全 文 ：技术与方法
圆盖阴石蕨中总黄酮的超声波提取及含量测定
杨小凤 ,叶筱琴 ,仇佩虹 ,黄可新 ,谢夏丰
(温州医学院 化学教研室 , 浙江 温州　325035)
[ 摘　要] 　目的:运用超声波提取圆盖阴石蕨中总黄酮并对总黄酮的含量进行测定。方法:正交设计优选圆
盖阴石蕨中总黄酮的提取条件;以芦丁为标准品 ,利用黄酮类分子中的酚羟基可与 Al3+在碱性溶液中显色
原理 ,在 500 nm 处用分光光度法测定总黄酮的含量。结果:用 70%乙醇在 50 ℃下超声波提取时间为 0.5 h ,
提取体积80 ml ,提取次数为1 次。圆盖阴石蕨根茎中总黄酮的含量为 1.65%,平均回收率为 98.30%, RSD=
0.68%(n=5),圆盖阴石蕨叶子中总黄酮的含量为 3.42%,平均回收率为 98.53%, RSD=0.70%(n=5)。结
论:运用超声波提取圆盖阴石蕨中总黄酮 , 提取时间短 , 收率高。
[ 关键词] 　超声波;圆盖阴石蕨;总黄酮;含量测定
[ 中图分类号] 　R914:O644.3 　　[ 文献标识码] 　B　　[文章编号] 　1000-2138(2004)06-0480-03
　　骨碎补科(Davalliaceae)植物圆盖阴石蕨(Humata tyerman-
ni Moore)分布在浙江 、福建 、江西 、广东和广西等地 , 生于溪
边 、阴湿岩石或树干上 , 尤其在浙江此资源甚丰富。《中药大
辞典》记载 , 其主治风湿痹痛 , 湿热黄疸 , 咳嗽 , 哮喘 , 肺痛 , 乳
痛 ,牙龈肿痛 , 淋病 ,带下 , 蛇伤 ,并能祛风除湿 , 清热解毒[ 1] 。
温州民间用其根茎治疗白癜风 ,效果很好。黄酮是其主要成
分之一。超声波具有很强的穿透能力 , 能使固体物质在溶液
中有效地分散。鉴于此特点 ,我们首次运用超声波提取圆盖
阴石蕨中的总黄酮 ,并对其含量进行测定。经与回流提取进
行比较 , 发现运用超声波提取圆盖阴石蕨中的总黄酮 , 提取
时间短 ,收率高 , 结果令人满意。现报告如下。
1　仪器 、试剂和材料
1.1　仪器　UV-7502PC 紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器
有限公司出品), BS110S 电子天平(北京赛多利斯天平有限公
司生产), KQ-250DE 型医用数控超声波清洗器(昆山市超声
仪器有限公司出品), 回流装置。
1.2　试剂　芦丁(购自中国药品生物制品检定所), 无水乙
醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠均为分析纯(购自上海试剂
一厂)。
1.3　样品　圆盖阴石蕨于 2002 年 6 月采自浙江温州 , 由温
州师范学院生物与环境科学系陈贤兴高级实验师鉴定 , 经 60
℃烘干 、粉碎 , 备用。
2　方法和结果
2.1　最佳提取条件的选择　精密称取 5.0 g 圆盖阴石蕨根
茎 ,先加 100 ml石油醚 ,回流 1 h进行脱色脱脂处理 ,过滤 , 将
滤渣中石油醚挥发干。按 L9(34)正交设计表[ 2] 对提取的四
个因素和三个水平进行试验 ,并对超声提取和回流提取进行
比较。各因素和水平见表 1 ,分析结果见表 2。表 2 的分析结
果表明 ,影响超声波提取圆盖阴石蕨中总黄酮的主次因素为
收稿日期:2003-12-15
基金项目:浙江省教育委员会科研基金资助项目(1990481)。
作者简介:杨小凤(1965-),女 ,浙江平阳人 ,副教授。
A-B-D-C(因 R1>R2>R4>R3), 即乙醇浓度 , 提取时间 , 提取
次数 ,溶剂量。最佳的提取条件组合为 A2B1C1D1 , 即 70%乙
醇在 50 ℃下超声波提取 0.5 h , 提取体积 80 ml , 提取 1 次。
影响回流提取圆盖阴石蕨中总黄酮的主次因素为 A-C-B-D
(因 R1>R3>R2>R4), 即乙醇浓度 , 溶剂量 , 提取时间 , 提取
次数。最佳的提取条件组合为 A2B 1C1D3(据最大 K 值), 即
70%乙醇回流提取 2 h ,提取体积 80 ml ,提取 3 次。
2.2　供试品溶液的制备　精密称取 5.0 g 样品 , 先加 100 ml
石油醚 ,回流 1 h 进行脱色脱脂处理 , 过滤 , 将滤渣中石油醚
挥发干。按正交试验得到的最佳提取方案 , 即70%乙醇在50
℃下超声波提取 0.5 h ,提取体积 80 ml , 提取 1 次。过滤 , 用
70%乙醇定容至 100 ml容量瓶中 , 备用。
2.3　标准品溶液的制备　精密称取芦丁标准品 26.4mg 于
小烧杯中 ,加少量 70%乙醇 ,超声溶解后 , 定容至 100 ml容量
瓶中 ,摇匀 , 得芦丁标准溶液 ,浓度为 26.4 mg/100 ml。
2.4　测定波长的选择　分别精密量取芦丁标准溶液及供试
品溶液 0.5 ml于 10 ml刻度试管中 , 用水稀释至 4.0 ml ,各加
入 5%的亚硝酸钠溶液 0.4 ml , 摇匀 ,放置 6 min , 加 10%的硝
酸铝溶液 0.4 ml ,摇匀 , 放置 6 min 后 ,加 4%的氢氧化钠溶液
4 ml ,最后用水稀释至刻度 , 摇匀 , 放置 15 min。按波长扫描
的操作方法分别对芦丁标准品及供试品进行波长扫描 ,波长
范围为 200～ 760 nm。二者均在 500 nm 处有最大吸收峰 , 故
选择 500 nm 为测定波长。
2.5　标准曲线的制备　精密量取芦丁标准溶液 0.0 , 0.4 , 0.
8 , 1.2 , 1.6 , 2.0 , 2.4 , 3.0 ml分别置于 10 ml刻度试管中 ,均用
水稀释至 4.0 ml ,按 2.4 项操作 ,配制各溶液。以 0 号试剂空
白作参比 , 在 500 nm 处分别测定吸收值(A), 以吸收值 A 为
纵坐标 , 浓度 C 为横坐标绘制标准曲线 , 得回归方程 A=0.
1167C-0.0144 , r=0.9998(n=7)。结果表明芦丁含量在 1.
056～ 7.920 mg/ 100 ml范围内与吸收值线性关系良好。
2.6　稳定性试验　精密量取芦丁标准溶液2.0 ml , 其余操作
按 2.4 项操作 ,配制溶液 , 以试剂空白作参比 , 在500 nm处测
定吸收值(A), 按时间扫描的操作方法对时间进行扫描 ,结果
—480—
　
第 34 卷第 6期
2003年 12月
温　州　医　学　院　学　报　　
Journal of WenzhouMedical College 　　 　 　 　
Vol.34 No.6
Dec.2004
DOI :10.13771/j.cnki.33-1386/r.2004.06.032
表明在 5 min～ 4 h 内吸收值稳定。
2.7　样品测定　分别精密量取圆盖阴石蕨根茎供试品 0.5
ml , 叶子的供试品 0.2 ml各 5 份 , 按 2.4 项操作 , 配制各溶
液。以试样空白作参比 ,在 500 nm 处测定各吸收值 , 并计算
含量 ,结果见表 3。
2.8　回收率试验　分别精密量取圆盖阴石蕨根茎供试品 0.
2 ml , 叶子的供试品 0.1 ml各 5 份 , 分别加入 26.4 mg/ 100ml
芦丁标准 0.5 , 0.6 , 0.7 , 0.8 , 0.9 ml ,按 2.7 项操作 , 测定各吸
收值A , 得样品的平均回收率 , 根茎为 98.30%, 叶子为 98.
53%。结果见表 4。
表 1　考察的因素及水平
Tab.1　Factors and levels
因素 乙醇浓度(%) 提取时间(h)超声波 回流 溶剂量(ml) 提取次数(次)
水平 A B B C D
1 60 0.5 2 80 1
2 70 1.0 3 100 2
3 80 1.5 4 120 3
表 2　试验方案及分析结果
Tab.2　The plan and results of the test
序号 A B　　/ 　　B C D 吸光度
B　　/ 　　B
总黄酮含量(%)
B　　/ 　　B
1 1(60) 1(0.5) 1(2) 1(80) 1(1) 0.431 0.423 1.53 1.50
2 1(60) 2(1.0) 2(3) 2(100) 2(2) 0.387 0.345 1.38 1.23
3 1(60) 3(1.5) 3(4) 3(120) 3(3) 0.348 0.375 1.24 1.33
4 2(70) 1(0.5) 1(2) 2(100) 3(3) 0.441 0.430 1.56 1.52
5 2(70) 2(1.0) 2(3) 3(120) 1(1) 0.427 0.402 1.51 1.43
6 2(70) 3(1.5) 3(4) 1(80) 2(2) 0.410 0.418 1.45 1.48
7 3(80) 1(0.5) 1(2) 3(120) 2(2) 0.365 0.337 1.30 1.20
8 3(80) 2(1.0) 2(3) 1(80) 3(3) 0.334 0.355 1.19 1.27
9 3(80) 3(1.5) 3(4) 2(100) 1(1) 0.327 0.308 1.17 1.11
K1 4.15/ 4.06 4.39 / 4.22 4.17/ 4.25 4.21/ 4.04
K2 4.52/ 4.33 4.08/3.93 4.11/ 3.86 4.13/ 3.82
K3 3.66/ 3.58 3.86/3.92 4.05/ 3.96 3.99/ 4.12
K1 1.38/ 1.35 1.46/1.41 1.39/ 1.42 1.40/ 1.35
K2 1.51/ 1.48 1.36/1.31 1.37/ 1.29 1.37/ 1.27
K3 1.22/ 1.19 1.29/1.30 1.35/ 1.32 1.33/ 1.37
R 0.29/ 0.29 0.17/0.11 0.04/ 0.13 0.07/ 0.10
表 3　总黄酮含量的测定结果
Tab.3　Determined result of total flavone
序号 吸光度(A)根茎 叶子
总黄酮含量(%)
根茎 叶子
平均含量(%)
根茎 叶子
相对标准偏差(%)
根茎 叶子
1 0.468 0.385 1.65 3.42
2 0.471 0.388 1.66 3.45
3 0.466 0.382 1.65 3.40 1.65 3.42 0.68 0.70
4 0.462 0.386 1.63 3.43
5 0.467 0.381 1.65 3.39
3　讨论
　　黄酮类化合物是植物中非常重要的一类次生代谢产物 ,
是植物中广泛存在的一种有效成分 , 具有活血化淤 、保肝抗
炎 、抗菌 、抗病毒及泻下 、解痉的多种药理作用[ 3] 。因此 , 植
物中总黄酮的有效提取及含量测定 , 是了解其药理作用和合
理开发的重要基础工作。为此 , 我首次运用超声波技术 , 对
圆盖阴石蕨中总黄酮进行提取和测量 ,并与常规的回流提取
进行了比较。结果表明 ,超声波提取时间短 , 提取次数少 , 由
回流提取的 2 h 提取 3次缩短到 0.5 h 提取 1次 , 大大地提高
了效率。圆盖阴石蕨根茎中总黄酮的含量为 1.65 %, 平均回
收率为 98.30%, RSD=0.68 %(n=5), 圆盖阴石蕨叶子中总
黄酮的含量为 3.42 %, 平均回收率为 98.53 %, RSD=0.70
%(n=5)。本方法快速 、简便 、提取完全 、效率高 , 是总黄酮
提取和测量的理想方法之一 ,能应用于植物 、中药制剂及保
—481—
第 34卷 杨小凤 ,等:圆盖阴石蕨中总黄酮的超声波提取及含量测定 第 6 期
表 4　加样回收率(%)
Tab.4　The percent recovery of the samples
样品量(mg)
根茎 叶子 加入量(mg)
测得值(mg)
根茎 叶子
回收率(%)
根茎 叶子
平均回收率(%)
根茎 叶子
0.165 0.171 0.132 0.295 0.300 98.48 97.73
0.165 0.171 0.158 0.320 0.327 98.10 98.73
0.165 0.171 0.185 0.343 0.353 96.22 98.38 98.30 98.53
0.165 0.171 0.211 0.375 0.380 99.53 99.05
0.165 0.171 0.238 0.401 0.406 99.16 98.74
健品中总黄酮的提取和测量。
　　实验结果表明 ,叶子中总黄酮的含量高于根茎中总黄酮
的含量。而在温州民间 , 药用的部位是根茎 , 叶子往往被丢
弃 ,这点应引起重视 , 这对合理的利用和开发圆盖阴石蕨资
源具有参考意义。关于根茎和叶子的其他有效成分有待进
一步的研究。
参考文献:
[ 1] 　叶筱琴 ,杨小凤 ,黄可新 ,等.圆盖阴石蕨的化学成分研究[ J] .
温州医学院学报 , 2002 , 32(1):24-25.
[ 2] 　孙荣恒.应用数理统计[M] .北京:科学出版社 , 1998.218-227.
[ 3] 　张冬冬 ,王春艳, 解春华.薄层层析法测定黄花菜中黄酮成分
[ J] .中国卫生检验杂志, 2002 , 12(8):445.
[ 4] 　杜志坚 ,刘志勇 ,王莉 , 等.微波辅助提取荆芥根中总黄酮及含
量测定[ J] .食品与发酵工业, 2003 , 29(2):99-100.
[ 5] 　杜薇 ,刘国文.刺梨总黄酮的含量测定及资源利用[ J] .食品科
学 , 2003, 24(1):112-114.
(本文编辑:胡苗苗 ,毛文明)
技术与方法
恒低温冷冻切片方法的探讨
王群姬
(温州医学院第一附属医院 病理科 , 浙江 温州　325000)
[ 关键词] 　恒低温冷冻切片;固定;脱水;透明
[ 中图分类号] 　R446.8　　[ 文献标识码] 　B　　[ 文章编号] 　1000-2138(2004)06-0482-01
　　我科用 Leica CM 1800 型恒低温冷冻切片机进行切片 , 经
过长时间的摸索与试验 , 总结出了一套较完整的方法(2003
年我科用此法做了 1435 例冷冻切片), 现将方法介绍如下 ,
供同道参考。
1　临床资料
1.1　材料和设备　常规送检冷冻切片组织。二甲苯 、无水
乙醇 、95%酒精 、甲醇及苏木素 、伊红液。 Leica CM 1800 型恒
低温冷冻切片机。
1.2　方法:
1.2.1　恒低温冷冻切片机温度设定:一般调至-180 ℃左
右 ,根据组织性质不同 , 温度做适当调整(含脂肪成分较多的
组织则以-300 ～ -350 ℃为宜 , 乳房纤维腺瘤 、子宫肌瘤以
-200 ～ -220 ℃为宜 , 甲状腺组织以-160～ -170 ℃为宜)。
1.2.2　组织速冻时间:一般以 2 ～ 3 min 为宜 , 这样既可减少
冰晶 ,又可防止组织发硬发脆(固定组织金属头用后及时放
回切片机内备用)。
收稿日期:2004-01-12
作者简介:王群姬(1960-),女 ,浙江温州人 ,主管技师。
1.2.3　冷冻切片的固定与脱水:冷冻切片(4 ～ 5 μm)依次放
入二甲苯(10 s), 无水乙醇(10 s), 95%酒精(10 s), 甲醇 1
min , 最后行常规HE染色。
1.3　结果　冷冻切片细胞脱水 、透明良好 , 细胞核浆着色特
别鲜艳 ,完全可与石蜡切片相媲美。
2　讨论
　　各医院常规冰冻切片制作的根本区别仅为固定液的不
同 ,我们推荐的方法是增加了 3 道试剂即二甲苯 、无水乙醇
和95%酒精 ,其中二甲苯具有透明作用 , 且溶于无水乙醇 ,
95%酒精具有固定兼脱水作用 , 并对胞浆着色较好 , 而甲醇
固定对细胞核着色较好 ,所以此方法对恒低温冰冻切片的脱
水 、透明和着色均大有提高。特别是当新配制苏木素 、伊红
液使用一段时间后 , 染色效力下降时 , 用此方法仍能染出漂
亮的HE冷冻切片。 只要注意冰冻切片后立刻放入二甲苯
(10 s)、无水乙醇(10 s)和 95%酒精(10 s), 再入甲醇 1 min , 即
可行常规HE染色 , 操作简单方便 ,适用于各级医院病理科与
实验室。
(本文编辑:毛文明)
—482—
　
第 34 卷第 6期
2003年 12月
温　州　医　学　院　学　报　　
Journal of WenzhouMedical College 　　 　 　 　
Vol.34 No.6
Dec.2004