全 文 ：收稿日期:2005-12-20
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870900);广东省科委重大科技攻关项目(9622007002)
作者简介:林意玲(1963-),女,广东吴川人,副主任医师;吴 平,导师,通讯作者.E-mail:wping62@126.com
半边旗二萜类化合物5F对人翼状胬肉成纤维细胞
结缔组织生长因子表达和胶原合成的影响
林意玲 1,吴 平 2,廖海兰 1,张培华 3,何惠娟 2,江黎明 4,梁念慈 4
(广东医学院 1.附属医院眼科;2.附属医院中心实验室;3.整形外科研究所;
4.生物化学与分子生物学研究所,广东 湛江 524001)
摘 要:【目的】观察半边旗二萜类化合物 5F(5F)对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖和胶
原合成及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。【方法】利用手术切除的人翼状胬肉组织进行原代细胞培养,
即得到 HPF。将不同质量不同浓度(0、8、32、128)μg/mL的 5F作用于HPF24h,通过噻唑蓝比色法(MTT)检测
5F对细胞增殖的作用;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)检测 5F对细胞中 CTGF
mRNA及蛋白表达水平的影响;用化学比色法检测 5F对细胞胶原蛋白含量的影响。【结果】在 HPF中加入不
同质量浓度(0、8、32、128)μg/mL的 5F作用 24h,各组剂量的 5F均可以明显抑制 HPF的增殖(P<0.01),其半
数抑制率(IC50)为 32.12μg/mL。在 8～128μg/mL的剂量范围内,5F能显著地下调 CTGFmRNA(0.69±0.05,0.38±
0.06,0.19±0.04,与对照组 0.82±0.09比较,P<0.05或 P<0.01)和 CTGF蛋白(82.34±5.16,31.46±4.98,23.28±
2.65,与对照组 98.12±7.20比较,P<0.05或 P<0.01)的表达水平,能显著地降低胶原蛋白的含量﹙13.95±1.49,
12.53±0.51,5.89±0.80,与对照组 16.19±1.02比较,P<0.05或 P<0.01),且均有明显的剂量—效应关系。【结论】
半边旗二萜类化合物 5F能显著地抑制体外培养的 HPF的增殖和胶原蛋白的含量,使细胞的 CTGFmRNA及
蛋白表达明显下调,并且呈显著的量效关系,表明半边旗 5F具有体外抗纤维化作用,这为寻找有效治疗 HPF
的药物提供了新的思路。
关键词:半边旗;二萜类;翼状胬肉;成纤维细胞;结缔组织生长因子;胶原
中图分类号:R282.71;R977.3 文献标识码:A 文章编号:1672-3554(2006)04-0369-05
EfectofDiterpenoidCompound5FfromPterisSemipinnataL.onExpressionofConnective
TissueGrowthFactorandColagenSynthesisinHumanPterygiumFibroblasts
LINYi-ling1,WUPing2,LIAOHai-lan1,ZHANGPei-hua3,HEHui-juan2,JIANGLi-ming4,LIANGNian-ci4
(1.DepartmentofOphthalmology,TheAfiliatedHospital;2.TheCentralLaboratory,TheAfiliatedHospital;3.TheInstituteof
ReparativeSurgery;4.TheInstituteofBiochemistryandMolecularBiology,GuangdongMedicalColege,Zhanjiang524001,China)
Abstract:【Objective】Toobservetheefectofditerpenoidcompound5FfromPterissemipinnataL.(5F)onthe
celproliferation,colagensynthesisandtheexpressionofconnectivetissuesgrowthfactor(CTGF)inhumanpterygium
fibroblasts(HPF)culturedinvitro.【Method】 HPFusedwereprimarycelculturewithexairesishumanpterygium
tissues.HPFcelsweretreatedwithdiferentmassconcentrations(0,8,32,128μg/mL)of5Ffor24h.Theefectof
5Foncelproliferationwasmeasuredby3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromidemethod.
TheexpressionofCTGFmRNAandproteinweredetectedbyRT-PCRandWesternblot,andthecontentofcolagen
proteinofcelsweredeterminedbychemistrychromatometry.【Result】HPFcelproliferationwassignificantdepressed
(P<0.01)afterthecelsweretreatedwith5Ffor24h(theIC50was32.12μg/mL).5Finconcentrationrangeof8～128
μg/mLmarkedlyinhibitedtheexpressionofbothCTGFmRNA(0.69±0.05,0.38±0.06,0.19±0.04,P<0.05orP<0.01)
andCTGFprotein(82.34±5.16,31.46±4.98,23.28±2.65,P<0.05orP<0.01),andthesynthesisofcolagenprotein
(13.95±1.49,12.53±0.51,5.89±0.80,P<0.05orP<0.01)ofthecelsandbothshowedthedependentrelationwith
dose.【Conclusion】Aditerpenoidcompound5FfromPterissemipinnataL.coulddepressthecelproliferationand
第27卷 第4期
2006年 7月
Vol.27 No.4
July 2006
中山大学学报(医学科学版)
JOURNALOFSUNYAT-SENUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES)
DOI:10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2006.0094
人翼状胬肉是以成纤维细胞异常增殖、胶原大
量合成、细胞外基质过度沉积为组织学特点的眼
科较常见和多发的眼病之一。手术虽然能切除胬
肉,但复发率较高,其确切的发病机制目前尚未完
全清楚。近年来国内外的研究[1-3]发现,结缔组织生
长因子 (connectivetissuesgrowthfactor,CTGF)是
转化生长因子(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)
发挥生物效应的下游因子,对纤维细胞的分化增
生及细胞外基质的合成和降解具有很强的调控作
用,其在各种类型的纤维化疾病中的过度异常表
达可能是引起组织纤维化的重要机制之一。半边
旗(PterissemipinnataL.)是一种中草药,民间用于
治疗蛇伤、外伤出血、抗菌痢和肝炎等。梁念慈发
现[4,5],半边旗中的有效成分二萜类化合物 5F[化学
名为:11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19
酸 (ent-11alpha-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-
oicacid),简称 5F],具有显著的体内外抗肿瘤活
性,并且毒副作用小,但目前它对翼状胬肉的治疗
及细胞凋亡作用机制的研究尚鲜有报道。本研究
用人翼状胬肉成纤维细胞 (humanpterygiumbody
fibroblast,HPF)体外原代培养模型,选用不同浓度
的半边旗 5F对细胞作用的影响,并从基因和蛋白
水平初步探讨半边旗 5F对 HPF的增殖和 CTGF
的影响及其可能的机制,以期为下一步寻找治疗
HPF的有效药物提供实验依据。
1材料和方法
1.1 材 料
半边旗 5F由广东医学院生物化学与分子生
物学研究所梁念慈教授提供。Trizol、SuperScriptTM
First-StrandSynthesisSystemforRT-PCR试剂盒、
TagDNA 聚 合 酶 、Marker、DMEM (Dulbeccos
ModifiedEagleMedium)培养基、胰蛋白酶均购自
GIBCO公司,新生牛血清为杭州四季青生物制品
公司产品,二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝
(Td-T-mediatedDutpendlabeling[3-4,5-dimethyl-
2-thiazolyl]2,5-diphengltetrazoliumbromide,MTT)均
为Sigma公司产品。山羊抗人CTGF多克隆抗体购
自SantaGruz公司;辣根酶标记兔抗山羊 IgG购自
北京中山生物技术有限公司;DABsystemfor
westernblot试剂盒购自珠海百奥生物技术有限公
司。
1.2 标本来源及细胞培养
培养组织取自本院眼科手术切除的原发性翼
状胬肉标本,12病例术前均未接受过药物治疗,组
织块原代培养参考 Solomon等[6]的方法进行细胞
原代及传代培养,经显微镜及细胞生物学鉴定,证
实为成纤维细胞,实验选用第4～9代细胞。
1.3 噻唑蓝比色法 (MTT)测定不同浓度 5F对
HPF增殖的影响
参照文献[7]方法进行,取对数生长期的成纤
维细胞用质量浓度 2.5g/L的胰蛋白酶消化后,将
细胞以1×108/L密度接种于 96孔培养板中,每孔
200μL,于 37℃、体积分数 5%的 CO2孵箱中培养
24h,更换体积分数 10%的 FBSDMEM培养基并
加入5F,使药物终浓度分别为(0、8、16、32、64、128
μg/mL,每一浓度重复 6孔。孵箱培养 24h后,每
孔加入 MTT(5mg/mL)20μL,继续培养 4h,吸去
培养液,每孔加入 DMSO100μL,于微量振荡器上
振荡 10min,待紫色结晶完全溶解后,立即用酶联
免疫测定仪(美国 BioRad550型)测定 570nm处
的吸光度值 A,求出增殖抑制率(inhibitionrate,IR,
%)。抑制率(IR)=(1-用药组 A值/对照组 A值)
×100%。 按 改 良 Karber式 计 算 半 数 抑 制 率
(IC50):lgIC50=Xm-i[P-(3-Pm-Pn)/4],其中 i=lg
(最大剂量/相邻剂量),Xm=lg最大剂量,P=阳性
反应率之和,Pm=最大阳性反应率,Pn=最小阳性
反应率。
1.4 RT-PCR检测 5F对 HPFCTGFmRNA表
达的影响
用 PBS洗涤实验各组细胞,在培养瓶中加
TrizolRNA提取液提取细胞总RNA。制备的细胞总
RNA用紫外分光光度计测定读数 A260/A280为 1.8～
colagensynthesis, inducethedown-regulationoftheexpressionofCTGFmRNAandproteininHPFwiththe
significantdose-efectrelationship(P<0.05).Itshowsthat5Fhavethefunctionofantifibrosisinvitro,whichprovides
newthoughtoffindingefectivedrugforHPF.
Keywords:PterissemipinnataL.; diterpeniod; pterygium; fibroblasts; connectivetissuegrowthfactor;
colagen
[JSUNYat-senUniv(MedSci),2006,27(4):369-373]
中山大学学报(医学科学版) 第27卷370
2.0,调整 RNA浓度为 1g/L后即作 RT-PCR反
应。引物设计参考人CTGFcDNA序列,进行特异性
CTGF引物设计,同时选用 β-actin作为内参照。
CTGF:上游 5′-AACTATGATTAGAGCCAA
CTGCCTG-3′,下游 5′-TCATGCCATGTCTCC
GTACATCTTC-3′,用这对引物可扩增出长度为
475bp的CTGFcDNA片段;β-actin:上游 5′-CCG
CGAGAAGATGACCCAGAT-3′,下游 5′-GAA
GCATTTGCGGTGGACGA-3′,用这对引物可扩
增出长度为781bp的 β-actincDNA片段。引物均
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
RT-PCR反应采用 Gibco公司提供的 RT-PCR试
剂盒按说明书严格进行操作,细胞总 RNA反应量
均为 4μg,总反应体积为 50μL。反应条件为:①
cDNA的合成和预变性:42℃,50min,94℃3min;②
PCR扩增:94℃45s,55℃45s,72℃1min共 28
个循环,循环完毕后72℃延伸7min。扩增产物用
质量浓度 15g/L的琼脂糖凝胶电泳,稳压电泳 5
V/cm约 1.5h,0.5μg/mL溴乙锭染色 20min后,
紫外灯观察、拍照。在UVP凝胶成像系统中扫描,
并分析电泳带灰度。以特异性 CTGF扩增带吸光
度值 A与 β-actin扩增带吸光度值 A之比半定量
代表CTGFmRNA的表达水平。
1.5Westernblot分析HPFCTGF蛋白的表达
将10×105细胞接种于90mm培养皿,培养 48
h,待细胞生长至体积分数 90%的融合状态后,各
实验组加入不同浓度的 5F继续培养 24h,然后每
组用预冷的 PBS冲洗 2次,收集细胞,1000r/min
离心5min,弃上清,加入100μL裂解缓冲液(50
mmol/LTris-HClpH8.0,150mmol/LNaCl,6.25
mmol/LNaN3,100μg/mLPMSF,体积分数 1%Triton
X-100),放置 20min,每个样品取 50μL的蛋白质
行SDS-PAGE电泳。制备80g/L的聚丙烯酰胺分
离胶,50g/L的聚丙烯酰胺浓缩胶。在蛋白样品中
加入等体积的加样缓冲液,煮沸 5min后,取 20
μL上样,130V电压电泳;PVDF膜电转移,350
mA,50min。封闭缓冲液(100g/L的脱脂奶粉,体积
分数 0.5%Tween-20,6.25mmol/LNaN3,pH7.4),
作用 1h;加入稀释度为 1∶100的山羊抗人 CTGF
多克隆抗体,37℃孵育 60min;PBS+体积分数
1‰Tween20洗膜 3次,每次 10min;加入稀释度
为 1∶5000的辣根酶标记兔抗山羊 IgG,37℃孵
育 1h;PBS+体积分数 1‰Tween20洗膜 3次,每
次 10min;显色系统显色。拍照,进行条带灰度扫
描,分析电泳带灰度,以 CTGF的条带吸光度值 A
代表蛋白质含量。
1.6 半边旗5F对HPF胶原合成的影响
将细胞接种于 24孔培养板,细胞密度 5×104/
孔,每孔加入1mL培养基。接种48h后更换培养
基,同时加入不同浓度 5F,每一浓度设计 4个平
行孔。药物作用 48h,从每孔各吸取 0.5mL培养
基,按羟脯氨酸检测试剂盒说明书方法测定培养
基中羟脯氨酸的含量。用酶标仪 540nm检测 A
值,样品中羟脯氨酸浓度(μg/mL)=测定管 A值±
标准管浓度/标准液 A值;样品中胶原浓度样品羟
脯氨酸浓度×7.46×稀释倍数 (7.46是从羟脯氨酸
换算为胶原时的计算常数)。
1.7 统计学方法
用SPSS11.0统计软件进行统计分析。数据以
均数±标准差(x±s)表示,多组比较如果方差齐同,
采用单因素方差分析(one-way-ANOVA),两两比
较采用最小显著差异法(LSD法)检验,P<0.05差
异有统计学意义。
2 结 果
2.1 半边旗5F对HPF增殖的抑制作用
不同浓度的半边旗 5F(0、8、16、32、64、128
μg/mL)分别处理细胞24h后,用MTT比色法检测
其对细胞的增殖抑制率(IR,%)分别为 0,13.24±
0.73,28.23±0.81,47.63±1.24,69.82±1.31,88.93±
1.92。在8～128μg/mL的剂量范围内,5F的抑制作
用均有明显的剂量—效应关系。与对照组相比,差
异具有统计学意义(F=2646.1,P<0.01,图1)。5F对
细胞的半数抑制率(IC50)为32.12μg/mL。
图 1 半边旗 5F对 HPF的生长抑制作用。
Fig.1 InhibitoryefectofPterissemipinnataL.of5Fon
HPFgrowth.
n=6,x±s;vscontrolgroup,P<0.01
林意玲,等.半边旗二萜类化合物 5F对人翼状胬肉成纤维细胞结缔组织生长因子表达和胶原合成的影响第4期 371
2.2 5F对HPFCTGFmRNA表达的作用
RT-PCR产物电泳结果显示,各组细胞 CTGF
mRNA在 475bp和 781bp位置上均出现特异性
条带,与预期扩增片断的长度相符(图 2)。半边旗
5F不同药物浓度组(0、8、32、128μg/mL)处理细胞
24h后,细胞 CTGFmRNA表达量的相对吸光度
值 A为:0.82±0.09,0.69±0.05,0.38±0.06,0.19±
0.04。在 8～128μg/mL的剂量范围内,随着半边旗
5F作用浓度的增加,细胞的 CTGFmRNA表达相
对量遂渐减少(图 2),与 0μg/mL对照组相比,差异
均有统计学意义(F=62.6,P<0.01)。
2.3 半边旗5F对HPFCTGF蛋白质表达的作用
Westernblot结果如图3所示,经半边旗5F0、
8、32、128μg/mL作用 24h后,细胞 CTGF蛋白表
达量的吸光度值 A为:98.12±7.20,82.34±5.16,
31.46±4.98,23.28±2.65。在8～128μg/mL的剂量范
围内,随着半边旗 5F作用浓度的增加,细胞的
CTGF蛋白表达量遂渐减少(图 3),与 0μg/mL对
照组相比,差异均有统计学意义 (F=149.0,P<
0.01)。
2.4 半边旗5F对HPF胶原蛋白合成的作用
结果如表 1,可见半边旗 5F0、8、32、128μg/
mL对 HPF胶原蛋白合成有显著的抑制作用,随着
用药浓度增加,细胞的羟脯氨酸、胶原蛋白含量逐
渐减少,胶原蛋白各组与 0μg/mL对照组相比,差
异均有统计学意义(F=56.2,P<0.05或P<0.01)。
3 讨 论
CTGF最早从人脐静脉内皮细胞分离出来,它
是一种富含半胱氨酸的长度为 349个氨基酸的多
肽,分子质量约为 36～38ku,是即刻早期基因 CCN
(CTGF、Cef10、cyr61和 Nov)家族成员,可由成纤维
细胞、平滑肌细胞、部份血管内皮细胞和软骨细胞
等分泌。研究发现,在 CTGF启动子序列 128～162
位置上存在着一个重要的 TGFβ1调控元件,其点
突变可以导致TGFβ1活性完全丧失,故认为 CTGF
是 TGFβ1致纤维化作用的直接下游效应介质[8]。
Igarashi等[9]用原位杂交方法先后发现在系统性和
图 2 5F对 HPFCTGFmRNA表达的影响
Fig.2 Efectof5FonCTGFmRNAexpression
HPFweretreatedwith5F0,8,32,128μg/mL
Comparedwith0μg/mLgroup,*P<0.05,**P<0.01
图 3 5F对 HPFCTGF蛋白表达的影响
Fig.3 Efectof5FonCTGFproteinexpression
HPFweretreatedwith5F(0,8,32,128)μg/mL
Comparedwith0μg/mLgroup,*P<0.05,**P<0.01
表 1 不同浓度半边旗 5F对 HPF胶原蛋白的影响
Table1 EfectsofPterissemipinnataL.of5Fwithdiferent
concentrationoncolageninHPF (n=6,x±s,μg/mL)
!(μg/mL)
0
8
32
128
Hydroproline
2.17±0.13
1.87±0.16
1.68±0.14
0.79±0.10
Colagen
16.19±1.02
13.95±1.491)
12.53±0.512)
5.89±0.802)
vscontrolgroup,1)P<0.05,2)P<0.01
中山大学学报(医学科学版) 第27卷
!(5F)
!(5F)
372
[1]
局限性硬皮病皮损中均有 CTGFmRNA的表达,
而在同一患者正常皮肤或正常人对照组皮肤中则
呈阴性。国内学者郭长梅等[10]用免疫组化方法发
现在增生性玻璃体视网膜病变增生膜中也有
CTGF表达上调,表明 CTGF参与了增生性玻璃体
视网膜病变增生膜的形成和发展。
有研究表明敲除 TGF-β1基因的小鼠因失去
对炎症的抑制而在出生后很快死于严重的全身性
炎症[11]。与TGF-β1相比,在生理状态下CTGF主要
在间质细胞中低水平表达,其作用范围也主要局限
于结缔组织,因此在创伤修复或者纤维化过程中,
CTGF是一种特异性更强的、选择性干预结缔组织
形成过程的靶细胞因子。阻断其表达可能更特异、
更有效、更安全地治疗纤维化疾病。我们的实验研
究表明,半边旗 5F在一定浓度范围内可以抑制体
外培养的 HPF的增殖和胶原合成,当药物浓度高
于8μg/mL时,细胞呈现抑制状态,随药物浓度增高,
作用效果愈明显,药物浓度在16～128μg/mL时,与
对照组相比,细胞抑制率呈显著性增加(P<0.01),
验证半边旗5F对细胞呈剂量依赖性抑制。
为进一步证明半边旗 5F抑制 HPF胶原合成
的作用是由于其有效抑制了 HPF内 CTGF的基因
转录和蛋白合成,我们分别用RT-PCR和Western
blot技术检测了 HPF中 CTGFmRNA及蛋白的表
达,结果表明,半边旗 5F在一定浓度范围内(8～
128)μg/mL可 以 使 体 外 培 养 的 HPF中 CTGF
mRNA及蛋白的表达水平下调,说明半边旗 5F能
从转录和翻译水平对HPF的抑制作用。这表明半
边旗5F具有体外抗人翼状胬肉纤维化的作用。此
发现为进一步探索其对人翼状胬肉纤维化的防治
作用和作用机制提供了实验依据,并且提示半边
旗5F有可能成为抗人翼状胬肉的可行药物。
作为祖国传统中药材的半边旗具有资源丰
富、价格低廉等优点,因此其在治疗人翼状胬肉方
面具有良好的应用前景,有望成为临床防治人翼状
胬肉的有效药物。其具体确切的作用机制和疗效
仍有待进一步深入的动物实验研究和临床验证。
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