全 文 ：[成分分析 ]
半边旗中二萜类化合物 5F葡糖糖苷的分离鉴定及其抗肿瘤作用
龚先玲 1 , 　陈志红 2 , 　梁念慈1＊ , 　邓亦峰 1 , 　GeorgeG· Chen3
(1.广东医学院 天然药物研究与开发重点实验室 , 广东 湛江 524023;2.广东医学院 分析中心 , 广东 湛江
524023;3.香港中文大学外科系 , 香港)
收稿日期:2009-01-25
基金项目:国家自然科学基金(3987099),粤港科技合作基金项目(GHP/022/06),湛江市科技计划项目(2008C10002)
作者简介:龚先玲(1975-),女 ,硕士 ,讲师 ,主要从事天然药物化学的教学与研究工作。 E-mail:xlgong@ 163.com
＊通讯作者:梁念慈 ,教授 ,博士生导师。Tel:(0759)2388501
关键词:半边旗;抗肿瘤成分;二帖化合物;成分分析
摘要:目的:进一步研究半边旗的抗肿瘤活性成分。方法:运用反复硅胶柱层析的方法对半边旗中的化学成分进行分离
纯化 , 以 LC-MS及各种有机波谱法鉴定化学单体结构;并通过 MTT法对分离鉴定的单体化合物及其苷元进行抗肿瘤活
性研究。结果:从中分离鉴定 1个二萜苷类化合物 , 为 11β -hydroxy-15-oxo-ent-kaur-16-en-19-oicacid19-β-D-glucoside
(Ⅰ );化合物Ⅰ及其苷元 5F均可抑制两种肿瘤细胞 A549和 CNE-2Z的生长 ,且它们对两种肿瘤细胞的抑制作用呈一定
剂量依赖关系和时间依赖关系 ,化合物 5F的活性强于化合物 Ⅰ 。结论:α, β 不饱和环戊酮结构是其活性部位 , 5F中 19
位碳上的羧基与糖连接形成酯苷 ,成为化合物Ⅰ后 , 其抗肿瘤活性大大降低。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2010)02-0257-04
Isolationandidentificationofglycosideofcompound5FfromPterissemipinnata
L.andtheirantitumoractivity
GONGXian-ling1 , 　CHENZhi-hong2 , 　LIANGNian-ci1＊ , 　DENGYi-feng1 , 　GeorgeG·Chen3
(1.GuangdongKeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs, GuangdongMedicalColege, Zhanjiang524023 , China;2.AnalysisCen-
ter, GuangdongMedicalColege, Zhanjiang524023 , China;3.DepartmentofSurgery, PrinceofWalesHospital, TheChineseUniversityofHongKong,
Shatin, N.T., HongKong, China)
KEYWORDS:PterissemipinnataL;antitumorconstituents;glycosideofcompound;analysis
ABSTRACT:AIM:TofurtherstudytheantitumorconstituentsofPterissemipinnataL.METHODS:Compounds
wereisolatedbyconsecutivesilicagelcolumnchromatography.Theirstructureswereelucidatedbyspectroscopic
methods.TumorcytotoxicityofthecompoundswasscreenedbyusingstandardMTTmethod.RESULTS:One
compoundwasisolatedfromPterissemipinnataL., anditsstructurewasidentifiedas11β -hydroxy-15-oxo-ent-kaur-
16-en-19-oicacid19-β-D-glucoside(Ⅰ).CompoundⅠ anditsaglycone5Fshowedtohaveinhibitoryactiona-
gainsttwocancercellinesA549 andCNE-2Zandshowedthedose-responserelation.Buttheantitumoractivityof
compound5FwasstrongerthanthatofcompoundⅠ .CONCLUSION:Theantitumoractivesiteinthestuctureis
α, β -methylenecyclopentanonemoiety.Nineteenpositioncarboxylicgroupin5Fhastobeuncombinedwithsugar
residuetoformesterlinkage(compoundⅠ )otherwiseantitumouractivityislost.
　　半边旗 PterissemipinnataL.为凤尾蕨科凤尾蕨
属植物 ,广泛分布于长江以南和四川等地 [ 1] ,味苦 、
辛 ,性凉 ,具有清热 、解毒 、消肿等功效 [ 2] ,已被批准
为广东省地方习用药材标准品种 [粤药管注 [ 2006]
031号 ] 。目前认为其抗肿瘤有效成分为 5F、6F、A
等具有 α, β不饱和环戊酮结构的对映贝壳杉烷类
二萜化合物[ 3-5] ,这些药效成分主要集中在醋酸乙酯
部位 。我们课题组研究发现:半边旗的正丁醇部位
具有体外抗肿瘤作用(另文发表)。为了阐明该部
位抗肿瘤的物质基础 ,本实验对半边旗正丁醇部位
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的化学成分进行了研究 ,分离出 1个二萜苷 ,根据其
理化性质和波谱数据分别鉴定为:11β -hydroxy-15-
oxo-ent-kaur-16-en-19-oic acid 19-β-D-glucoside
(Ⅰ);并对化合物 Ⅰ及其苷元(11β-hydroxy-15-oxo-
ent-kaur-16-en-19-oicacid,称 5F)进行体外抗肿瘤
活性测试 ,根据实验结果探讨其构效关系与抗肿瘤
活性之间的规律 ,为今后新型药物的研发提供参考 。
1　仪器与材料
DSQ电子轰击电离质谱仪(美国 Thermo),瑞士
Bruker公司 AVANCEAV400 M超导核磁共振谱仪
(TMS为内标),傅立叶变换红外光谱测定仪 (Bio-
Rad公司), UV-3101PC紫外光谱测定仪(日本岛
津),岛津 LC-MS8000α型高效液相色谱 -质谱联用
仪(日本岛津), NAPCOseries5400 CO2培养箱 , Elx-
800酶标仪(Bio-TEK-INSTUMENTSINC产品)。
色谱用试剂(天津四友精细化学品有限公司),
其余试剂均为分析纯 。柱色谱用硅胶 (200 ～ 300
目),薄层色谱用硅胶 HF254(60型 ,青岛海洋化工厂
分厂)。半边旗药材采于广州市郊 ,经广东医学院
苟占平博士鉴定为半边旗(PterissemipinnataL),标
本保存于广东医学院天然药物研究与开发重点实验
室 。人肺癌细胞 A549和人鼻咽癌细胞 CNE-2Z由
本实验室传代 。 5F对照品(11β-hydroxy-15-oxo-ent-
kaur-16-en-19-oicacid,自制 , LC-MS检测纯度大于
98%), 5-氟尿嘧啶(5-Fu)、胰蛋白酶 、甲基噻唑蓝
(MTT,美国 Sigma公司),小牛血清(杭州四季青生
物材料有限公司 ), RPMI-1640培养基 (Gibco公
司)。
2　提取与分离
干燥的半边旗药材(地上部分)3.5kg,粉碎 ,甲
醇浸泡 2 h,加热回流提取 ,过滤 ,减压浓缩得稠浸
膏 ,加水混悬 ,依次用石油醚(60 ～ 90 ℃)、醋酸乙酯
和正丁醇萃取。正丁醇萃取物 50 g用硅胶拌样 ,经
图 1　化合物Ⅰ及其苷元 5F的化学结构式
反复硅胶柱层析 ,氯仿和甲醇的混合液洗脱 ,甲醇结
晶 ,得到化合物 Ⅰ 。
3　结构鉴定
化合物 Ⅰ:白色针状结晶(MeOH)。 Molish反
应呈阳性 ,证明该化合物连有糖基 。 EI-MS显示分
子离子峰 m/z494 [ M] +, 结合 13 C-NMR(DEPT)
和 1H-NMR数据推定其分子式为 C26H38O9。13C-NMR
(DEPT)显示有 26个碳信号 ,包括 2个甲基 , 9个亚
甲基 , 9个次甲基 , 6个季碳 ,初步推定化合物 Ⅰ为一
个二萜苷类化合物。 IR光谱在 3 427 cm-1处有强
而宽的吸收显示有羟基 。IR光谱在 1 718和 1 645
cm-1的特征吸收峰 , UV光谱在 242 nm处有最大吸
收峰 , 13C-NMR谱中 δ110.44、δ150.79和 δ208.18
的化学位移 ,进一步说明该化合物有五元环酮 ,环外
有共轭双键 ,符合对映-贝壳杉烷类化合物具有与环
外 α-亚甲基共轭的五元环酮的 D环结构特点。 EI-
MSm/z494 [ M] +, 332 [ M-162] + ,显示该化合物
有 1个葡萄糖;13C-NMR图谱含有一个端基碳信号
(δ94.11),也提示该化合物含有 1个糖基 。对该化
合物进行酸水解 ,中和至中性 ,氯仿萃取 ,氯仿萃取
部分与标准品 5F共薄层检测 ,在相同位置显相同的
斑点;同时对萃取物与 5F分别进行 HPLC-MS检测 ,
二者出峰时间一致 ,分子量也一致 ,说明化合物Ⅰ的
苷 元 为 11β-hydroxy-15-oxo-ent-kaur-16-en-19-oic
acid。对该化合物酸水解后的水相与标准品葡萄糖
共薄层 ,在相同位置显相同的斑点 ,说明糖基为葡萄
糖。根据糖的端基氢的偶合常数 δH5.28(1H, d, J
=8.1 Hz),可推断糖的连接方式为 β -D-葡萄糖。
19位羧基碳的化学位移一般约 180ppm[ 6] ,而该化
合物 19位碳的化学位移为 175.51 ppm,向高场位
移了约 4 ppm, 说明该化合物在 19位与糖成酯
苷。1H-NMR(DMSO-d6 , 400 MHz)δ:0.86(3H, s, H-
18), 1.17(3H, s, H-20), 2.08(1H, broadd, J=
12.6, H-5), 2.95(1H, broads, H-9), 5.14(1H, s, H-
17a), 5.28(1H, d, J=8.1, H-1 ), 5.51(1H, s, H-
17b);13 C-NMR(DMSO-d6 , 400 MHz)δ:208.1(C-
15), 175.5(C-19), 150.8(C-16), 110.4(C-17),
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94.1(C-1 ), 77.6(C-3 ), 76.9(C-5 ), 72.5(C-
2 ), 69.5(C-4 ), 64.0(C-11), 61.7(C-9), 60.6
(C-6 ), 55.9(C-5), 49.8(C-8), 43.2(C-4),
40.3(C-12), 39.1(C-1), 38.3(C-10), 37.3(C-3),
36.5(C-13), 36.1(C-7), 33.9(C-14), 28.0(C-18),
19.4(C-6), 18.4(C-2), 15.1(C-20)。根据以上数
据 ,结合文献 [ 7, 8] ,确定该化合物的为 11β -hydroxy-
15-oxo-ent-kaur-16-en-19-oicacid19-β -D-glucoside。
4　半边旗中二萜苷 11β-hydroxy-15-oxo-ent-kaur-
16-en-19-oicacid19-β-D-glucoside及其苷元 5F体
外抗肿瘤实验
取对数生长期的人肺癌细胞 A549和人鼻咽癌
细胞 CNE-2Z, 用 0.25%的胰蛋白酶消化 ,含 10%
新生小牛血清的 RPMI-1640培养液调制成 4 ×104
个 /mL的细胞悬液 , 接种于 96孔板中 , 每孔接种
100μL。在 37℃、5%CO2条件下培养过夜后 ,吸出
培养液 ,加入新鲜培养液 180μL及药液 20 μL。待
测样品用 DMSO溶解 (DMSO终体积分数 ≤
0.1%),化合物终浓度分别为 6.25、 12.5、 25、50、
100μmol/L,每个浓度平行 8孔 ,同时设置空白对照
组和 5-Fu的阳性对照组 ,空白对照组每孔加入 20
μL的 RPMI-1640培养液 ,阳性对照组则加入浓度为
20 μg/mL的 5-Fu20 μL。分别培养培养 24、48、72
h后 ,每孔加入 5 mg/mL的 MTT20 μL, 37 ℃ 5%
CO2条件下温育 4 h～ 6 h,弃去上清液 ,每孔加入
100μLDMSO,在微型振荡器上摇匀 15min,结晶溶
解后 ,立即比色 ,在酶标仪主波长为 570nm,参比波
长为 630 nm处测量 OD值 ,比色以空白孔调零 。抑
制率 =(1-实验组 OD值平均值 /对照组 OD值平
均值)×100%。
半边 旗中 11β -hydroxy-15-oxo-ent-kaur-16-en-
19-oicacid19-β -D-glucoside及其苷元 5F体外抗肿
瘤实验结果见表 1。从表 1可以看出:化合物 Ⅰ
(11β -hydroxy-15-oxo-ent-kaur-16-en-19-oicacid19-
β -D-glucoside)和 5F(11β -hydroxy-15-oxo-ent-kaur-
16-en-19-oicacid)均可抑制两种肿瘤细胞 A549和
CNE-2Z的生长。且 5F对两种肿瘤细胞的抑制作
用呈明显的剂量依赖关系和时间依赖关系 ,而化合
物 Ⅰ对两种肿瘤细胞的抑制作用有一定的剂量依赖
关系和时间依赖关系 ,相同浓度的化合物 5F对两种
肿瘤细胞生长的抑制率明显高于化合物Ⅰ 。根据本
课题组以前的研究报道[ 3-5] , 4F(11β -hydroxy-15-oxo-
ent-kauran-19-oicacid)对多种肿瘤细胞均无抑制作
用 。
表 1　 半边旗中两种化合物对 A549和
CNE-2Z细胞增值的抑制作用
受试
样品
试药浓度
/(μmol/L)
A549细胞增殖
抑制率 /%
CNE-2Z细胞增殖
抑制率 /%
24h 48h 72h 24h 48h 72h
化合物Ⅰ 6.25 2.99 3.78 4.23 0.79 5.42 7.94
12.5 3.85 5.13 8.01 2.34 9.03 9.66
25 4.27 6.89 10.16 3.68 11.51 13.73
50 6.84 9.34 11.28 4.21 11.96 15.88
100 7.61 10.46 14.39 5.26 15.12 17.53
5F 6.25 3.25 4.75 5.05 13.52 16.25 10.08
12.5 4.27 10.38 12.73 16.52 33.63 39.40
25 12.39 18.69 37.37 17.60 47.40 68.42
50 23.50 35.64 53.94 30.04 51.24 73.98
100 35.04 55.02 70.91 46.78 67.49 84.36
5-Fu 20μg/mL 8.55 42.21 65.45 19.96 39.05 64.06
5　讨论
从上述结果可知:半边旗中的这三个化合物对
肿瘤细胞的作用各不相同 。分析三个化合物的结
构 , 4F是对映贝壳杉烷二萜化合物 ,对肿瘤细胞无
抑制作用 ,分子中缺乏 α, β -亚甲基环戊酮结构。而
化合物 Ⅰ 、5F都是含有 α, β-亚甲基环戊酮结构的
对映贝壳杉烷二萜化合物 ,它们均显示一定不同强
度的细胞毒作用。据文献[ 9]报道 ,含有 α, β -亚甲基
环戊酮结构的化合物 ,具有较高的反应活性 ,可经
Michael加成反应 , 与含巯基的酶结合而导致酶失
活 ,从而显示这类化合物的抗肿瘤活性。化合物 Ⅰ
与化合物 5F的构效关系表明环外双键的存在对其
抗肿瘤活性的重要性。另据文献 [ 10]报道 ,由于生物
大分子体积庞大 ,这些部分共轭五元环上的双键必
须暴露在分子的外侧 ,才能有效地接触到生物大分
子表面的某些化学基团而夺取它或与它结合。 5F
是化合物 Ⅰ的苷元 , 5F中 19碳上的羧基与糖连接
形成酯苷 ,成为化合物 Ⅰ后 ,其抗肿瘤活性大大降
低。这表明化合物 Ⅰ的抗肿瘤活性不仅与是否含有
α, β-亚甲基环戊酮结构有关 ,而且与是否连有糖基
有关 ,糖基的存在影响抗肿瘤活性的强度。
有关 α, β -亚甲基环戊酮对映贝壳杉烷二萜化
合物对肿瘤细胞的作用 ,研究报道很多 [ 11, 12] ,但几
乎集中在这类化合物的苷元对肿瘤细胞的作用。本
文首次从国产半边旗中分离出 5F葡萄糖苷(化合
物Ⅰ ),并报道了此苷对肿瘤细胞的作用 ,同时探讨
了其构效关系与抗肿瘤活性之间的规律 。
致谢:中山大学测试中心 、广东医学院分析中心
测定波谱数据 。
参考文献:
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四物汤中阿魏酸对兔血指标的相关联系
王玉华 1 , 　容　蓉 2 , 　魏英勤3 , 　袁　浩 2
(1.内蒙古医学院药学院 , 内蒙古 呼和浩特 010110;2.山东中医药大学 , 山东 济南 250355;3.山东轻工
学院 , 山东 济南 250353)
收稿日期:2008-12-24
基金项目:山东省卫生厅资助课题(2001-16号)
作者简介:王玉华(1959-),女 ,教授 ,博士 ,研究方向:中蒙药方剂及其药材药效物质基础与其质量控制的研究。 Tel:(0471)6653151 E-
mail:yuhuawang59@ 163.com
＊通讯作者:容　蓉(1970-),女 ,博士 ,中药及复方活性成分及质量控制研究。 Tel:(0531)89628593E-mail:r.rong@sdutcm.edu.cn
关键词:四物汤;阿魏酸;血清药化学;有效成分
摘要:目的:测定家兔血中来自四物汤(当归 、川芎 、白芍 、熟地黄)的阿魏酸水平以及相应的血液指标。方法:用 HPLC法
测定服药后兔血中阿魏酸并测定兔血指标。结果:服药周期中 , 兔血中的白细胞 、红细胞 、血红蛋白 、铁 、锌和铜水平均有
显著提高 , 降低了红细胞压积和全血低切黏度。结论:四物汤中的阿魏酸可能是四物汤补血活血的有效成分之一。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2010)02-0260-05
EffectofferulicacidinSiwuDecoctiononrabbit sbloodpicture
WANGYu-hua1 , 　RONGRong2＊ , 　WEIYing-qin3 , 　YUANHao2
(1.DepartmentofPharmaceuticalAnalysis, SchoolofPharmacy, InnerMongoliaMedicalColege, Huhhot010110 , China;2.KeyLabofNaturalProd-
ucts, ShandongUniversityofTCM, Jinan250355 , China;3.SchoolofChemicalEngineering, ShandongInstituteofLightIndustry, Jinan250353, Chi-
na)
KEYWORDS:SiwuDecoction;ferulicacid;serumpharmacochemistry;activeingredients
ABSTRACT:AIM:ToassaythelevelofferulicacidinrabbittakingSiwuDecoction(Radixangelicaesinensis,
Rhlzomachuanxiong, Radixrehmanniaepraeparata)andtheinfluenceresultofthebloodpicture.METHODS:
ThelevelofferulicacidinrabbitbloodwasmeasuredwithHPLCaftermedicationandthebloodexaminationwas
carriedout.RESULTS:Duringtheperiodofmedication, thelevelsofredandwhitebloodcels, hemoglobin, Fe,
ZnandCuincreased, packedcelvolumeandwholebloodlow-shearviscositydecreased.CONCLUSION:Ferulic
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