全 文 ：从指纹图谱清晰地鉴别不同来源的柴胡药材。说明
该指纹图谱的提取 、测试 、分析方法对柴胡类药材具
有较好的分离效果和较广泛的应用范围。为研究柴
胡这一类药材的指纹图谱分析鉴定提供了较好的科
学参考数据 。
参 考 文 献
[ 1] 潘胜利 , 大桥裕 . 中国柴胡属药用植物の种类と分
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及其化学成分的研究 . 上海第一医学院学报 , 1984, 11
(1):1.
(2005 - 09 -07收稿)
Studies on F ingerpr ints ofBupleurum chinense from H ebei Province w ith HPLC-UV
X IAO Rong1 , 2 ,WANG Chun-y ing1 , ZHANG Zhi-fe i1 , YUAN Zhi-fang1 , ZHANG Lan-tong1
(1.Department o f Pharm aceuticalAna lysis, Schoo l o f Pharm acy of HebeiM ed ica lUniversity, Shijiazhuang 050017;2. Beijing United-
w ealth M edicam en t L im ited C om pany, Be ijing 100176)
Abstrac t Objective:To estab lish aHPLC finge rprint ana ly sis m e thod fo r identification ofB upleurum chinense o fH ebei P rovince
and compare the fing erprints o f Rad ix Bup leuri co llec ted from differen t habitats so as to estab lish a sensitive and specific me thod fo r
contro lling the qua lity o f Rad ix Bupleuri. M ethods:The HPLC-UV finge rprints o f Radix Bup leuri from diffe rent hab ita tsw ere ob ta ined
from W a te rs 1525 instrum ents. TheH PLC separa tion w as perform ed on a C18 ana ly tica l co lum n g radien t e luted w ith am ixture consisting
o f acetonitrile and wa ter a t a flow ra te o f 1. 0 m l /m in w ith UV de tec to r a t 203 nm. The tem pe ra ture o f co lumn w as 30℃. Results:The
mu tua lm ode o fHPLC-UV finge rprints wa s set up, and the sim ilar deg ree s to the c rude drugs of differen t habitats we re com pa red. Con-
clusion:I t is sim ple and quick to diffe rBupleurum ch inense from d iffe rent hab ita tsw ith them ethod tha t can be used as a quality contro l
item fo rRadix Bup leuri.
K ey words Bupleurum chinense DC.;Saiko saponin;HPLC;F inge rprints
中药材海金沙 X射线衍射 Fourier指纹图谱鉴定
徐海星1 ,刘小平 1 ,瞿国义 2 ,石守鹏1
(1.武汉理工大学化学工程学院制药工程系 ,湖北武汉 430070;2.湖北省罗田县万密斋医院 ,湖北罗田
438600)
摘要 目的:建立中药材海金沙新的分析鉴定方法。方法:以甲醇 、氯仿 、石油醚为提取溶剂 , 提取中药材海金
沙 , 采用粉末 X射线衍射 Fourie r谱鉴定法对提取物进行分析鉴定。结果:通过对三种海金沙药材的甲醇 、氯仿 、石
油醚提取物实验 , 分析 、比较所得出的图谱 , 获得了海金沙的标准 X射线衍射 Fourie r指纹图谱及特征标记峰值。
结论:实验结果表明 , X射线衍射 Fourier指纹图谱鉴定法可用于中药材海金沙的分析鉴定。
关键词 海金沙;X射线衍射;指纹图谱;鉴定
中图分类号:R282.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2006)02-0123-04
海金沙为多年生蕨类植物海金沙科 Lygod ium
japon icum(Thunb.)Sw.的成熟孢子。别名铁线藤 、
左转藤 。主产于广东 、浙江 ,分布于长江流域及南方
各省区 ,生于灌木林边 。秋季孢子未脱落时采割藤
叶 ,晒干 ,搓揉或打下孢子。海金沙为常用中药材 ,
甘 、寒 ,归膀胱经 ,能清利湿热 ,通淋止痛 ,用于热淋 、
砂淋 、血淋 、膏淋 、尿道涩痛。全草有抗菌 、利尿作
用 ,常用于上呼吸道感染 、流行性腮腺炎 、尿路感染
等 [ 1、 2] 。本文应用粉末 X射线衍射 Fou rier谱鉴定
法对 3个海金沙中药材样品进行了实验分析测定 ,
获得了标准 X射线衍射 Fou rier指纹图谱和特征标
记峰值。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 D M/ AX-ⅢA型 X射线衍射仪
(日本理学 R ikagu)、ZK-40A减压干燥箱 (上海审光
仪器仪表有限公司 )、HH-S型恒温水浴箱 (巩义市
英峪予华仪器厂 )、766-1型远红外快速干燥箱 (沪
粤科技仪器厂 ),甲醇 、氯仿购自湖北省化工科技开
发公司武汉华飞试剂厂 ,石油醚 (30 ～ 60℃)购自天
津市广成化学试剂有限公司 ,均为分析纯。
123中药材第 29卷第 2期 2006年 2月
DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牰牣牥牪牣牥牨牨
1.2 样品和方法 3个海金沙样品的编号 、来源 、
拉丁名等见表 1所示 ,样品各取 10 g,索氏回流提取
至提取器内无颜色 ,提取液水浴浓缩 ,减压干燥 ,供
X射线衍射样品。标本来源于本院中药标本室 ,产
于湖北黄冈 ,标本 、1#、2#样品由刘小平教授鉴定 。
表 1 3个海金沙样品信息
编号 衍射图号(图 1-3) 名称 来源 拉丁名
1# 1 海金沙 湖南 Lygod ium japon icum(Thunb.)Sw.
2# 2 海金沙 江西 Lygod ium japon icum(Thunb.)Sw.
3# 3 海金沙 标本 Lygod ium japon icum(Thunb.)Sw.
图 1 三种海金沙甲醇提取物的 X衍射图谱
图 2 三种海金沙氯仿提取物的 X衍射图谱
图 3 三种海金沙石油醚提取物的 X衍射图谱
1.3 测试条件 使用日本理学 Rikagu D M/ AX-Ⅲ
A型 X射线衍射仪收集衍射实验数据 , CuKα1 辐
射 ,石墨单色器。扫描方式:定性 ,步进扫描;电压 /
电流:35 kV /30 mA;扫描速度:10°/m in,步长:0.02°
(2θ);预置时间:0.2s;扫描范围:(2θ)5 ～ 50°。
2 结果
实验数据以晶面间距 d(×10-1 nm )、衍射相对
强度 Ⅰ /Ⅰ 0表示 ,记为 d(Ⅰ /Ⅰ 0)。相应的衍射谱
图见图 1 ～ 3。
三种海金沙甲醇提取物的 X衍射图谱峰值(图
1):
1
#:相应的 18个特征标记峰为:6.0341 /70,
4.3197 /100, 4.0329 /95, 3.9794 /93, 3.4849 /87,
3.4295 /74, 3.2713 /67 , 3.0118 /87, 2.8156 /86,
2.3220 /39, 2.2105 /36 , 2.1890 /37, 2.1560 /41,
2.1433 /35, 2.1203 /36 , 2.0034 /32, 1.8547 /41,
1.8309 /27。
2
#:相应的 21个特征标记峰为:5.9935 /85,
4.1253 /99, 3.5561 /82 , 3.4557 /93, 3.3485 /66,
3.2808 /65, 2.9921 /100, 2.8053 /84, 2.7748 /46,
2.6010 /45, 2.2681 /38 , 2.1819 /38, 2.1356 /46,
2.0922 /34, 2.0722 /33 , 2.0516 /36, 2.0001 /35,
1.9458 /32, 1.9317 /31, 1.9073 /35, 1.8420 /46。
3
#:相应的 20个特征标记峰为:5.9935 /77,
4.5847 /94, 4.4132 /100, 4.2623 /89, 4.0916 /81,
3.9971 /78, 3.9205 /70 , 3.7697 /68, 3.4662 /59,
3.3860 /44, 3.0000 /72 , 2.8104 /49, 2.7287 /28,
2.6128 /25, 2.3511 /24 , 2.1404 /30, 2.0525 /21,
1.9110 /23, 1.8769 /19, 1.8490 /27。
三种海金沙氯仿提取物的 X衍射图谱峰值(图
2):
1
#:相应的 20个特征标记峰为:6.0096 /69,
4.5567 /94, 4.3197 /98, 4.2025 /100, 3.4689 /67,
3.4217 /47, 3.1732 /44 , 3.0039 /73, 2.9308 /34,
2.8070 /47, 2.6873 /28 , 2.6337 /26, 2.5217 /25,
2.4933 /25, 2.3370 /26 , 2.2659 /26, 2.1819 /24,
2.1433 /30, 2.0490 /23, 1.8476 /32。
2
#:相应的 25个特征标记峰为:6.0422 /66,
5.6300 /51, 5.4846 /54 , 5.1316 /65, 4.7100 /82,
4.6178 /87, 4.4219 /90, 4.3032 /100, 3.9884 /89,
3.8015 /71, 3.7078 /66 , 3.4876 /73, 3.0079 /80,
2.8956 /34, 2.8087 /51 , 2.7681 /31, 2.7207 /31,
2.6826 /33, 2.4371 /30 , 2.2713 /28, 2.2283 /28,
2.1385 /30, 2.0913 /26, 1.9118 /26, 1.8733 /21。
3
#:相应的 20个特征标记峰为:6.0015 /75,
124 中药材第 29卷第 2期 2006年 2月
4.5154 /95, 4.3617 /89, 4.2583 /92 , 4.1367 /100,
3.8833 /78, 3.4636 /72, 3.1382 /39, 3.0020 /71,
2.9497 /34, 2.8087 /55, 2.7142 /32, 2.4371 /23,
2.2681 /24, 2.2315 /23, 2.1849 /27 , 2.1327 /27,
1.9371 /23, 1.9065 /24, 1.8448 /31。
三种海金沙石油醚提取物的 X衍射图谱峰值
(图 3):
1
#:相应的 11个特征标记峰为:6.0587 /95,
4.1253 /100, 3.5758 /81, 3.4957 /94, 3.4012 /64,
3.0603 /59, 3.0198 /97, 2.8260 /77, 2.6322 /33,
2.4169 /33, 1.8511 /49。
2
#:相应的 16个特征标记峰为:7.6812 /51,
6.0341 /74, 4.1674 /100, 3.4636 /97, 3.0501 /55,
3.0039 /96, 2.8139 /90, 2.3488 /32, 2.2272 /33,
2.1365 /38, 2.1212 /32, 2.0596 /31, 1.9681 /29,
1.9489 /27, 1.9057 /27, 1.8469 /42。
3
#:相应的 11个特征标记峰为:8.8450 /46,
5.9694 /92, 4.5847 /65, 3.9900 /80, 3.8934 /75,
3.4557 /100, 2.9960 /99, 2.8019 /84, 2.1241 /26,
2.0561 /24, 1.8441 /48。
3 讨论
3.1 粉末 X射线衍射 Fourier指纹图谱在鉴别中
成药和中药质量标准方面有快速 、简便 、易行 、准确 、
图谱信息量大和指纹性强等优点 [ 3] 。它提供一种
既能反映中药整体固有结构特征 ,又能表现来自其
局部成分变化的图谱化与数值化的方法[ 4] 。它是
在微观的衍射空间再现中药整体结构特点 ,是对宏
观可视特征的传统性状显微鉴定的继承和发展 ,从
另一个角度综合分析控制中药的质量。运用 X射
线衍射鉴定中药已有很多报道 [ 5-10] ,结果表明:X射
线衍射分析是一种不需要化学溶剂介入 ,能反映中
药固有形态下所含每种化学组份的分子结构的整体
特征 ,是一种可取的波谱分析方法 。X射线粉末衍
射指纹图谱质控技术的研究与应用 ,对从原料药开
始进行质量控制 ,实施中药 GAP管理 ,实现中药现
代化具有重要意义。
表 2 不同海金沙相同溶剂提取物相似度分析表
对照样品 实验样品 相似度计算
3#(甲醇提取物) 1#(甲醇提取物) 0. 930
3#(甲醇提取物) 2#(甲醇提取物) 0. 923
3#(氯仿提取物) 1#(氯仿提取物) 0. 938
3#(氯仿提取物) 2#(氯仿提取物) 0. 997
3#(石油醚提取物) 1#(石油醚提取物) 0. 896
3#(石油醚提取物) 2#(石油醚提取物) 0. 904
3.2 相似度分析[ 11] :不同海金沙药材的相同溶剂
提取物的 X射线衍射 Fou rier指纹图谱的特征峰基
本相似 ,几何拓扑图形规律一致 。对三种海金沙的
相同溶剂提取物的 X射线衍射 Fourier指纹图谱的
特征峰进行相似度分析 ,结果见表 2。
相似度计算结果表明 ,以标本为对照 ,各样品间
有一定的差异 ,相似度分析结果表明:2#氯仿提取物
与标本相似度最好 (0.997),可用于分析鉴别。
3.3 经计算获得了海金沙 X射线衍射特征标记
峰 , 共 17 个:6.0178 /70, 4.5361 /95, 4.3282 /96,
4.2304 /86, 4.0626 /95 , 3.8424 /75, 3.4734 /64,
3.0046 /75, 2.9254 /34 , 2.8081 /51, 2.7074 /30,
2.6581 /75, 2.4371 /27 , 2.2684 /26, 2.1984 /26,
2.1382 /29, 1.8552 /28。
3.4 不同产地的海金沙其特征峰的强度有所不
同 ,表明其所含成分的含量有所差异 。海金沙为草
本植物 ,生长环境要求不高 ,分布极广 ,不同的地域
及生态环境均可影响其所含的化学成分 ,因此有必
要对海金沙的标准化种植等进行系统科学的研究 。
3.5 本研究结果表明:三种不同产地的海金沙的
相同溶剂提取物的 X射线衍射 Fourier图谱的特征
峰基本相似 ,几何拓扑图形规律一致 。衍射特征标
记峰的相似程度则反映所含化学组成的一致性。因
此 ,以标准 X射线衍射 Fourier图谱的几何拓扑图形
与特征标记峰值可实现对中药材海金沙的鉴定。本
文结果显示了 X射线衍射 Fourier图谱鉴定法具有
广阔的应用前景。
参 考 文 献
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(2005 - 09 -12收稿)
Identification on Spora Lygodii by X-RayD iffrac tion F ingerpr int Spec traM ethod
XU H ai-x ing1 , LIU X iao-ping1 , QU Guo-y i2 , SH I Shou-peng1
(1.Pharm acy o f Pha rm aceutica l Eng ineering, Schoo l o f Chem ica lEnginee ring, W uhan University o f Techno logy, W uhan 430070, Chi-
na;2.W anm izha iH ospita l of Luo tian County, H ubei P rovince, Luo tian 438600, China)
Abstrac t Objective:To se t up a new identifica tion and ana ly sis me thod o f Spora Lygodi.i M ethod:To ge t the ex tracts o f Spora
Lygodii using me thano l, chlorofo rm and petro leum ether as so lvent and the ex tracts we re identified、 ana lyzed by X-ray d iffrac tion Fou-
rier fingerprint spectra. Resu lts:Expe rim ents and analysis w ere ca rried out on th ree sam ples. The standa rd X-ray diffraction Fourier
fing erprint spectra and cha racteristic d iffrac tion peaks we re obta ined. The re w ere som e differences am ong the spectra of the ex trac ts,
but the characteristic diffraction peaks we re obv ious. Conclusion:The expe rim en ta l result indicated tha t X-ray diffraction Fourier fin-
ge rprint spectra can be used to identify and analyze the Ch inese traditiona l herb Lygodium japonicum(Thunb.)Sw.
K ey words Lygod ium japonicum(Thunb.)Sw.;X-Ray D iffrac tion;F inge rprint spectra; Identifica tion
天麻 AFLP银染法显带研究
常楚瑞 ,王晓丽 ,龙庆德
(贵阳医学院药用植物学与生药学教研室 ,贵州贵阳 550004)
摘要 以天麻为实验材料 , 对 AFLP指纹银染技术及实验操作中的关键技巧做了比较详尽的叙述 ,取得了比较
理想的实验结果。
关键词 天麻;扩增片段长度多态性;银染技术
中图分类号:R282.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2006)02-0126-03
基金项目:国家科技部(2004BA721A33)、贵州省科技厅(黔科合农社字〔2001〕1125号 、黔科合中药专字 [ 2003] 51号)课题资助
AFLP(Amp lified fragmen t leng th polymo rphism )
是 1992年由荷兰科学家 Zabeau和 Vos发明的一种
十分有效的分子标记技术 [ 1] ,该技术具有灵敏度
高 、准确性高 、易操作等优点因而倍受分子生物学家
的青睐 。用银染法对扩增产物进行显色分析 ,比同
位素操作安全 、快速 、成本低 ,而且可以获得与应用
同位素一样清晰的图片 ,因而被很多实验室采用 ,是
一种新的 DNA指纹技术[ 2] 。
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)银染是 AFLP技
术的关键。它能很好地分离鉴别核酸小片段 ,与琼
脂糖凝胶电泳相比 ,操作复杂 ,价格高 ,但其分辨率
高 ,能分辨相差几个碱基的核酸小片段 ,结果可永久
保存 ,从该胶中回收的 DNA纯度极高 ,可适用于分
子生物学中较高要求的实验等 。由于该技术涉及到
DNA限制性内切酶的酶切与连接 , PCR扩增及聚丙
烯酰胺凝胶电泳的分析 ,因此对实验过程中各个环
节的具体操作要求比较严格 ,本文对此进行了简要
的探讨。
1 材料
实验材料为兰科天麻 (Gastrodia elata B lume.)
新鲜花葶基因组 DNA(药材由贵阳医学院王晓丽教
授鉴定 、提供 ),试剂包括聚丙烯酰胺凝胶 、限制性
内切酶 、T4连接酶 、硝酸银 、无水碳酸钠 、硫代硫酸
钠 、甲醛。
2 方法 [ 3 ～ 5]
2.1 提取高质量基因组 DNA 该实验需要限制性
内切酶酶切 ,因此要求天麻的 RNA、蛋白质 、多糖以
及其它次生代谢物质去除得比较干净 ,纯度较高。
用分光光度计检测 DNA的浓度及质量 , 0.8%琼脂
糖凝胶检测 DNA有无降解 , 主带是否清晰 ,调整
DNA样品的浓度在 200 ng /μl左右 ,备用。
2.2 模板 DNA的酶切与连接 采用 M seⅠ和 Pst
Ⅰ 2种限制性内切酶进行双酶切 ,其酶切-连接反应
体系:DNA(200 ng /μl)2.5 μl,M seⅠ (切点 T /TAA)
126 中药材第 29卷第 2期 2006年 2月