全 文 ：半边旗中二萜类化合物 5F对 K562细胞
几种癌基因表达的影响＊
王京滨　梁念慈　莫丽儿1
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所 、1 广东医学院化学教研室 ,湛江　524023)
中国图书分类号　R 282.71;R 284.1;R 394.2;R 73-351
文献标识码　A　文章编号　1001-1978(2002)04-0418-04
摘要　目的　研究半边旗中二萜类化合物 5F(11α-羟基-15-
氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19 酸)对 K562 细胞癌基因 Bcl-2 、
Bax、c-Fos、c-Jun 表达的影响。方法　5F 作用 K562 细胞 24
h后 ,用蛋白印迹法检测 Bcl-2 、Bax、c-Fos、c-Jun 的表达。结
果　半边旗中二萜类化合物 5F 作用于 K562 细胞 24 h 后 ,
Bcl-2表达减少 , Bax、c-Fos、c-Jun 表达增多。结论　推测化
合物 5F 抗肿瘤的机制之一是上调 Bax、c-Fos、c-Jun 表达和
下调 Bcl-2 的表达。
关键词　半边旗;二萜类;癌基因
2001-12-20收稿 , 2002-04-05修回
＊广东省科委重大科技攻关项目(No 9622007-002)和国家自然科学
基金资助课题(No 39870900)
作者简介:王京滨 , 女 , 28岁 , 硕士。研究方向为生化药理学。 Tel:
0759-2388582-4 , Fax:0759-2284104;
梁念慈 ,男 , 61岁 ,教授 ,博士生导师。主要从事生化药理
学的研究。 E-mail:gdm csh@gdmc.edu.cn
　　半边旗(pteris sem ipinnata L., PsL),别名凤
凰尾巴草 、半凤尾草 、半边梳 、甘草蕨等 ,是凤尾蕨科
凤尾蕨属植物 ,产于四川及长江以南各省区 ,具有疏
解风寒 、化湿消肿 、清热解毒的功效。民间用来治疗
菌痢肠炎 、肝炎 、毒蛇咬伤 、外伤出血等[ 1] 。我们课
题组经过多年的研究发现 ,半边旗有效成分有强的
抗肿瘤作用[ 2 ～ 5] 。本文用蛋白印迹法研究半边旗
中二萜类化合物 5F(11α-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳
杉烷-19酸 ,以下简称 5F)对 K562细胞癌基因 Bcl-
2 、Bax 、c-Fos和 c-Jun表达的影响 ,探讨半边旗有效
成分抗肿瘤的可能机制 。
1　材料与方法
1.1　半边旗 　1997 年夏天采摘于广西省南宁郊
区 ,并经分离提取 、纯化 、鉴定 ,得到有效成分二萜类
化合物 5F(结构式如 Fig 1所示)。5F 用 DMSO配
制成原液 ,分装冻存 ,临用前用培养基稀释成所需浓
度 。处理细胞时 , DMSO 的最终体积分数小于或等
于 0.001 ,实验表明该浓度对细胞的生长没有影响 。
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to mitogens and hypoxia:importance of protein kinase C.Can J
Physiol Pharmacol , 1997;75(7):936～ 44
Inhibitory effect of breviscapine on primary cultural
calf pulmonary artery smooth muscle cell proliferotion
WANG Chang-Ming , MO Bi-Wen , ZENG Jin-Rong
(Research laboratory of Respiratory Disease , Af f iliated Hospital , Guilin Medi lal College , Guilin　541001)
ABSTRACT　AIM　To explore the effect of brevis-
capine on primary cultural calf pulmonary artery
smooth muscle cell(PASMC)proliferat ion.METH-
ODS　By primary cuture of calf PASMC , the ef fect
of PASMC proliferation w as analy sed using M T T col-
orimetry , f low cytomerty , Giemsa staining.RE-
SULTS　Compared w ith control g roup , PASMC pro-
liferations in breviscapine group w as signif icantly in-
hibited f rom G0/G1 to S phases in the cell cycle.
CONCLUSION　Breviscapine could significantly in-
hibit PASMC prof iferation.The mechanism for this
may due to inhibition of pro tein kinase C.
KEY WORDS 　 brevscapine; pulmonarg artery
smooth muscle cell;protein kinase C
·418· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin 　2002 Aug;18(4):418 ～ 21
Fig 1　The structure of compound 5F
1.2　试剂和仪器　RPM I-1640培养基为美国 Gib-
co 公司产品;小牛血清为杭州四季青生物工程材料
研究所产 品;Leupeptin 、Aprotinin 、Hepes 、 Tris 、
Na3VO4 、丙烯酰胺均为 Sigma 公司产品;Bcl-2 小鼠
单抗 、Bax 兔多抗 、c-Fos兔多抗 、c-Jun兔多抗 、HRP
标记山羊抗兔 IgG 、HRP 标记山羊抗鼠 IgG 、ECL 试
剂均为 Santa Cruz公司产品 ,北京中山生物技术有
限公司代理。其余均为国产分析纯试剂。CO2 孵
箱 ,PRECISION 公司;放射自显影暗盒 , Sigma 公
司;M ini-PROTEAN Ⅱ Electrophoresis Cell 、Mini
Trans-Blo t Electrophoretic Transfer Cell、 MODEL
1000/500 POWER SUPPLY均为美国Bio-Rad公司
产品 。
1.3　细胞系及培养条件　人慢性髓原白血病细胞
系(chronic myelogenous leukemia)K562 购于中山医
科大学动物实验中心。K562 细胞生长于含体积分
数为 0.10的灭活小牛血清 、1ⅸ105 U·L-1青霉素和
100 mg·L-1链霉素的 RPM I-1640 完全培养基中 ,
置37℃、0.05 CO2饱和湿度孵箱内培养 。细胞经传
代和收获 ,取对数生长期细胞进行实验 。
1.4　方法
1.4.1　K562 细胞裂解液的制备 　半边旗提取物
5F 作用于白血病 K562细胞(1 ～ 2×107 cells)一定
时间 , 500 ～ 1 000 g室温离心 10 min ,收集细胞 ,以
冰冷的 PBS 洗涤细胞 2 次 ,离心 , 小心去除 PBS 。
加入 5×体积冰冷的新鲜配制的细胞裂解液(Hepes
50 mmol·L-1 pH 7.5 , NaCl 150 mmol· L-1 ,
Na3VO4 2 mmol · L-1 , NaF 100 mmol · L-1 ,
NaH2PO4 10.0 mmol·L-1 , DTT 2.0 mmol·L-1 ,
PMSF 1.0 mmol·L-1 , aprot inin 1 ×105 U·L-1 ,
Leupeptin 20 μmol·L-1 , 体积分数为 0.01 Tri ton
X-100),轻轻混匀 。将细胞置于冰上孵育 30 min ,
冰浴条件下超声波破碎细胞 ,每次 10 s ,共 3 次 。
4℃, 13 000 g 离心 10 min ,小心吸出上清液体 ,置
于另外的 Eppendorf管中 ,贮存于-70℃备用。
1.4.2　细胞裂解液蛋白浓度测定　取少量上清液
用考马斯亮蓝法蛋白定量[ 6]
1.4.3　十二烷基硫酸钠 —聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)　采用 Bio-Rad公司微型垂直板电泳
槽 。制备分离胶 、浓缩胶 ,按预定顺序加样 , 恒压
200 V 电泳 ,当溴酚蓝到达分离胶底部时关闭电源。
小心剥离凝胶 。至此 ,凝胶可被固定并用考马斯亮
蓝染色 ,进行Western印迹反应。
1.4.4　考马斯亮蓝法对 SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色
及脱色　用至少 5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡
凝胶 ,放在平缓摇动的摇床上室温染色 30 min。取
出凝胶 ,将凝胶浸泡于含脱色液(体积分数为 0.45
的甲醇 ,0.45的水 , 0.10的冰醋酸)的平皿中 ,脱色
至凝胶无色 ,蛋白条带呈清晰可见的蓝色为止。
1.4.5　Western blo tting　依次放置预先用电转移
缓冲液饱和的海绵层※3层滤纸※凝胶※转印膜※
3层滤纸※电转移缓冲液饱和的海绵层※透明的多
孔塑料夹 ,合拢好夹子后放入电转移槽中 ,正确连接
电极 , 90 mA 4℃冷柜中电转移过夜 。按膜面积配
制封闭液(50 g·L-1脱脂奶粉 , 0.02的 NaN3 ,体积
分数为 0.02的 Tw een-20 ,溶于 PBS 中),封闭 3 h。
加入封闭液和适量的第一抗体(用封闭液 1∶1 000
～ 1∶2 000稀释),于 4℃孵育 2 h 。磷酸盐缓冲液漂
洗膜 4次 ,每次 15 min ,最后用漂洗液(150 mmol·
L
-1
NaCl , 50 mmol·L-1 Tris-Cl , pH 7.5)洗膜 1
次 ,10 min。按膜面积加入封闭液(50 g·L-1脱脂奶
粉 ,150 mmol·L -1 NaCl , 50 mmol·L-1 Tris-Cl , pH
7.5)和第二抗体(用封闭液 1∶2 000稀释),将膜与
第二抗体温育 2 h 。漂洗膜 15 min(150 mmol·L-1
NaCl , 50 mmol·L-1 Tris-Cl , pH 7.5),重复 3 ～ 4
次 。用 ECL 试剂发光底物显迹 。
2　结果
2.1　化合物 5F对 K562 细胞癌基因 Bcl-2表达的
影响　如 Fig 2所示 ,化合物 5F 作用 24 h后 ,随着
Fig 2　Effect of compound 5F on the
expression of Bcl-2 oncogene of K562 cel ls
　　(A)unt reated cells;(B) 8.875 μmol·L -1 compound 5F;(C)
35.5μmol·L-1 compound 5F;(D)142μmol·L -1 com pound 5F
·419·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin 　2002 Aug;18(4)
用药浓度增高 ,Bcl-2 条带的黑度和面积减少 ,说明
在化合物 5F 的作用下 , Bcl-2 的表达减少 ,当 5F 达
142 μmol·L-1时 ,已检测不到 Bcl-2的表达 。
2.2　化合物 5F对 K562细胞癌基因 Bax表达的影
响　如 Fig 3所示 ,化合物 5F 作用 24 h后 ,随着用
药浓度增高(8.875 、35.5 、142μmol·L-1), Bax 条带
的黑度和面积增大 ,说明在化合物 5F 的作用下 ,
Bax的表达增多 。
Fig 3　Effect of compound 5F on the expression
of Bax oncogene of K562 cells
　　(A)unt reated cells;(B)8.875 μmol·L -1 compound 5F;(C)
35.5μmol·L -1 com pound 5F;(D)142μmol·L -1 compound 5F
2.3　化合物 5F对 K562细胞癌基因 c-Fos表达的
影响　如 Fig 4所示 ,化合物 5F 作用 24 h 后 ,随着
用药浓度增高(8.875 、35.5 、142 μmol·L-1), c-Fos
条带的黑度和面积增大 ,说明在化合物 5F 的作用
下 , c-Fos的表达增多。
Fig 4　Effect of compound 5F on the expression
of c-Fos oncogene of K562 cell s
　　(A)untreated cells;(B)8.875μmol·L -1 compound 5F;(C)35.5
μmol·L -1 compound 5F;(D)142μmol·L -1 com pound 5F
2.4　化合物 5F对 K562细胞癌基因 c-Jun表达的
影响　如 Fig 5所示 ,化合物 5F 作用 24 h 后 ,随着
用药浓度增高(8.875 、35.5 、142 μmol·L-1), c-Jun
条带的黑度和面积增大 ,说明在化合物 5F 的作用
下 , c-Jun的表达增多 。
3　讨论
我们课题组经过多年的研究 ,从半边旗中分离
提取出几种具有杀伤肿瘤细胞作用的化合物 ,其中
5F 含量最多 ,对人早幼粒白血病细胞 HL-60 、肺癌
细胞SPC-A-1 、人鼻咽癌细胞CNE-2Z 、胃癌细胞
Fig 5　Effect of compound 5F on the expression
of c-Jun oncogene of K562 cells
　　(A)unt reated cells;(B)8.875 μmol· L-1 compound 5F;(C)
35.5μmol·L-1 compound 5F;(D)142μmol·L -1 com pound 5F
MGC-803有很强的杀伤作用 ,有希望开发成抗肿瘤
新药 ,所以本实验以化合物 5F 作为受试药物进行
研究 。bcl-2基因最早发现于 B细胞淋巴瘤中 ,它编
码 1个 26 ku蛋白 ,主要分布于内质网膜 、线粒体膜
及核膜上 。1988 年 Vaux 等首次证实 bcl-2高表达
可引起肿瘤 ,并明显延长细胞生长期[ 7] 。bcl-2基因
是凋亡调控基因 , Bcl-2过度表达 ,使 DNA受损害得
不到修复的细胞免于死亡而进入细胞循环 ,多种遗
传改变导致肿瘤的发生 。目前 ,已在肺癌 、前列腺
癌 、食管癌 、鼻咽癌 、大肠癌 、胆管癌及卵巢上皮癌等
多种恶性肿瘤中发现有 Bcl-2 的异常表达和(或)异
常类型蛋白质产物 。根据观察 , Bcl-2及其家族的过
度表达对化疗药物具有抗性 ,近年来已有体外实验
发现 bcl-2具有促进细胞恶性转化的作用 ,并已证实
其高度表达很可能是人类 B 细胞淋巴瘤和白血病
的生物学基础。Keith 报道 ,用 bcl-2基因的反义核
苷酸逆转 bcl-2基因高表达的白血病细胞 ,细胞增殖
活动明显被抑制[ 8] 。bax 基因是 bcl-2 基因家族的
一员 ,与 bcl-2具有同源性 ,能对抗 bcl-2的生物学活
性 ,bax可促进细胞凋亡 。最常见的 Bax 蛋白分子
量是 21 ku。Bax 可自身形成同源二聚体或与 Bcl-2
形成异源二聚体[ 9] 。当 Bax 在细胞中超表达时 ,bax
之间同型二聚体增加 ,细胞对死亡信号的反应增强 ,
细胞死亡增多 ,因此被称为“死亡激动剂” ;当 Bcl-2
超表达时 ,它与Bax 形成异二聚体 ,死亡被抑制 。因
而 ,bcl-2/bax 在细胞内的表达比率是决定细胞受到
某种刺激后发生凋亡的重要因素[ 10] , c-fos 、c-jun是
立早基因 ,易受外界刺激 , 与细胞的生长和分化密
切相关 ,其编码的蛋白质定位于细胞核 ,具有结合特
异 DNA序列和激活基因转录的活性 ,被称为转录
因子 、细胞内信号传导的第三信使 、基因转录调控的
分子开关[ 11 , 12] 。c -fos表达产物分子量 55 ku , c-jun
表达产物分子量 39 ku 。C-Fos和 c-Jun在细胞中最
常见以亮氨酸拉链结构域的异源二聚体 AP-1(acti-
vator protein-1 ,激活剂蛋白-1)形式而存在 , AP-1作
·420· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin 　2002 Aug;18(4)
为转录因子 ,以亮氨酸拉链方式作用于某个具有调
节功能的 DNA 部位 ,在转录水平调节特定基因的
表达[ 13 ,14] 。基础条件下 ,AP-1浓度和活性极低 ,分
子构成以 Jun 同源二聚体为主 ,细胞受到刺激时 ,
AP-1 短暂而迅速升高 ,并转变为以 c-Fos和 C-Jun
异源二聚体为主的存在形式[ 15] 。文献报道[ 16] ,表
鬼臼毒素引起寡核小体 DNA 断裂 ,在转录水平诱
导白血病 HL-60 细胞 c-fos 、c-jun 表达 ,激活 AP-1 ,
导致 HL-60细胞凋亡 。本文的结果表明 ,化合物 5F
作用机制之一是下调Bcl-2的表达 ,上调 Bax 、c-Fos 、
c-Jun的表达 。5F 在转录水平如何影响 K562 细胞
bcl-2 、bax 、c-fos、c-jun的表达 ,是否 5F 可以使 AP-1
活性提高 ,更具体的机制还有待于进一步研究 。
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The effects of a diterpenoid compound 5F isolated from Pteris
semipinnata L.on the expressions of several oncogenes of K562 cells
WANG Jing-Bin , LIANG Nian-Ci , MO Li-Er1
(Insti tute of Biochem istry and Molecular Biology , Guangdong Medical College;
1
Dept of Chemistry , Guangdong Medical College , Zhanjiang 524023)
ABSTRACT　AIM　To study the effects of diter-
penoid compound 5F (ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-
16-en-19-oic acid)isolated from Pteris Semipinnata
L.on the expressions of Bcl-2 、Bax 、c-Fos and c-Jun
of K562 cells.METHODS　K562 cells w ere t reated
w ith compound 5F for 24 hours first.Then Western
blo tting was used to detect the effects of compound
5F on the expressions of Bcl-2 、Bax 、c-Fos and c-Jun.
RESULTS　The expression of Bcl-2 decreased while
the expression of Bax , c-Fos and c-Jun increased af ter
the t reatment of 5F .CONCLUSIONS　One possible
mechanism of the anti-tumor ef fects of compound 5F
may be through up Bax , c-Fos , c-Jun and down Bcl-2
regulation.
KEY WORDS　Pteris semipinnata L .;diterpenoid;
oncogene
·421·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin 　2002 Aug;18(4)