全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 39870900);广东省科委重大科技攻关项目(9622007002)
作者简介:林意玲 ,女 ,副主任医师　　＊通讯作者:吴平 ,男 ,研究员 ,硕士生导师 　　Tel:(0759)2387542　　E-mai l:wping62@126.com
半边旗二萜类化合物 5F诱导人翼状胬肉成纤维细胞凋亡及对 caspase-3
表达的研究
林意玲a ,吴平b＊ ,廖海兰a , 张培华c , 何惠娟b ,江黎明b(广东医学院 a.附属医院眼科;b.附属医院中心实验室;c.整形外科研
究所 , 广东 湛江 , 524001)
摘要:目的　观察半边旗二萜类化合物 5F(5F)对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)的致凋亡作用及其对凋亡相关的半
胱氨酸蛋白酶 3(caspase-3)表达的影响。方法　采用 5F 不同药物浓度组(0 , 8 , 32 , 128 mg·L-1)作用不同时间处理细胞。噻唑
蓝比色法检测 5F对细胞增殖的影响;Hoechst33258 荧光染色法观察细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期及凋亡;RT-PCR检测
细胞内凋亡相关基因 caspase-3的转录水平;Western blot检测细胞 caspase-3蛋白表达;化学比色法检测细胞凋亡过程中 caspase-
3 活性的变化。结果　给药组细胞的生长与对照组相比均受到显著的抑制(P<0.01), 细胞增殖抑制率呈剂量和时间的依赖
关系;Hoechst33258荧光染色显示 , 给药组部分细胞呈典型的凋亡表现;流式细胞术检测在 32 mg·L-1浓度作用下 , 12 h 即出现
“凋亡峰” ,其峰值达(12.48±1.29)%;RT-PCR检测发现细胞内凋亡相关基因 caspase-3 mRNA 表达上调;Western blot检测细胞
caspase-3 蛋白表达水平升高;caspase-3活性检测显示 , 其活性呈剂量和时间依赖性增高 , 5F 浓度达到 128 mg·L-1时 , 其活性为
对照组的 3.52倍。结论　5F可显著地抑制 HPF增殖 、诱导细胞凋亡 、升高 caspase-3 活性 , 并呈明显的量效与时效关系;其诱
导细胞凋亡的作用机制可能与升高 caspase-3 活性 ,促进 caspase-3 基因转录和蛋白翻译 , 使细胞内 caspase-3 增加从而促进细胞
凋亡有关。
关键词:半边旗;二萜类;翼状胬肉;成纤维细胞;凋亡;半胱氨酸蛋白酶 3
中图分类号:R282.71;R977.3　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2006)13-0993-05
Experimental Research of Apoptosis in Pterygium Fibroblasts Induced by 5F and Effect on the Expression of
Caspase-3
LIN Yi-linga , WU Pingb＊ , LIAO Hai-lana , ZHANG Pei-huac , HE Hui-juanb , JIANG Li-mingb(a.Department of Ophthal-
mology;b.Central Laboratory;c.Institute of Reparative Surgery;Guangdong Medical College , Zhanjiang 524001 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To observe the induced apoptosis effect of 5F on HPF cultured in vitro and the expression of caspase-3.
METHODS　Cell were treated with different concentration of 5F(0 , 8 , 32 and 128 mg·L-1)with different time.The effect of 5F on cell pro-
liferation was detected by thiazole blue chromatomentry.Cell apoptosis was observed by Hoechst33258 fluorescent staining;flow cell cy cle and
apoptosis were investigated by flow cytometry.The transcription level of caspase-3 were determined by RT-PCR;The expression of caspase-3
protein was detected by Western blot;The change of caspase-3′s activity during the process of cell apoptosis was valued by chemistry chro-
matometry.RESULTS　Compared with the control group , the cell growth in experimental group was inhibited significantly(P <0.01), and
the cell proliferation inhibition rate showed a dose- and time- dependent manner.Hoechst33258 fluorescent staining displayed that cells in ex-
perimental group partly showed typical apoptosis.Under the effect of 5F with the concentration of 32.18 mg·L-1 , the peak of apoptosis was
reached at 12 h and was (12.48±1.29)%;RT-PCR showed that the expression of caspase-3 mRNA in cells was increased.Western blot
showed that the expression of caspase-3 protein was increased.The caspase-3 activity was increased dose- and time- dependerthy.The activity
was 3.52 times as control group when the concentration of 5F was 128 mg·L-1.CONCLUSION 　5F can inhibit the proliferation of PHF , in-
duce cell apoptosis , increases the activity of caspase-3 , and show a dose- and time- dependent manner.The mechanism of 5F inducing cell
[ 8] 　 GADIPATHI N R , BCRK BC.Active oxygen specics stimulate vascu-
lar smooth muscle cell growth and proto oncogene expression.Circ
growth and proto oncogene expression[ J] .Cire Res , 1992 , 70(3);
593.
[ 9] 　 QI A D , WU B J , ZHOU X B.Progress in endothelin investigation
[ J] .Prog Physiol Sci(生理科学进展), 1992, 3(1):46.
[ 10] 　HERNANDEZ-P RESA M , BUSTOS C, ORTEGO M , et al.Angiotensin
–converting enzyme inhibtor prevents arterial nuclear factor KB activa-
tion ,monocytokine attractant protein 1 expression andmacrophage infiltra-
tion in a rabbit model of early accelerated athe rosclerosis[ J] .Circula-
tion ,1997, 95:1532.
(收稿日期:2005-01-26)
·993·中国药学杂志 2006年 7月第 41卷第 13期　　　　　　　　　　 Chin Pharm J , 2006 July , Vol.41 No.13
apoptosis may relate with the increasing of caspase-3 activity , facilitating of transcription of caspase-3 and protein translation , increasing of
casepase-3 in order to accelerate the cell apoptosis.
KEY WORDS:Peris semipinnata L;diterpeniod;pterygium;fibroblasts;apoptosis;caspase-3
　　人翼状胬肉是眼科较常见和多发的眼病之一 ,
研究表明 ,翼状胬肉的主要成分为大量增生的成纤
维细胞 ,并由其导致相应的病变[ 1] ,但其确切发病机
制目前尚未完全明了 。目前较有效的治疗方法是手
术切除并辅以药物治疗。但手术复发率较高 。因
此 ,探讨药物对细胞增殖与凋亡的影响 ,从而寻找安
全 、有效 、副作用少的抗胬肉成纤维细胞增殖药物是
目前治疗胬肉复发的热点之一 。半边旗是一种中草
药 ,属凤尾蕨科植物 ,民间用于治疗蛇伤 、外伤出血 、
抗菌痢和肝炎等 ,我学院梁念慈教授领导的课题组
经过多年的研究发现 ,半边旗中的有效成分二萜类
化合物 5F[ 化学名为:11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝
壳杉烷-19 酸(ent-11alpha-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-
19-oic acid),简称 5F] ,具有显著的体内外抗肿瘤活
性 ,并且毒副作用小[ 2-5] ,但目前它对翼状胬肉的治
疗及细胞凋亡作用机制的研究尚鲜有报道。本研究
用人翼状胬肉成纤维细胞(human pterygium body fi-
broblast , HPF)体外原代培养模型 ,选用不同质量浓
度的半边旗二萜类化合物 5F ,从细胞生物学和分子
生物学水平初步探讨了 5F 对 HPF 的增殖 、凋亡的
影响及其可能的机制 ,以期为下一步寻找凋亡过程
中特异分子靶点提供实验依据 。
1　材　料
半边旗二萜类化合物 5F(分子式 C20H28O4 ,相对
分子质量 332 ,纯度 56%,广东医学院生物化学研究
所梁念慈教授惠赠)。Trizol , Super ScriptTM First-
Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒 、Tag DNA
聚合酶 、Marker ,DMEM 培养基 、胰蛋白酶(Gibco 公
司),新生牛血清(杭州四季青生物制品公司);二甲
基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶
(propidium iodide ,PI)(Sigma公司)。鼠抗人 caspase-3
单克隆抗体(Gene 公司);辣根酶标记兔抗鼠 IgG(北
京中山生物技术有限公司);Western blot试剂盒(珠
海百奥生物技术有限公司)。Caspase-3活性检测试
剂盒(美国 Gene公司)。
2　实验方法
2.1　翼状胬肉成纤维细胞的培养
培养组织取自本院眼科手术切除的原发性翼状
胬肉标本 ,所有病例术前均未接受过药物治疗 ,参考
Solomon等[ 1]的方法进行成纤维细胞原代及传代培
养 ,经显微镜及细胞生物学鉴定 ,证实为成纤维细
胞 ,实验选用第 4 ～ 9代细胞。
2.2　噻唑蓝比色法(MTT)测定不同质量浓度的 5F
对 HPF 增殖的影响
参照文献[ 6]方法进行 ,取对数生长期的成纤维
细胞用 0.25%胰蛋白酶消化后 ,将细胞以1×108个·
L-1密度接种于 96孔培养板中 ,每孔 200 μL ,于 37
℃,5%CO2孵箱中培养 24 h ,更换 10%FBS DMEM培
养基并加入 5F ,使药物终浓度分别为 0 , 8 , 16 , 32 ,
64 ,128 mg·L-1 ,每一质量浓度重复 6孔 。37 ℃,5%
CO2孵箱培养 24 h 后 ,每孔加入 MTT(5 g·L-1)20
μL ,继续培养 4 h ,吸去培养液 ,每孔加入 DMSO 100
μL ,于微量振荡器上振荡 10 min ,待紫色结晶完全溶
解后 ,立即用酶联免疫测定仪测定 570 nm处的吸光
度值 A 。求出增殖抑制率(IR%)。实验重复 3次 。
2.3　流式细胞术检测5F 对HPF 周期及凋亡的影响
分别收集 5F 不同药物剂量组(0 , 8 ,32 ,128 mg·
L-1)以及 32 mg·L-1作用不同时间组(0 , 24 , 48 , 72
h)的细胞 。加冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤离心2次 ,
加预冷的体积分数 70%乙醇 4 ℃固定过夜。次日
弃去乙醇后 , PBS 洗涤离心 ,留 0.2 mL PBS ,将细胞
轻轻吹打成单细胞悬液 ,加入 0.5 mL PI染液(含 PI
50 mg·L-1 ,Rnase 10 mg·L-1 ,Triton-X100 0.1%,枸橼
酸钠1 g·L-1 ,0.9%NaCl),4 ℃避光染色 30 min ,经
200目尼龙网过滤后 ,上机检测 10 000个细胞中 PI
荧光强度 ,并用联机专用软件处理数据 ,计算出各时
相细胞比例及凋亡比值 。
2.4　Hoechst33258荧光染色观察细胞形态变化
细胞在处理前 24 h于六孔板中铺板爬片 ,细胞
数为5×104个 ,待细胞贴壁并达到 50%～ 80%融合
后 ,各给药组加入 5F ,对照组加入 RPMI 1640培养
液 。24 h后 ,捞片并用4%多聚甲醛固定10 min ,PBS
洗涤后 ,Hoechst33258染色液染色 5 min ,置于荧光显
微镜下观察细胞形态结构及胞核的变化并拍照 。实
验重复 3次。
2.5　RT-PCR法检测 5F 对 HPF caspase-3 mRNA 表
达的影响
2.5.1 　细胞总 RNA的提取　用 PBS 洗涤实验各组
细胞 ,在培养瓶中加入 TrizolRNA 提取液 ,提取细胞
总 RNA。制备的细胞总 RNA 用紫外分光光度计测
·994· Chin Pharm J ,2006 July , Vol.41 No.13　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2006年 7月第 41卷第 13期
定读数 。A260/ A280为 1.8 ～ 2.0 ,调整 RNA 浓度为
1 g·L-1后即作 RT-PCR反应 。
2.5.2 　逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)及 PCR产物
半定量分析　引物设计参考文献[ 7] ,并经基因库核
对证实 ,由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成:Caspase-3 上游引物 5′-TTC AGA GGG GAT CGT
TGT AGA AGT C-3′,下游 5′-CAA GCT TGT CGG CAT
ACT GTT TCA G-3′,扩增产物为 265 bp的 caspase-3
cDNA片段;GAPDH:上游引物 5′-CCC ATC ACC ATC
TTC CAG-3′,下游 5′-CCT GCT TCC ACC TTC T-3′,扩
增产物为 577 bp的 caspase-3 cDNA片段 。
RT-PCR反应采用Gibco 公司提供的 RT-PCR试
剂盒按说明书严格进行操作 ,细胞总 RNA 反应量均
为4 μg ,总反应体积为 50μL。反应条件为:①cDNA
的合成和预变性:42 ℃, 50 min , 94 ℃3 min;②PCR
扩增:94 ℃,6min;94 ℃,50 s;55 ℃,50 s;72 ℃,90 s
共32个循环;③循环完毕后 72 ℃延伸 5 min。扩增
产物用约 1.5%琼脂糖凝胶电泳 , 稳压电泳 5 V·
cm-1约1.5 h ,0.5 mg·L-1溴乙锭染色 20 min后 ,紫
外灯观察 、拍照。在 UVP 凝胶成像系统中扫描 ,并
分析电泳带灰度。以特异性 caspase-3 扩增带灰度
与GAPDH 扩增带灰度之比 ,即表示 caspase-3 mRNA
表达量。实验重复 3次。
2.6　Western blot分析HPF caspase-3蛋白质的表达
将10×105个细胞接种于90 mm 培养皿 ,培养48
h ,待细胞生长至 90%的融合状态后 ,各实验组加入
不同质量浓度的 5F 继续培养 24 h ,然后每组用预冷
的PBS 冲洗 2 次 , 收集细胞 , 1 000 r·min-1离心 5
min ,弃上清 ,加入 100μL 裂解缓冲液(50 mmol·L-1
Tris-HCl , pH 8.0 , 150 mmol·L-1 NaCl , 0.02%NaN3 ,
100 mg·L-1 PMSF ,1%Triton X-100),放置 20 min ,每
个样品取 50 μL 的蛋白质行 SDS-PAGE电泳 。制备
8%聚丙烯酰胺分离胶 , 5%聚丙烯酰胺浓缩胶 。在
蛋白样品中加入等体积的加样缓冲液 ,煮沸 5 min
后 ,取 20 μL 上样 , 130 V 电压电泳;PVDF 膜电转
移 ,350 mA , 50 min。封闭缓冲液(10%脱脂奶粉 ,
0.5%聚山梨酯-20 , 0.02%叠氮钠 , pH 7.4),作用 1
h;加入稀释度为 1∶100的鼠抗人 caspase-3单克隆抗
体 ,37 ℃孵育 60 min;PBS-1 g·L-1聚山梨酯-20 洗
膜×3次 ,每次 10 min;加入稀释度为 1∶5 000 的辣
根酶标记兔抗鼠 IgG ,37 ℃孵育 1 h;PBS-1 g·L-1聚
山梨酯-20洗膜×3次 ,每次 10 min;显色系统显色 。
拍照 ,进行条带灰度扫描分析 。实验重复3次 。
2.7　Caspase-3活性检测
参照文献[ 8] ,按试剂盒说明书严格进行操作。
收集5F 作用后的各实验组细胞 ,加入冷细胞裂解缓
冲液 ,4 ℃, 12 000 r·min-1离心 3 min , 取上清加入
caspase-3底物(DEVP-PNA),37 ℃水浴 1 h 后在 405
nm 波长下读取 A值 。用不同质量浓度的标准 PNA
溶液在 405 nm 处测 A 值后 ,绘制 A对 PNA浓度的
标准曲线 ,计算其斜率 , caspase-3 活性单位(U)按下
列公式计算。U=各组 A 值/对照组 A 值×100%。
实验重复3次 。
2.8　统计学处理
用 SPSS10.0统计软件进行统计分析 。数据以
均数±标准差( x ±s)表示 ,两样本比较用 t 检验对
数据进行统计分析 。
3　结　果
3.1　5F的细胞毒作用
不同剂量的 5F(0 ,8 ,16 ,32 ,64 , 128 mg·L-1)不
同时间分别处理成纤维细胞后 ,对成纤维细胞的细
胞毒作用呈明显的剂量和时间依赖性 ,与对照组相
比 ,两者差异具有统计学意义(P <0.01)。见图 1。
5F作用成纤维细胞 24 h的 IC50为 32.18 mg·L-1 。
图 1　5F对成纤维细胞的生长抑制作用.n=6 , x±s
-◇--12 h;-□--24 h;-○--48 h;-■--72 h ,与对照组相比 , P<0.01
Fig 1　Inhibitory effect of 5F on HPF growth.n=6 , x±s
-◇--12 h;-□--24 h;-○--48 h;-■--72 h , vs control group , P<0.01
3.2　5F诱导成纤维细胞凋亡的形态学变化
荧光显微镜下观察:在用 5F 处理细胞 24 h后 ,
给药组细胞的结构形态发生明显的改变 , 部分细胞
呈典型的凋亡表现:细胞变小 、核固缩或边缘化或破
碎 ,出现凋亡小体 ,见图 2A 。而对照组细胞呈正常
的生长状态 ,可见细胞核为圆形 ,染色均匀。见图
2B。
3.3　流式细胞仪检测 5F对成纤维细胞周期的影响
用 5F(0 ,8 ,32 ,128 mg·L-1)处理细胞24 h后 ,用
流式细胞仪检测成纤维细胞周期 ,结果见表 1。可
见随着 5F浓度增大 ,成纤维细胞发生周期阻滞 ,大
量的细胞停留在 G1期 ,而 S ,G2期的细胞逐渐减少。
计算其增殖指数 PI=(S+G2)/(G1 +S+G2),从表 1
·995·中国药学杂志 2006年 7月第 41卷第 13期　　　　　　　　　　 Chin Pharm J , 2006 July , Vol.41 No.13
　　
图 2　5F诱导成纤维细胞凋亡的形态学变化(×400)
A-5F(32 mg·L-1)处理细胞 24 h ,箭头所指为凋亡细胞;B-对照组
Fig 2　Morphological changes of HPF by fluorescence microscope
(×400)
A-cell were treated with 5F(32 mg·L-1)for 24 h arrows indicate apoptosis cell;B-
control
可见 ,随着用药剂量增大 ,成纤维细胞增殖指数呈下
降趋势(P<0.05)。
表 1　不同质量浓度 5F对成纤维细胞周期的影响.%.n=
6 , x±s
Tab 1 　Effect of 5F at different dose on proliferation index in
HPF.%.n =6 , x±s
ρ(5F)
/mg·L-1
G1
phase
S
phase
G2/M
phase
PI
0 71.58±1.36 8.53±1.24 19.65±1.96 28.25
8 83.02±1.751) 7.02±0.781) 10.15±2.261) 17.14
32 86.96±1.171) 5.16±1.021) 8.56±2.181) 13.63
128 89.65±1.041) 3.06±1.481) 8.05±1.311) 11.02
注:与对照组相比 , 1)P<0.05
Note:vs control , 1)P<0.05
流式细胞仪检测结果显示 ,所有受检标本均显
示有 DNA低含量颗粒(亚 G1期峰),各给药组细胞
凋亡率分别为 7.18%,15.41%和 23.85%,对照组为
3.07%,显示出浓度依赖效应。5F 32mg·L-1作用细
胞12 h后即出现“亚 G1期峰” ,凋亡细胞比例峰值
为(12.48±1.29)%,在 24 h后凋亡细胞比例峰值增
加为(15.41±1.13)%,但在用药 48 ,72 h 后 ,细胞碎
片增多 ,凋亡细胞与坏死细胞并存 ,凋亡率分别为
(9.91±0.36)%,(8.96±0.54)%。
3.4　5F 对HPF caspase-3 mRNA表达的影响
不同药物浓度处理成纤维细胞 24 h , 均可以诱
导 caspase-3 mRNA表达增强 ,扩增产物条带经灰度
扫描联机图像分析系统半定量统计分析后 ,结果显
示 , caspase-3/GAPDH(内参物)的光密度积分值之比
随着 5F 作用浓度增加而增大 ,见图 3 ,与对照组相
比差异有显著性(P<0.05)。
32 mg·L-1 5F分别作用成纤维细胞 0 ,24 ,48 ,72
h ,结果可见 , caspase-3 mRNA 的条带逐渐变粗 、变
　　
图 3　5F对 HPF caspase-3 mRNA 表达的影响
M-marker;1～ 4-5F 0 , 8 ,32 ,128 mg·L-1处理细胞 24 h
Fig 3　Effect of 5F on caspase-3 mRNA expression
M-marker;1～ 4-HPFwere treated with 5F 0 ,8 ,32 ,128 mg·L-1
亮 ,mRNA条带经灰度扫描联机图像分析系统半定
量统计结果显示 , caspase-3/GAPDH(内参物)的光密
度积分值之比随作用时间延长而增大 ,与对照组比
差异有显著性(P<0.05)。
3.5　5F对 HPF caspase-3蛋白质表达的影响
Western blot结果显示 ,经不同质量浓度5F 处理
成纤维细胞 , caspase-3蛋白条带逐渐变细 ,见图 4 ,
提示随着药物浓度的增加 , caspase-3酶原被裂解活
化;用 32 mg·L-15F 分别作用成纤维细胞 0 ,24 , 48 ,
72 h ,结果可见 , caspase-3蛋白条带逐渐变细 ,说明
随着时间的延长 , caspase-3酶原也被裂解活化。
图 4　5F对 HPF caspase-3蛋白表达的影响
Fig 4　Effect of 5F on caspase-3 protein expression
3.6　Caspase-3相对活性的测定结果
结果显示 ,随着药物浓度的增加 , caspase-3酶活
性显著增高 , 128 mg·L-1时酶活性为对照组的 3.52
倍;随着作用时间的延长 , caspase-3酶活性也显著增
高 ,作用 72 h时 ,酶活性为对照组的 4.23倍 。见图
5。
4　讨　论
半边旗别名凤凰尾巴草 、半凤尾草 、半边梳 、甘
草蕨等 ,是凤尾蕨科凤尾蕨属植物 ,产于四川及长江
以南各省区 ,具有疏解风寒 、化湿消肿 、清热解毒的
功效。民间用来治疗细菌性痢疾 、肝炎 、毒蛇咬伤 、
外伤性出血等[ 9] 。翼状胬肉是一种以成纤维细胞大
量异常增生 、细胞外基质过度沉积为组织学特点的
纤维增生性疾病 ,是目前眼科研究课题之一 。目前
5F 对人翼状胬肉的治疗及细胞凋亡作用机制的研
·996· Chin Pharm J ,2006 July , Vol.41 No.13　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2006年 7月第 41卷第 13期
　　
图 5　5F对 HPF caspase-3 活性的影响.n=3 , x±s
A-不同质量浓度5F 对细胞 caspase-3活性的影响;B-同一(32 mg·L-1)质量
浓度不同时间 5F 对细胞 caspase-3活性的影响;与对照组相比 , 1)P<0.01
Fig 5　Caspase-3 activity measured by caspase-3 colorimetric as-
say.n =3 , x±s
A-aspase-3 activity in cell exposed to 5F with different concentration;B-Activity of
caspase-3 after treatment with 32 mg·L-15F for different time in cell, vs control group ,
1)P<0.01
究尚鲜有报道。本实验研究发现 ,5F 对HPF 的增殖
抑制率随着浓度的增加而增加(P <0.01);在同一
浓度 32 mg·L-1条件下 ,不同作用时间亦具有显著
性(P <0.01)。这表明 5F 呈剂量与时间依赖性地
抑制 HPF 的增殖。流式细胞术检测 5F 对 HPF 周期
分布的影响 ,结果显示 ,5F可以使 HPF 发生G1期阻
滞 ,而 S和G2期的细胞明显减少 ,并且均出现凋亡
峰(G1峰),呈浓度依赖效应 。提示 5F 可以抑制细
胞的分裂和增殖 。
本实验研究结果表明 ,在 5F 作用 12 h ,流式细
胞仪即检测到G1期前有一亚二倍峰(凋亡峰),其凋
亡值为(12.48±1.29)%,说明实验剂量的 5F 可以
诱导HPF 产生凋亡。本研究进一步用特异性荧光
染料 Hoechst33258与 PI 双染法从形态学检测了 5F
诱导HPF 的凋亡。实验结果表明 ,5F 作用细胞后有
凋亡发生 ,且随着药物浓度增加和作用时间的延长
而凋亡数越多。因此 ,无论从流式细胞仪检测结果
还是荧光双染实验结果 ,都充分表明5F 也可以通过
诱导凋亡(至少部分)来抑制HPF的增殖 。
实验发现 ,随着 5F 剂量的增加 、处理时间的延
长 ,成纤维细胞的 caspase-3 mRNA表达增加 ,呈现明
显的剂量和时间依赖性。提示 5F 可促进 caspase-3
基因的转录而诱导成纤维细胞发生凋亡。Western
Blot法检测 caspase-3 蛋白含量发现 ,未处理的成纤
维细胞即基础表达 caspase-3 ,其以无活性的酶原形
式存在 ,且表达量较高。当受到药物刺激时 ,酶原被
　　
裂解 ,成为有活性的片段 ,启动凋亡程序 ,且酶原裂
解速度超过新的酶原合成。结果显示 ,随着5F 剂量
的增加和作用时间延长 ,被水解的 caspase-3酶原增
多 ,其条带逐渐变细 ,酶原逐渐减少。用化学生色底
物检测 caspase-3酶活性 ,呈剂量 、时间依赖性增高 ,
128 mg·L-1的 5F处理成纤维细胞 72 h ,其酶活性为
对照组的4.23倍 。提示 caspase-3基因的蛋白翻译
水平同样是 5F 的作用位点 , 5F 通过增加 caspase-3
蛋白表达 、活化而促进细胞凋亡 。
综上所述 ,5F 以剂量 、时间依赖性的方式诱导
HPF凋亡 ,表现为典型的细胞核固缩 、凝聚和破碎 ,
出现凋亡小体 ,荧光染色显示细胞凋亡增高 ,流式细
胞仪检测出细胞凋亡峰 。5F 诱导 HPF 凋亡的机制
为从转录和翻译水平激活 caspase-3 ,最终触发凋亡。
有关 caspase-3与其家族成员的关系及前者与其他
凋亡基因的相互作用机制 ,还有待今后进一步的深
入研究 。
REFERENCES
[ 1] 　 SOLOMON A , LI D Q , LEE S B, et al.Regulation of collagenase ,
stromelysin , and urokinase-type plasminogen activator in primary
pterygium body fibroblasts by inflammatory cytokines[ J] .Invest Oph-
thalmol Vis Sci , 2000 , 41(8):2154-2163.
[ 2] 　 ZHANG X , CUI L ,NOBUTOSHI T , et al.The active constituents an-
titumor action of Pteris semipinnata[ J] .Chin Pharm J(中国药学杂
志),1997 , 32(1):37-38.
[ 3] 　 LI J H , LIANG N C ,MO L E , et al.Comparison of the cytotoxicity of
f ive const ituents f rom pteri s se mipinnatl.In vitro and the analysis of
their structure activity relationships[ J] .Acta Pharm Sin(药学学
报),1998 , 33(9):641-644.
[ 4] 　 WANG J B , LIANG N C , MO L E.The effects of a diterpenoid com-
pound 5F isolated f rom Pteris semipinnata L.on the expressions of
several oncogenes of K562 cells[ J] .Chin Pharmacol Bull(中国药理
学通报), 2002 , 18(4):418-421.
[ 5] 　 LI J H , HE C W , LIANG N C , et al.Effects of antitumor com-
pounds isolated from Pteris semipinnata L on DNA topoisomerases and
cell cycle of HL-60 cells[ J] .Acta Pharmacol Sin(中国药理学报),
1999 , 20(6):541-545.
[ 6] 　 LI C L , CUI Z Y , LI S Z.A modified chromatometry method and i ts
application for MTT[ J] .Shanghai J Immunol(上海免疫学杂志),
1996 , 16(5):306-307.
[ 7] 　 WINTER R N , KRAMER A , BORKOWSKI A , et al.Loss of cas-
pase-1 and caspase-3 protein expression in human prostate cancer[ J] .
Cancer Res , 2001, 61(3):1227-1232.
[ 8] 　 RAMACHANDRAN A , MOELLERING D R , CEASER E , et al.In-
hibition of mitochondrial protein synthesis results in increased en-
dothelial cell susceptibility to nitric oxide-induced apoptosis[ J] .Proc
Natl Acad Sci ,2002 , 99(10):6643-6648.
[ 9] 　 DING H S.Chinese Pharmacon Spore-Producing Plant(中国药用孢
子植物)[ M] .Shanghai:Shanghai Science Technology Publishing
Company , 1971:104.
(收稿日期:2005-10-18)
·997·中国药学杂志 2006年 7月第 41卷第 13期　　　　　　　　　　 Chin Pharm J , 2006 July , Vol.41 No.13