全 文 ：瓶尔小草为蕨类植物瓶尔小草科瓶尔小草
Ophioglossum vulgatum L.，又名独叶一枝枪 ，矛盾
草，全草入药。 《纲目拾遗》中记载，瓶尔小草性味
苦、甘，凉，入肺经，具有清热解毒、消肿止痛的功
效，主要用于治疗小儿肺炎、脘腹胀痛、毒蛇咬伤、
疔疮肿毒；外用治疗急性结膜炎、角膜云翳、眼睑
缘炎 ［1］。 分布于东北、陕西、湖北、云南、贵州、广
西、台湾、福建等地。 含 3-O-甲基槲皮素、7-O-双
葡萄糖苷、4’-O-葡萄糖苷等黄酮类化合物 ［2-3］。植
物内生真菌一般是指在某一时期生活在植物体
内，但对宿主植物组织不引起明显病害症状，并与
宿主植物建立和谐联合关系的一类真菌。 研究表
明植物内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有
生理活性的次生代谢产物， 是新的天然产物的重
要来源［4］。 本研究以瓶尔小草为材料，进行内生真
菌的分离、纯化，并对分离得到的内生真菌进行体
外抗神经炎症活性测定， 为进一步提高瓶尔小草
药用价值，开发利用瓶尔小草资源，开发新型药物
先导化合物提供实验依据。
1 仪器和材料
1.1 材料 瓶尔小草采于福建永春，经福建中医
Content Comparison of Flavone from Different Chinese Yam Germplasm
YI Jun1, HUANG Yuxian2, WANG Tao3
(1. Department of Science, Fujian Institute of Education, Fuzhou, Fujian 350003, China; 2. Fujian Vocational College of
Bioengineering, Fuzhou, Fujian 350002, China; 3. Research Institute of Chinese Medicine, Tianjin University of
Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China)
ABSTRACT: Objective To evaluate the quality of Chinese yam from different germplasm resources.
Methods The contents of flavone from different Chinese yam germplasm were determined by the methods of
UV-spectrophotometry and ultrasonic extraction. Results Under the same conditions of ecology environ-
ment, cultivation and processing, the contents of flavone from different Chinese yam germplasm were 0.0508%
-0.2366%, and the average content of Chinese yam flavone from Fujian germplasm was 0.1503%. Conclu-
sion Under the same conditions of ecology environment, cultivation and processing, there are significant dif-
ferences in flavone content among Chinese yams from different germplasm resources.
KEY WORDS: different germplasm resources; Chinese yam; flavone content; comparison
瓶尔小草内生真菌代谢产物的体外抗神经炎症活性
林 婧 1，蔡巧燕 1，林久茂 1，曾岳龙 2，翁妹妹 2，马莲花 2，彭 军 1
（1. 福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）
摘要： 目的 观察瓶尔小草内生真菌代谢产物的体外抗神经炎症活性。 方法 用组织块法
对瓶尔小草内生真菌进行了分离，脂多糖（LPS）刺激小胶质细胞造成神经炎症模型，用 MTT 法检测
细胞活力，Elisa 法测定 LPS 诱导的 TNF-α 的表达。 结果 从瓶尔小草中分离纯化得到 24 株菌
株，其中有 3 株（PE-4、PE-9、PE-24）菌株代谢物可明显抑制 LPS 诱导的炎症模型中 TNF-α 产生，
PE-24 菌株的抗炎活性最强。 结论 瓶尔小草内生真菌具有一定的抗神经炎症活性，是筛选天然
生物活性成分或先导化合物的潜在资源。
关键词：瓶尔小草；内生真菌；抗炎活性；肿瘤坏死因子-α；小胶质细胞
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1004-5627（2013）03-0032-03
收稿日期：2013-03-11
基金项目：福建省自然科学基金资助课题（2011J01210），福建省教育厅资助课题（JA10182）
作者简介：林婧（1989—），女，研究实习员，主要从事中药提取及活性成分研究。
通讯作者：彭军（1969—），男，教授。 E-mail：pjunlab@hotmail.com
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Journal of Fujian University of TCM June 2013，23 （3）
福建中医药大学学报 2013 年 6 月 第 23 卷 第 3 期
32
DOI:10.13261/j.cnki.jfutcm.002810
药大学药学院杨成梓副教授鉴定为蕨类植物瓶尔
小草。 新生牛血清、胰酶 、磷酸盐缓冲液 （美国
HycLone 公司）；DMEM 高糖（美国 Gibco 公司）；脂
多糖（美国 Sigma 公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、
二甲基亚砜（DMSO）、IL-6 酶联免疫试剂（上海西
塘生物科技有限公司）；乙醇、乙酸乙酯、次氯酸
钠、升汞为国产分析纯；培养基 PDA、PDB（自制）。
1.2 细胞株 小鼠小胶质细胞株 BV-2 （美国
American type culture collection 公司）。
1.3 仪器 Infinite M200 多功能酶标仪 （奥地利
Tecan 公司）；HF212UV CO2 培养箱 （香港力康仪
器设备有限公司）；SW-CJ-1FD 超净工作台（苏州
安泰仪器设备有限公司 ）；TDL-50B 低速离心机
（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；RE-520A 旋
转蒸发器 （上海亚荣生化仪器厂）；TS-100F 倒置
显微镜 （日本 Nikon 公司）；HYG-A 全温摇床柜
（江苏太仓实验设备厂）；YXQ-LS-75S 蒸汽灭菌
器（上海博迅有限公司）。
2 方 法
2.1 内生真菌分离 取新鲜瓶尔小草 6～10 根，
洗净切段，自然晾干后，在无菌条件下，用 75％乙
醇漂洗 30 s， 无菌水冲洗 4 次，5％ NaClO 溶液漂
洗 3 min，无菌水冲洗 4 次，75％乙醇漂洗 30 s，无
菌水冲洗 4 次 。 无菌滤纸片吸干水分 ， 切成 5
mm×5 mm×1 mm 的小块， 切口分别紧贴新鲜的
PDA 培养基中，置 28℃培养箱中培养，每天观察内
生真菌菌落生长情况。与此同时做对照实验：将表
面消毒后的瓶尔小草不作切割置相同条件下培
养，结果无任何微生物长出，证明表面消毒彻底，
分离到的真菌是瓶尔小草的内生真菌。 根据菌落
形态、颜色差异、长出时间的不同，分别挑取各平
板上的菌落边缘菌丝接种于新的培养基上进行分
离培养。 培养 5～7 d 后，观察菌落的形态及其菌
落边缘的整齐情况，并作相应的记录。 经过分离、
筛选、 纯化的反复过程， 直至得到纯化的典型菌
落。 纯化后的菌种移至相同培养基的斜面上培养
后，4 ℃保存，编号备用。
2.2 内生真菌发酵培养 在无菌条件下，从 PDA
平板培养基中取内生真菌 1 cm×1 cm， 转接入
250 mL 摇瓶内装的 100 mL 无菌 PDB 培养基中，
28℃、200 r ／min 摇床振荡培养 14 d， 直至菌丝完
全溶化，得到发酵液。
2.3 样品溶液制备 发酵结束后，发酵液经 4 层
纱布过滤 3 次，得到上清液。分离得到的内生真菌
用乙酸乙酯萃取，溶液旋转蒸干成浸膏，分别精密
称取干燥恒重的乙酸乙酯提取物 10 mg，DMSO 溶
解，定容至 100 μL，即得 100 μg ／μL的母液，备用。
2.4 细胞培养 小鼠小胶质细胞株 BV-2 细胞置
于含 10%胎牛血清、100 μg ／mL 青霉素和 100 μg ／
mL 链霉素的 DMEM 高糖培养液中，37℃、5％ CO2
培养箱中培养。
2.5 酶联免疫法（Elisa 法）检测 用 Elisa 法检测
内生真菌对 LPS 诱导的 TNF-α 产物的抑制作用：
取指数生长期的 BV-2 细胞配制成细胞悬液，分
别以 1×105个 ／mL 接种于 24 孔板中，培养 24 h，
弃去培养液， 每孔加入 100 μL 不完全培养基，饥
饿 4 h。再加入 LPS（1 μg ／mL）和不同浓度（25 μg ／
mL、50 μg ／mL、100 μg ／mL）的样品，每个样品设 5
个复孔， 干预 24 h。 实验分为： 空白对照组、LPS
组、LPS 加 PE-4 组、LPS 加 PE-9 组、LPS 加 PE-
24 组，24 h 后检测细胞上清液中 TNF-α 的表达
量，按照 Elisa 试剂盒说明书操作。
2.6 MTT 法检测 采用 MTT 法检测内生真菌对
BV-2 细胞活力的影响：将指数生长期的 BV-2 细
胞配制成细胞悬液接种于 96 孔板，密度为 1×105
个 ／mL，培养 24 h，弃去培养液，加入 100 μL 不完
全培养基，饥饿 4 h。再加入 LPS（1 μg ／mL）和不同
浓度（25 μg ／mL、50 μg ／mL、100 μg ／mL）的样品干
预 24 h，分组同 2.5 项，24 h 后弃上清液，每孔加
入 100 μL 0.5 mg ／mLMTT 的 PBS 溶液，37℃孵育
4 h，再去上清液 ，每孔加入 100 μL DMSO，震荡
10 min，使结晶溶解后，在酶标仪 570 nm 波长处
测定其吸光度值（OD 值），计算其细胞活力。
细胞活力＝（实验组 OD 值÷对照组 OD 值）×
100%
2.7 统计学处理 数据用 x±s 表示，用 SPSS 13.0
统计软件分析， 组间比较用方差分析及 t 检验，
P＜0.05 为差异具有统计学意义。
3 结 果
实验结果见表 1、表 2。
4 讨 论
脂多糖又称内毒素， 为革兰阴性细菌胞壁外
膜层的主要成分，LPS 作为一种多克隆免疫激发
剂来模拟机体免疫激发状态， 是研究免疫系统与
神经系统之间信息交流的常用模型 ［5-6］，我们采用
LPS 刺激小鼠小胶质细胞株 BV-2 细胞，通过观察
LPS 诱导的炎性因子 TNF-α 的分泌量来判断神经
第 3期 林 婧等：瓶尔小草内生真菌代谢产物的体外抗神经炎症活性 33
炎症模型的建立是否成功。 经过对 LPS 不同浓度
（0.1、1、10 μg ／mL）及干预时间（3、6、24 h）的实验
发现，LPS 干预浓度和干预时间分别以 1 μg ／mL、
24 h 为最佳， 这时细胞形态及细胞活力和正常培
养细胞比较无明显差异，但检测发现 TNF-α 的分
泌明显升高。 在炎症模型中，内生真菌 PE-4、PE-
9、PE-24 在 100 μg ／mL、50 μg ／mL、25 μg ／mL 均
可显著抑制炎症因子 TNF-α 的释放，起到明显的
抗炎作用，其中 PE-24 抗炎效果最佳，且发酵培养
后产量较大。 目前我们正在对该株菌发酵产物进
行进一步机制研究及柱色谱分离， 希望能从中发
现抗炎天然活性化合物。可见，瓶尔小草内生真菌
可通过抑制炎症因子的释放而对神经细胞发挥保
护作用， 可为开发新型药物先导化合物提供实验
依据。
参考文献：
［1］ 谢宗万. 全国中草药汇编［M］. 北京：人民卫生出版社：2009.
［2］ 赵保发，张志信，张仕秀，等. 不同采收季节瓶尔小草黄酮类
化合物含量分析［J］. 时珍国医国药，2009，20（2）：345-346.
［3］ 张帼威，吴奶珠 ，范强 ，等 . 狭叶瓶尔小草化学成分的研究
［J］. 天然产物研究与开发，2010，22（6）：1006-1008.
［4］ 黎万奎，胡之璧 . 内生真菌与天然药物［J］. 中国天然药物，
2005，3（4）：193-199.
［5］ 熊加祥，白云，宋敏，等 . 炎性介质脂多糖、C 干扰素活化星
形胶质细胞效应 ［J］. 第三军医大学学报 ，2008，30 （22）：
2065-2068.
［6］ 张海玉，单玉兴，武宁，等. 不同浓度脂多糖对 J774A. 1 细胞
CD14表达的影响［J］. 吉林大学学报，2006，32（2）：221-223.
表 2 瓶尔小草内生真菌对 BV-2
细胞活力的影响（n＝5）
组 别
空 白 组
LPS 组
LPS 加 PE-4 组
LPS 加 PE-9 组
LPS 加 PE-24 组
浓度 ／ （μg ／mL）
—
1
25
50
100
25
50
100
25
50
100
细胞活力 ／%
100±1.1
97.71±1.5
99.85±1.0
99.71±1.2
96.33±0.9
99.41±0.4
97.36±0.8
98.53±1.5
104.11±0.8
101.76±2.1
99.71±1.9
表 1 瓶尔小草内生真菌对 LPS 诱导的 BV-2
细胞 TNF-α 活性的影响（n＝5）
组 别
空 白 组
LPS 组
LPS 加 PE-4 组
LPS 加 PE-9 组
LPS 加 PE-24 组
浓度 ／ （μg ／mL）
—
1
25
50
100
25
50
100
25
50
100
TNF-α ／ （pg ／mL）
495.78±0.015
1107.63±0.0161）
918.19±0.0232）
843.93±0.0342）
801.15±0.0182）
1026.15±0.0302）
898.74±0.0192）
879.67±0.0322）
561.15±0.0122）
405.41±0.0172）
345.04±0.0182）
注：与空白组比较，1） P＜0.01；与 LPS 组比较，2） P＜
0.01。
Anti-neuroinflammatory activity of Metabolites from Endophytic Fungi of Ophioglossum Vulgatum L.
in Vitro
LIN Jing, CAI Qiaoyan, LIN Jiumao, et al
(Fujian Academy of Integrative Medicine, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350122, China)
ABSTRACT: Objective To observe the anti-neuroinflammatory activity of metabolites from endophytic
fungi of ophioglossum vulgatum l. in vitro. Methods The endophytic fungi was isolated by tissue block
method, the model of neuroinflammation was established by stimulating microglia with lipopolysaccharide
(LPS), the cells viability was determined by MTT assay, and the expression of TNF-α was determined by Elisa
assay. Results 24 strains were gained and 3 strains (PE-4, PE-9 and PE-24) had inhibitory effect on the
expression of TNF-α in BV-2 cells induced by LPS, especially PE-24. Conclusion The endophytic fungi
of ophioglossum vulgatum L. has a certain anti-inflammatory activities, and could be a potential resource for
screening natural bioactivity constituents.
KEY WORDS: ophioglossum vulgatum L.; endophytic fungi; anti-inflammatory activities; TNF-α;
福建中医药大学学报 第 23卷34