全 文 ：• 355 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2010年 3月第 25 卷第 3 期 CJTCMP , March 2010, Vol. 25, No. 3
·论著·
通讯作者：刘序森，贵阳医学院附属医院药剂科，邮编：550103，电话：0354-68320134，E-mail：wlsdermyy@163.com
半边旗中二萜类化合物5F诱导人胰腺癌细胞
凋亡机制的探讨
杨斌1，刘序森2，袁泉恒2
（1贵州省贵阳市第一人民医院，贵阳 550000；2贵阳医学院附属医院，贵阳 550103）
摘要：目的：观察研究半边旗中二萜类化合物5F(11a-羟基-15-氧-16-烯-贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺癌细
胞株AsPC-1凋亡的效果及其机制。方法：用脂质体转染法将P53E向凋亡之因子基因（PUMA）反义核酸（反义
PUMAcDNA）的真核表达载体pcDNA3.1-PUMAAS和空载体pcDNA3.1-导入AsPC-1细胞，G418筛选阳性细胞，获得
稳定转染的阳性克隆。将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度为8.875，
37.5，142μmol/L的5F中作用72h。RT-PCR和Western blotting检测不同组细胞经5F作用72h后的PUMA表达；MTT检
测细胞生长抑制,流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡，Hoechst 33258荧光染色法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的
dUTP缺口末端标记( TUNEL )法检测细胞的凋亡。结果：5F促进AsPC-1细胞凋亡，抑制细胞生长，并有明显的剂
量依赖性，在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调；当细胞转染PUMA反义核酸抑制PUMA表达后，受5F作用的
细胞出现PUMA蛋白表达明显降低，同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞的明显增殖。结论：5F促进体外AsPC-1细胞
凋亡，并抑制其生长，其诱导凋亡与上调PUMA有关。
关键词：胰腺癌；半边旗；二萜类；PUMA基因；凋亡
基金资助：卫生部科学研究基金(No.WKJ-2006-01-002)
Mechanisms of inhibition on human pancreatic cancer PC-3 cell line by a diterpenoid
compound 5 F isolated from Pteris semi pinnata L treatment
YANG Bin1, LIU Xu-sen2, YUAN Quan-heng2
(1The First People’s Hospital of Guiyang City, Guiyang 550000, China; 2The Affi lited Hospital of Guiyang Medical College,
Guiyang 550103, China)
Abstract: Objective: To investigate the effect of 5F on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer.
Methods: The pcDNA3.1-PUMAAS and pcDNA3.1 were transfected into AsPC-1 cells by Lipofectamine 2000 methods, stable
transfected clony was chosen through G418. AsPC-1 cells were divided into three groups: transfected pcDNA3.1-PUMAAS,
transfected pcDNA3.1 and control group without transfection AsPC-1 cells. Three groups was treated with serial concentrations
(8.875, 37.5, 142μmol/L, respectively) of 5F 10μL. MTT assay was used to observe the inhibitory actions of 5F on AsPC-1 cells.
The apoptotic rate of the cells was detected by fl ow cytometry. And the apoptosis was assessed by Hoechst 33258 dye staining and
TUNEL staining. The expression of PUMA protein was detected by Western blotting and RT-PCR. Results: The inhibitory action
on cell growth was seen in AsPC-1 control cells and pcDNA3.1- cells dealing with 5F．It could also promote the occurrence of
apoptosis. 5F inhibited the proliferation of AsPC-1 cells in a concentration-dependent manner. The apoptosis induced by 5F was
accompanied with the up-regulation of PUMA. In cells treated with 5F, the apoptosis rate decreased greatly and proliferation rate
increased compared with the AsPC-1 control cells and pcDNA3.1- cells dealing with 5F. The expression of PUMA was decreased
greatly comparing with pcDNA3.1- cells treated with 5F, Conclusion: 5F can depress the proliferation of AsPC-1 cell in vitro,
mainly through the induction of apoptosis, and it was a potential agent for pancreatic cancer chemotherapy, the mechanism was
probably related to its effect on the regulation of PUMA expression.
Key words: Pancreatic cancer; Pteris semi pinnata L; Diterpenoid; Apoptosis; PUMA
Fund assistance: Supported by Scientifi c Project Grant of Health Department(No.WKJ-2006-01-002)
半边旗(pteris semipinnata L.L，5F)，别名凤凰尾 巴草、半凤尾草、半边梳、甘草蕨等，是凤尾蕨科风
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尾蕨属植物，产于四川及长江以南各省区，具有疏解
风寒、化湿消肿、清热解毒的功效。近来研究发现，
半边旗有效成分有较强的抗肿瘤作用[1-3]。本文通过
5F诱导胰腺癌细胞的凋亡，观察5F对胰腺癌细胞的
生长抑制影响，探讨半边旗有效成分抗肿瘤的可能
机制。
材料与方法
1. 材料 pcDNA 3.1-PUMAAS和pcDNA 3.1-真
核表达载体由张克君博士赠送（青岛大学医学院附
属医院肝胆外科）；该载体含有592bp PUMA cDNA,
酶切位点位于BamH1和Xbal；5F（由广东医学院 张
萧博士赠送），细胞裂解试剂盒（Bio Vision 公司）；
硝酸纤维素膜（Amersham 公司）；蛋白质分子量标准
（中国科学院上海生物化学研究所）；抗人PUMA多
克隆抗体（Cell Signals公司）；Actin抗体(Santa Cruz)；
Lipofectamine™ 2000 ( Invitrogen)，噻唑蓝(MTT，
Sigma)，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡检
测试剂盒（美国Roche公司）, Hoechst 33258 (购自
Sigma,)；胰腺癌细胞株AsPC-1 (中国科学院上海细胞
研究所)，RPMI-1640培养基(Hyclon公司)，其他试剂
为国产分析纯。
2. 方法
2.1 细胞培养 胰腺癌细胞株AsPC-1购自中国
科学院上海细胞研究所，细胞用含10%胎牛血清的
RPMI 1640培养基培养，细胞培养条件为37℃恒温、
饱和湿度和5%CO2，指数生长的细胞为实验对象。
2 . 2 基 因转染及稳定表达细胞株的筛
选 AsPC-1细胞在含有10%小牛血清的DMEM培养
基中，37℃、5%CO2条件下培养。用0.25%的胰酶消
化细胞后，按每孔4×104个细胞均匀加入96孔板中，
培养至细胞85%-90%汇合后，分别转染PcDNA3.1-
PUMAAS和pcDNA 3.1-质粒，具体操作按照脂质体
转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行。转染24h后
将细胞以1∶10比例传代，次日开始用含有500μg/mL
G418的培养基进行筛选培养，每3天更换1次培养基,
连续筛选3周，然后将获得的细胞克隆，扩大培养。
2.3 MTT测定 收取指数生长期的AsPC-1细胞
以及稳定转染pcDNA 3.1-PUMAAS和pcDNA 3.1-质
粒的AsPC-1细胞, 0.25%胰蛋白酶消化后，用RPM
I-1640配成浓度为1×105/mL的细胞悬液, 于96孔培养
板每孔加100μL, 37℃, 5%CO2条件下孵育12h后，弃
上清，于96孔培养板中分别加无血清1640 10μL为空
白细胞对照。每孔分别加入10μL浓度分别为8.875、
37.5、142μmol/L浓度的5F，37℃，5% CO2条件下孵
育1h后，每孔补加90μL 10%1640，随后分别于72h
后每孔加MTT (5g/L)10μL，继续孵育4h后加入溶解
剂[10% SDS+1%HCl(1mol/L) ]100μL/孔，于37℃至次
日待甲臜结晶完全溶解后，在酶联免疫检测仪上测
OD570值。以OD540值为纵坐标，时间(h)为横坐标绘制
生长曲线。并按抑制率= (对照组OD值-实验组OD
值)/对照组OD 值的公式计算细胞生长抑制。实验重
复3次，结果用x-±s表示，同时以非5F治疗组对照。
2.4 流式细胞仪分析早期细胞凋亡率 分别收
取5F处理72h后的实验组和对照组的细胞，用pH7.4
的0.01mol/L PBS洗涤后，体积分数为70%冰乙醇4℃
固定24h后，用流式细胞仪检测亚G1期出现凋亡峰
(Ap 峰)的细胞凋亡率。
2.5 Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡　
接种细胞于6孔板中，每孔细胞约5×105个，待细胞生
长至适当密度时, 1×PBS充分冲洗3次后，加入冰预
冷的甲醇500μL/L，于冰上放置10min，再以1×PBS
充分冲洗至少3次，1μmol/L Hoechst33258室温染色
10 min, 1×PBS充分冲洗3-5次。荧光显微镜可检测
到呈蓝色的细胞核，凋亡小体颜色加深呈深蓝色或
形状不规则。
2.6 Western blot检测PUMA蛋白 提取细胞总
蛋白进行Western Blot检测：SDS-PAGE分离胶浓度为
12，积层胶浓度为5%，上样量为15μg/L；SDS电泳：
恒流，每块板20-40mA，电泳时间约2h；转膜：恒流，
每张膜42mA，时间：3.5 h。
2.7 RT-PCR 检测 按TRizol试剂盒( Invitrogen
公司)说明书操作提取药物作用72h的不同组细胞总
RNA,取1μg RNA模按RT试剂盒(Takara公司)说明
书反转录得到cDNA。引物序列PUMA：R：5’-AGT
CTG GGG AGA CAT GGG CTG G-3’F：5’-CAG
CCA TCC AGC ACT GCC ATT C-3’（324bp）, G3PDH
（500bp）R:5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’
F：5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’反应条件：
50℃ 30min，94℃ 2min, 94℃ 30s, 55℃ 30s，72℃ 1min,
72℃延伸7min，28循环。以上引物由赛百盛公司合成。
取5μL反应产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，
用SYNGENE型凝胶成像系统照像，以目的基因条带
和内参G3PDH条带扫描峰下面积之比作为目的基因
的相对表达量。试验重复3次，数据以x-±s表示。
2.8 统计学方法 采用SPSS 10.0软件进行χ2分
析，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1. MTT检测 浓度分别为8.875、37.5、142μmol/L
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的5F 10μL作用AsPC-1细胞72h：对照组，pcDNA
3.1-和pcDNA 3.1-PUMAAS组细胞的生长抑制率分
别为(8.79±2.04)，(18.72±4.56)，(29.67±5.17)、(9.53
±2.23)，(19.35±4.81)，(30.84±5.63)和(1.28±0.21)，
(1.34.±0.21)，(1.42±0.25)，(1.66±0.28)。pcDNA3.1-
PUMAAS组明显低于对照组和pcDNA 3.1组，差异分
别有统计学意义（P<0.05）。
5F抑制对照组、pcDNA 3.1-空载体组细胞增殖，
而转染pcDNA 3.1-PUMAAS后的细胞生长不受影
响，说明PUMA表达抑制后抑制5F引起的细胞生长。
2. 流式细胞仪检测 递增浓度的5F作用对照
组AsPC-1细胞72h后，细胞凋亡率逐渐增加，浓度
为8.875μmol/L时，凋亡率为(3.92±1.56)，而浓度为
142μmol/L时，凋亡率为(27.82±1.42)，5F有明显的促
凋亡效应，并与浓度有明显的依赖性; pcDNA3.1组
细胞凋亡率在浓度为8.875μmol/L时为(4.20±1.46)，
而浓度为142μmol/L时，凋亡率为(25.44±1.37)，两组
相比差异无显著性(P>0.05); pcDNA 3.1-PUMAAS组
AsPC-1细胞受到8.875、37.5、142μmol/L 5F作用后，
细胞凋亡率分别为(0.92±0.73)，(1.38±0.48)，(1.73±
0.45)，与对照组和pcDNA3.1-空载体组比，差异分
别有统计学意义（P<0.01），与正常AsPC-1的凋亡率
(0.69±0.43)比差异无显著性（P>0.05），说明PUMA
表达抑制后抑制5F引起的细胞凋亡。
3. TUNEL检测 5F作用对照组AsPC-1细胞
72h后，玻片均可检测到凋亡细胞，随着浓度的增
加，凋亡逐渐明显。这些TUNEL阳性细胞呈现了凋
亡的多态性特征，部分凋亡细胞核出现浓缩断裂。
142μmol/L的5F作用72h后凋亡指数分别为(10.74
±2.30)，而pcDNA 3.1-PUMAAS组AsPC-1细胞在
142μmol/L的5F作用72h后，凋亡指数分别为(1.20±
0.93)，两组相比有显著性差异(P<0.01），提示5F能诱
导细胞凋亡，pcDNA 3.1-PUMAAS转染抑制5F引起
的细胞凋亡。
4. Hoechst33258染色检测细胞凋亡程度 正
常细胞核形态正常，而经5F作用的AsPC-1细胞，用
Hoechst 33258染色后显示，细胞皱缩，体积变小，核
固缩，核染色质浓缩，凋亡小体，表面起泡，表明5F
能够诱导AsPC-1细胞凋亡，而pcDNA 3.1-PUMAAS组
AsPC-1细胞在5F作用下凋亡表现不明显。
5. 5F对PUMA蛋白和PUMA mRNA表达的影响
AsPC-1细胞给于浓度分别为8.87，37.5，142μmol/L
的5F 10μL作用72h后，PUMA蛋白和PUMA mRNA
表达逐渐增加,在142μmol/L时表达量达到高峰。当
AsPC-1转染pcDNA 3.1-PUMAAS 抑制PUMA表达后，
5F诱导PUMA表达的作用消失。
讨论
PUMA是新近发现的Bcl-2家族BH-3亚家族中的
成员，是p53的主要靶基因，可被内外源野生型p53快
速诱导。PUMA通过其下游bax/bak及Bcl-2/Bcl-Xl相
互作用，引起bax活化、细胞色素C释放及caspase级联
效应，导致细胞凋亡[4-5]。
Nakano等[5]证实转染外源性PUMA基因可诱导
细胞的快速凋亡和抑制集落形成，此外，转染外源性
PUMA基因还可增强细胞对化疗的敏感性。Reimerta
等[6]还发现，PUMA在线粒体应激诱导的凋亡中也是
必须的。许多抗癌药物引起肿瘤细胞凋亡与细胞中
PUMA活化有关，例如，在给予抗癌药物5F、DNA损
伤剂阿霉素作用结肠癌细胞后，细胞中PUMA转录本
明显增高的同时可快速出现细胞凋亡[7]。
从半边旗中分离提取的5F有很强的肿瘤细胞杀
伤作用[1-3]。笔者研究了5F对胰腺癌细胞增殖和凋亡
的影响发现，5F明显促进细胞凋亡，抑制细胞生长，
并呈剂量依赖性，但5F诱导肿瘤细胞凋亡的机制和
途径目前尚未完全明了。
在本实验中，笔者试图研究了5F作用与基因表
达和凋亡的关系，结果发现，PUMA表达随药物浓度
的增加而升高，同时伴有细胞凋亡的进行性升高，当
PUMA表达抑制后，5F诱导PUMA的现象消失，细胞
凋亡水平也明显下降，细胞生长不受到抑制，说明5F
通过诱导PUMA表达而促进细胞凋亡。
笔者的研究提示，5F的促胰腺癌凋亡作用与5F
上调PUMA表达有关，该实验为今后PUMA基因转染
联合5F治疗实体瘤提供理论依据。
参 考 文 献
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巢癌细胞HO-8910PM侵袭转移的影响.中国药理学通
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J Cell Biol,2003,162(4):587-597
[7] 张克君,李德春,赵志娥.PUMA与c-myc在吉西他滨诱导CaPan-1
细胞凋亡中的作用.苏州大学学报(医学版),2007,27(6) :848-851
Zhang Ke-jun,Li De-chen,Zhao Zhi-e.Effect of PUMA,c-myc in
Gemcitabine-induced Apoptosis of Human Pancreatic Cancer Cell
Lines.Suzhou University Journal of medical science,2007,27(6):
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(收稿日期：2009年4月10日)
·论著·
维金康口服液对尘肺引起肺纤维化大鼠模型
干预的初步研究
高天旭1，韦大文1，徐江雁1，赵玉瑶2，杜磊3
（1河南中医学院，郑州 450008；2河南省中医研究院，郑州 450000；3河南中医学院第一附属医院，
郑州 450008）
摘要：目的：观察维金康口服液对尘肺引起的硅结节和肺弥漫性纤维化病变大鼠模型进行干预的结果。方
法：45只大鼠，随机分为空白组、染尘组及染尘治疗组。空白组在正常环境中喂养；染尘组染尘同时，喂养一般
饲料；染尘治疗组用30％维金康浓缩液1.0mL/100g，每日2次灌胃(人用量的33倍)。各组分别于实验第15、30、90
天，分批处死5只大鼠，后解剖。结果：病理检测显示：染尘组第90d时表面有块状软骨样病变向肺表面突起。染
尘治疗组、空白组两组大鼠肺部无异常发现。染尘治疗组体质量增长大于染尘组，鲜肺质量、干肺质量均小于染
尘组。结论：维金康口服液对尘肺引起的硅结节和肺弥漫性纤维化有一定的治疗作用。
关键词：尘肺；肺纤维化；维金康口服液
基金资助：“十一五” 国家科技支撑计划(No.2007BAI10B01-055)
Experimental study on effect of Weijinkang Oral Liquid on rats’ models with pulmonary
fi brosis caused by pneumonoconiosis
GAO Tian-xu1,WEI Da-wen1,XU Jiang-yan1,ZHAO Yu-yao2,DU Lei3
(1Henan University of TCM, Zhengzhou 450008, China;2Henan Province Chinese Medicine Research Institute,Zhengzhou
450000,China;3No.1 Affi liated Hospital of Henan College of TCM,Zhengzhou 450008,China)
Abstract: Objective: To observe the effect of Weijinkang Oral Liquid on rats’ models with siliconic nodules and the
diffuse fi brosis of the lungs. Methods: 45 rats were randomly divided into the blank group, dust-affected group, and treatment
group. The rats in the blank group were fed in normal environment. The rats in the dust-affected group were given regular feed.
The dust-affected rats in the treatment group were administrated 1.0mL/100g of Weijinkang condensed liquid in 30% by stomach
perfusion, two times daily (33 times of human’s dosage). Five of each group were killed and anatomized in turn on the 15th day,
the 30th and the 90th day. Results: On the 90th day the pathological test showed massive cartilaginous changes projecting to the
pulmonary surface in the dust-affected group. There was no abnormality of lungs in both treatment group and blank group. After
receiving Weijinkang Oral Liquid the rats in the treatment group showed greater weights than those in the dust-affected group, and
the weights of fresh and dehydrated lungs were lighter than those in dust-affected group. Conclusion: Weijinkang Oral Liquid had
certain effect on siliconic nodules and the diffuse fi brosis of the lungs caused by pneumonoconiosis.
Key words: Pneumonoconiosis; Pulmonary fi brosis; Weijinkang Oral Liquid
Fund assistance:‘Eleventh Five-Year’National Science and Technology Support Program (No.2007BAI10B01-055)
通讯作者：韦大文，河南郑州市金水路1号河南中医学院，邮编：450008，电话：0371-65962977，E-mail：wdw5962977@yahoo.com.cn