资
源的保护和合理开发利用提供基础资料。
材料与方法
1 孢子收集
金毛狗[Cibotium barometz (L.) J. Sm.]孢子于
2013年11月采集于云南屏边地区。将带有成熟孢
子的叶片装于信封中, 置于干燥通风处待孢子自
然散落。1周后将孢子除去杂质, 收集于硫酸纸袋
中, 保存于4°C冰箱中备用。
2 孢子形态的扫描电镜观察
将干燥的金毛狗孢子直接均匀撒在双面胶带
上, 并固定在样品台上, 使用Hitachi E-1010离子溅
射仪镀钼靶合金膜, 然后置于Hitachi S-3000N扫描
电镜下观察并拍照。
植物生理学报1306
3 配子体培养
参照张婷婷等(2012)的孢子消毒方法对金毛
狗孢子进行消毒, 消毒后的孢子接种于1/2MS+3%
蔗糖+0.7%琼脂的培养基上, 参照王晓倩等(2014)
的方法对孢子接种密度进行控制, 暗培养24 h后,
放置于培养室中培养, 光照强度为30~40 μmol·m-2·s-1,
光照时间为12 h·d-1, 温度为(25±2)°C。孢子播种后
每2 d使用Leica DM 6000B显微镜对配子体发育情
况进行观察, 并用Leica DFC 450C相机拍照。
4 无配子生殖后代的形态观察和倍性鉴定
将配子体培养过程中得到的无配子生殖后代
接种于1/2MS+3%蔗糖+1.0 g·L-1活性炭+0.7%琼
脂的培养基上培养, 培养3个月后, 与同期有性生
殖形成的组培植株进行形态比较, 并采用Partec
CyFlow Space-3000流式细胞仪对无配子生殖后代
进行倍性鉴定, 所用方法参照钱敏等(2015)的鉴定
方法。
实验结果
1 配子体发育
1.1 孢子形态及孢子萌发
金毛狗孢子为黄色, 近四面体型, 辐射对称,
三裂缝, 裂缝长18 μm, 未及赤道面, 裂缝边缘具脊
状纹饰(图1-A), 远极面具条状纹饰(图1-B)。孢子
大小约为50 μm (极轴)×52 μm (赤道轴), 近极面观
近正三角形(图1-A)。播种7 d左右, 孢子开始萌发,
原叶体细胞从三裂缝处伸出, 初生假根与原叶体
细胞垂直(图1-C), 无色透明, 偶见少量叶绿体, 孢
图1 金毛狗孢子形态及配子体发育
Fig.1 Spore morphology and gametophyte development of Cibotium barometz
A: 近极面观孢子形态; B: 远极面孢子纹饰; C: 孢子萌发; D: 双列丝状体; E: 仅基部相连的2个丝状体; F: 丝状体顶部的楔形细胞(箭头
所示); G: 片状体; H: 原叶体(箭头所示为具有叶绿体的假根); I: 原叶体假根; J: 成熟的精子器(箭头所示); K: 正在释放精细胞的精子器(箭
头所示为精细胞); L: 颈卵器顶面观(箭头所示)。
余蓉培等: 珍稀濒危蕨类植物金毛狗配子体发育及无配子生殖的观察 1307
子壁宿存于原丝体基部(图1-C), 孢子萌发类型为
书带蕨型(Vittaria-type) (Nayar和Kaur 1971)。
1.2 丝状体及片状体
原叶体母细胞分裂形成基细胞和原叶体细胞,
基细胞一般不再分裂, 原叶体细胞则连续进行横
向分裂, 形成3~4个细胞的丝状体, 单列的丝状体
有时也会经过纵向分裂形成双列丝状体(图1-D)。
少数原叶体细胞会先进行一次纵向分裂形成2个
原叶体细胞, 然后2个原叶体细胞各自进行分裂形
成丝状体, 2个丝状体仅基部细胞相连, 形成丝状体
分枝现象(图1-E)。
当丝状体生长至3~4细胞长时, 顶端会形成一
个楔形细胞, 即分生细胞(图1-F), 楔形细胞不断向
两边分裂形成新细胞, 新细胞再不断分裂逐渐形
成片状体(图1-G), 其发育类型符合铁线蕨型(Adi-
antum-type), 但部分片状体的发育亦不完全符合铁
线蕨型特征, 具有多态性。
1.3 原叶体
随着片状体的生长, 生长点逐渐下陷, 两翼上
延, 经过不断调整最后形成左右对称的心形原叶
体(图1-H), 原叶体基部有大量假根(图1-I), 少数假
根可见叶绿体(图1-H)。随着原叶体逐步发育成
熟, 中肋处加厚并突出, 且原叶体的翼缘会有褶皱
形成。金毛狗原叶体的形态随性别而存在一定差
异, 雄性配子体较小, 长大于宽; 雌性或两性配子
体较大, 长小于或等于宽, 具有细胞排列紧密的
“U”形生长点。
1.4 性器官的形成
金毛狗孢子播种后40 d左右, 原叶体开始产生
精子器, 精子器主要着生于原叶体腹面的两翼下
部、假根丛中及假根周围, 数量从十几个至数十个
不等。精子器顶面观为球形, 直径为44~51 μm, 内
部充满大量精细胞(图1-J), 成熟精子器的盖细胞会
出现裂口, 精细胞从裂口处溢出(图1-K)。颈卵器
晚于精子器形成, 主要着生于原叶体腹面“U”形生
长点的下方以及中肋区域, 数量从几个至十几个
不等。颈卵器直径为58~62 μm, 突出颈部由4列细
胞组成, 成熟时, 颈卵器中央的颈沟细胞和腹沟细
胞破裂, 露出颈沟(图1-L)。
2 无配子生殖
2.1 无配子生殖植株的获得及其形态特征
当孢子萌发形成原叶体之后, 部分原叶体成
簇状生长, 少部分原叶体明显加厚, 呈现深绿色,
其中1个原叶体的两翼边缘形成3个无配子生殖芽
体(图2-A)。将该原叶体单独培养, 待芽体长至约1
cm, 将其从原叶体上剥离下来, 分别培养, 形成无
配子生殖组培植株(图2-B)。与有性生殖产生的组
培植株相比, 无配子生殖组培植株的生长较为缓
图2 金毛狗无配子生殖组培植株的形成及其形态特征
Fig.2 The formation and morphology of in vitro apogamic plantlet of Cibotium barometz
A: 原叶体上形成的无配子生殖芽体; B: 无配子生殖组培植株; C: 无配子生殖植株基部形成的原叶体(箭头所示); D: 有性生殖组培植
株和无配子生殖组培植株的复叶形态差异; E: 有性生殖组培植株和无配子生殖组培植株的小叶形态差异; F: 有性生殖组培植株和无配子
生殖组培植株的茸毛形态差异。Sp: 有性生殖组培植株; Ap: 无配子生殖组培植株。
植物生理学报1308
慢, 培养2个月后, 无配子生殖组培植株基部有新
的原叶体形成(图2-C)。
无配子生殖组培植株培养3个月后, 与同期有
性生殖产生的组培植株进行比较, 其差异主要表
现在: 无配子生殖的植株个体、复叶及小叶均小
于有性生殖植株, 三回羽状复叶特征较有性生殖
植株更为明显, 小叶着生间隔小于有性生殖植株
(图2-D和E); 无配子生殖植株复叶叶柄的茸毛多而
密集, 且显著长于有性生殖植株的茸毛(图2-F);
无配子生殖植株基部出现金色茸毛(图2-B), 但有
性生殖植株在组培阶段均未出现。
2.2 无配子生殖植株的染色体倍性鉴定
以金毛狗有性生殖产生的组培植株(Sp)为内
部参照, 采用流式细胞术对金毛狗无配子生殖产
生的组培植株(Ap)的染色体倍性进行鉴定, 无配子
生殖植株细胞核相对DNA含量为有性生殖植株的
1/2 (图3-A), 说明无配子生殖植株的染色体倍性发
生了变化, 其倍性为有性生殖植株的一半, 与有性
生殖过程中产生的正常原叶体倍性相同。
此外, 对无配子生殖植株基部产生原叶体(Pr)
的染色体倍性鉴定结果显示: 其细胞核相对DNA含
量为有性生殖植株(Sp)的1/2 (图3-B), 其染色体倍
性为有性生殖植株的一半, 与无配子生殖植株的染
色体倍性情况相同, 说明该原叶体从无配子生殖植
株基部产生的过程未发生染色体倍性的改变, 且与
有性生殖过程中产生的正常原叶体倍性相同。
图3 金毛狗无配子生殖植株及其基部配子体相对DNA含量的流式细胞术鉴定图
Fig.3 Flow cytometry histograms on the relative DNA contents of apogamic plantlet and prothallus at the root of apogamic plant-
let of Cibotium barometz
A: 无配子生殖植株的相对DNA含量; B: 无配子生殖植株基部产生原叶体的相对DNA含量。Sp: 有性生殖组培植株, 作为流式细胞术
鉴定中的内部参照; Ap: 无配子生殖植株; Pr: 无配子生殖植株基部产生的配子体。
讨　　论
金毛狗孢子的萌发类型为书带蕨型, 其多数配
子体的发育类型符合铁线蕨型, 亦具有多态性。就
孢子萌发类型而言, 与郭治友(2009)的研究结果相
符, 但在配子体发育类型上存在一定差异。郭治
友(2009)认为金毛狗配子体发育类型为三叉蕨型;
陈水木等(2007)则认为具有明显丝状体阶段的配
子体发育类型符合铁线蕨型, 而无明显丝状体阶段
的配子体发育类型则更符合三叉蕨型。造成配子
体发育类型观察结果差异的原因可能在于金毛狗
配子体发育具有多态性, 且蕨类配子体发育通常会
受培养方式、播种密度、光照等因素的影响(杜红
红等2009a, b; 张光飞等2009; 张银丽等2009)。本
研究在金毛狗丝状体发育时期, 在丝状体顶端观
察到楔形细胞 , 楔形细胞向两侧分裂产生新细
胞。Takahashi等(2015)研究结果显示, 蕨类植物配
子体的形成主要基于两个分生组织, 其中, 基于顶
端细胞的分生组织(apical-cell-based meristem)即起
源于楔形细胞, 该种分生组织类似于植物的顶端
分生组织, 在配子体形成过程中起到关键作用。
此外, 本研究采用1/2MS固体培养基对金毛狗孢子
进行培养, 在配子体发育过程中出现丝状体分枝
现象。陈水木等(2007)也曾观察到丝状体分枝现
象, 但仅在采用Knop’s液体培养基进行培养的过程
中发现。同时 , 刘保东和檀龙颜(2009)在肾蕨
余蓉培等: 珍稀濒危蕨类植物金毛狗配子体发育及无配子生殖的观察 1309
[Nephrolepis auriculata (L.) Trimen]中也发现丝状
体分枝现象, 但产生的分枝形似假根, 有横隔且无
叶绿体分布, 与本研究中的丝状体分枝现象存在一
定差异, 对于金毛狗丝状体分枝现象的产生及其生
物学意义有待进一步观察和探讨。
无配子生殖是蕨类植物的一种生殖方式, 部
分种类, 如: 金粉蕨(代小菲等2010)、舟山碎米蕨
(郭严冬等2014)、Dryopteris affinis sp. affinis
(Fernández等1996)只能产生精子器而不能产生颈
卵器, 是严格的专性无配子生殖; 而水蕨(Cordle等
2010)等种类则属于兼性无配子生殖, 可以通过正
常受精作用产生孢子体, 但在自然环境或生理环
境不适宜时, 受精作用会被抑制, 从而诱导配子体
进行无配子生殖。本研究中金毛狗配子体可以正
常形成性器官, 并通过受精作用形成胚, 由此可以
判断金毛狗应属于兼性无配子生殖。
与有性生殖植株相比, 蕨类植物无配子生殖
植株在形态学和细胞学上会存在一定差异, 但这
种差异不是特别巨大。Kawakami等(1995)在对井
栏边草(Pteris multifida Poir.)无配子生殖的研究中
发现, 其无配子生殖植株的叶片比有性生殖植株
的略窄、保卫细胞变小、且可育叶不能进行正常
的减数分裂产生孢子, 但紫萁(Osmunda japonica
Thunb.)无配子生殖植株则主要表现为叶片变小、
保卫细胞变小(Kawakami等1999)。本研究中金毛
狗无配子生殖产生的组培植株个体、复叶和小叶
均小于同期有性生殖产生的组培植株, 部分性状
特征突出表现, 如: 三回羽状复叶特征较为明显、
复叶叶柄的茸毛密且长。
蕨类植物无配子生殖是由配子体的营养细胞
直接产生, 其产生植株的染色体倍性理论上应与配
子体一致。Kawakami等(1997)对铁线蕨(Adiantum
capillus-veneris L.)、鸟巢蕨(Asplenium nidus L.)、
紫萁等12种蕨类植物进行无配子生殖诱导, 获得
的无配子生殖植株均为单倍体, 染色体数目是有
性生殖植株的一半, 与原叶体染色体倍性一致。
本研究中金毛狗无配子生殖植株的染色倍性为有
性生殖植株的一半, 与前人研究结果相符。此外,
无配子生殖植株基部产生的原叶体的倍性亦为有
性生殖植株的一半, 与有性生殖过程中正常配子
体的染色体倍性一致。无配子生殖植株基部的配
子体可能由无孢子生殖产生, 但对其起源和形成
过程需进一步开展研究。
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Observation on gametophyte development and apogamy of the endengered
fern Cibotium barometz
YU Rong-Pei1, CHENG Xin-Yu2, ZHANG Guang-Fei3, LI Han1, GUI Min1,*
1National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture, Flower Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural
Sciences, Kunming 650205, China; 2Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences, Daqing, Heilongjiang 163319, China;
3Institute of Ecology and Geobotany, Yunnan University, Kunming 650091, China
Abstract: Cibotium barometz (L.) J. Sm., an important group of the endangered ferns, is listed in the Category
II of State Special Protected Plants. In present study, the gametophyte development and apogamy of Cibotium
barometz were investigated by the sterile culture of spores. The results showed that spores were yellow, tetrahe-
dral and trilete. There were strip ornamentations on the distal surface of spores. The germination type of spores
was Vittaria-type. The gametophyte development was mainly Adiantum-type. Antheridia appeared after about
40 days of spore cultivation. Archegonia appeared later than antheridia. Apogamy of Cibotium barometz was
facultative, which happened at the apical region of thickened prothallus. Compared with in vitro sporophytic
plantlet, in vitro apogamic plantlet had smaller frond and leaflet, and characters of tripinnate leaf was more sig-
nificant. Hairs on the stipe of apogamic plantlet were denser and longer. Ploidy of apogamic plantlet was half of
sporophytic plantlet.
Key words: Cibotium barometz; spore germination; gametophyte development; apogamy
Received 2016-06-28 Accepted 2016-07-25
This work was supported by the Yunnan Foundation Research Projects for Application (Grant No. 2014FD066), Yunnan Science and Technology Program
for Public Wellbeing (Grant No. 2014RA053), National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture (Grant No. 2012FU125X10),
Innovation Team of Yunnan Academy of Agricultural Sciences (Grant No. 2014CZYY019) and Yunnan Biodiversity Conservation Projects.
*Corresponding author (E-mail: gming-114@163.com).