全 文 ：Doi:10． 13621 / j． 1001 － 5949． 2016． 02． 0100 ·论 著·
瑞香狼毒对癫痫大鼠认知功能及
海马神经细胞增殖的影响
张义伟1，马全瑞1，刘印明1，丁银秀1，张 姣1，刘 娟1，2
［摘要］ 目的 探讨狼毒提取物对癫痫大鼠认知及海马神经发生的影响。方法 选择健康 7 周龄雄性 SD大
鼠，随机分成空白对照组、模型组、高中低剂量实验组、阳性对照组。除空白对照组外，余组腹腔注射氯化锂 －匹罗
卡品制备动物癫痫模型。高中低剂量实验组腹腔注射氯化锂 －匹罗卡品前给予 25、50、100 mg的狼毒提取物灌服
2 周，空白对照组、模型组给予生理盐水，阳性对照组给予苯妥英钠。利用 Morris水迷宫实验观察认知功能;用溴脱
氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后免疫荧光染色，观察大鼠海马齿状回颗粒细胞层 BrdU阳性细胞的增殖情况;以 West-
ern － blot技术检测狼毒作用后海马齿状回神经细胞 NＲ1 的表达。结果 水迷宫结果显示，模型组较狼毒高剂量组
潜伏期延长(P ＜ 0． 05);模型组的 BrdU阳性细胞多于对照组(P ＜ 0． 05) ，且多于狼毒高剂量组和阳性对照组(P ＜
0． 05)。各实验组海马齿状回中神经 NＲ1 细胞表达差异无统计学意义(P ＞ 0． 05)。结论 狼毒能改善大鼠的认知
功能，且狼毒可干预大鼠癫痫发作后海马齿状回颗粒层 BrdU阳性细胞数的异常增生。
［关键词］ 癫痫;狼毒;BrdU;海马齿状回;大鼠
［中图分类号］ Ｒ961 ［文献标识码］ A
Proliferation effects of Stellera Chamaejasme Linn． on cognitive function and hippocampal neural cells in epileptic rats
ZHANG Yiwei1，MA Quanrui1，LIU Yinming1，DING Yinxiu1，ZHANG Jiao1，LIU Juan1，2 ． 1． Department of Human Anatomy and Em-
bryology，Basic Medicine College of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China;2． Ningxia Key Laboratory of Cerebrocranial Dis-
eases，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China
Corresponding author:LIU Juan，Email:zhangyiwei0802@ 163． com
［Abstract］ Objective To investigate the effects of Stellera Chamaejasme Linn．(SC)on the change of cognitive function and
the proliferation of hippocampal neurons in epileptic rats．Methods Male SD rats(7 weeks)were randomly divided into six groups． Ve-
hicle(blank group and model group)，phenytoin sodium(positive group)and SC(25，50 and 100 mg /kg)were administered via oral ga-
vage． Two weeks after via gavage of test samples，and intraperitoneal injection of lithium － pilocarpine was performed to induce epileptic
model in the rats except blank group． After the treatment，the cognitive function was evaluated by Morris water － daze test． The prolifera-
tion of neural cells and expression of main proteins in the hippocampal dentate gyrus granular layer were tested by 5 － bromodeoxyuridine
(BrdU)labeling and western － blot test，respectively． Ｒesults Comparing to model group the escape latency was shortened by SC
(100 mg /kg)groups when In Morris water － daze test(P ＜ 0． 05)． The BrdU positive cells in blank group，positive group and SC
(100 mg /kg)groups were significantly less than those in control groups(P ＜ 0． 05)． There were no significant differences in the expres-
sion of main proteins of neural cells in the hippocampal dentate gyrus compared with model group． Conclusion Stellera Chamaejasme
Linn． has antiepileptic effect through improving cognitive function and inhibiting the proliferation of BrdU positive cells．
［Key words］ Epilepsy;Stellera chamaejasme linn;Bromodeoxyuridine;Hippocampal dentate gyrus;Ｒat
［基金项目］宁夏卫生厅重点科研计划课题(2012077) ;宁夏医科大
学校级面上课题(XM2012020)
［作者单位］1．宁夏医科大学基础学院人体解剖学与组织胚胎学系，
宁夏银川 750004
2．宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏
银川 750004
［作者简介］张义伟(1976 －) ，男，硕士，副教授，从事神经解剖学方
向研究。
［通讯作者］刘娟，Email:zhangyiwei0802@ 163． com
［网络出版地址］http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /64． 1008． Ｒ． 20160202．
1720． 002． html
癫痫是大脑神经元异常放电进而引起短暂脑功
能失常，是常见慢性神经系统疾病，中枢神经系统中
γ氨基丁酸和谷氨酸水平异常与癫痫发作有关。外
科海马组织切片证实，颞叶癫痫患者海马的病理学
及分子学的改变与动物模型极为相似，且大量的研
究发现癫痫发作可导致成体海马神经发生、神经元
凋亡等异常改变［1 － 2］。药物治疗癫痫一般选用苯巴
比妥、苯妥英钠、扑癫酮、卡马西平、抗癫宁、丙戊酸
钠等。民间用药发现回药狼毒在治疗癫痫方面效果
比较显著，但目前对狼毒的研究集中于其抗癫痫的
化学成分上，其具体分子机制的研究仍十分匮乏。
本研究观察狼毒提取物对癫痫大鼠学习记忆能力的
影响，同时观察狼毒提取物对海马病理改变及海马
神经发生的影响，探讨其抗癫痫的作用机制。
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1 材料与方法
1． 1 动物与分组:选用 7 周龄雄性 SD 大鼠 90 只，
由宁夏医科大学动物中心提供。2 只一笼，动物饲养
室温度(22 ± 2)℃，相对湿度(50 ± 5)%，人工昼夜
各 12 h自由进食水，所有大鼠适应性喂养 1 周后进
行实验。造模成功后根据取材时间，将大鼠随机分
为对照组、癫痫模型组，狼毒干预组分为 3 个剂量组
(25、50、100 mg /kg)，苯妥英钠阳性对照组，每组各
15 只，体质量 240 ～ 280 g。
1． 2 材料与仪器:氯化锂购自天津市化学试剂研
究所;匹罗卡品、BrdU购自 Sigma公司;小鼠抗大鼠
BrdU 购自 Immunologicals Direect 公司;兔抗 NＲ1
购自 Abcam 公司;山羊抗兔辣根过氧化物酶 HＲP
购自中杉金桥公司;HM650V振动切片机为 Microm
公司、FV1000 共聚焦激光扫描显微镜为 Olympus
公司。
1． 3 用药方法:狼毒大戟 1 kg 的水煎液，经阴离子
交换树脂柱吸附，用氨水洗脱，浓缩，备用。狼毒干
预组、癫痫组及阳性对照组采用国际上公认并被广
泛使用的注射氯化锂 －匹罗卡品方法制备动物癫痫
模型［3］。各组连续狼毒提取液灌胃 2 周进行预处
理，对照组除将匹罗卡品改为注射生理盐水外，其余
处理均与实验组一致，阳性对照组给予苯妥英钠。
实验动物癫痫发作分级评价标准采用 Ｒacine 分级
标准［4］。
1． 4 Morris水迷宫［5］试验:定位航行试验测试大鼠
在训练寻找平台过程中的学习记忆能力，大鼠连续
训练 5 d，记录大鼠从爬上平台的时间，即逃避潜
伏期。
1． 5 BrdU 标记观察细胞增殖:各组动物在最终给
药 24 h后腹腔内注射 BrdU(100 mg /kg)1 次，分别
于 24 h和 2 周之后灌注，取脑组织固定、脱水，脑组
织切片，免疫荧光染色观察 BrdU阳性细胞增殖。将
切片置于激光共聚焦显微镜，通过 X、Y、Z 轴进行观
察，统计增殖细胞的数量。
1． 6 神经元的表达:Western Blot 检测各组大鼠海
马齿状回 CA1 脑区 N －甲基 － D －天冬氨酸受体亚
单位 1(NＲ1)的表达，提取动物基因组，上游:5’－
CTTCCTCCAGCCACTACCC － 3 ’，下 游:5 ’ －
AGAAAGCACCCCTGAAGCAC －3’，聚合酶链式反应
扩增，琼脂糖凝胶电泳。
1． 7 统计学方法:采用 SPSS 18 统计软件，计量资料
以 珋x ± s表示，多组间比较用方差分析，2 组间比较用
t检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 各组 Morris水迷宫试验结果比较:各组定位航
行试验显示，狼毒高剂量组和苯妥英钠组平均潜伏
时间略长于相应对照组(P ＞ 0． 05);狼毒高剂量组
和苯妥英钠组平均潜伏期显著短于癫痫模型组和狼
毒中、低剂量组(P ＜ 0． 05) ;而狼毒中、低剂量组与
癫痫模型组比较差异无统计学意义(P ＞ 0． 05);狼
毒高剂量组与苯妥英钠组比较差异无统计学意义
(P ＞ 0． 05) ，见表 1。
表 1 各组在癫痫发作后逃避潜伏期比较(s，珋x ± s)
组别 n 2 d 3 d 4 d
对照组 15 13． 62 ± 6． 38 8． 42 ± 6． 51 5． 61 ± 3． 29
癫痫模型组 15 25． 04 ± 7． 14 19． 43 ± 3． 58 15． 74 ± 5． 40
狼毒低剂量组 15 24． 13 ± 6． 77 19． 93 ± 8． 79 15． 11 ± 2． 32
狼毒中剂量组 15 24． 92 ± 7． 86 19． 76 ± 7． 25 14． 79 ± 7． 36
狼毒高剂量组 15 15． 32 ± 6． 48 10． 71 ± 6． 43 7． 31 ± 3． 49
苯妥英钠组 15 14． 12 ± 5． 26 9． 23 ± 4． 83 6． 48 ± 5． 76
F值 11． 30 13． 54 14． 33
P值 ＜0． 05 ＜ 0． 05 ＜ 0． 05
2． 2 海马回细胞增殖检测结果比较:海马齿状回内
的 BrdU阳性细胞多分布于颗粒细胞层与颗粒细胞
下层交界的周边区，各组的颗粒细胞下层均可见到
形态不规则、聚集在一起或散在分布的 BrdU 阳性细
胞，呈红色荧光。癫痫模型组与对照组相比较;癫痫
发作后 BrdU 阳性颗粒细胞数目明显上升(P ＜
0． 05)，狼毒高剂量组和苯妥英钠组的 BrdU 阳性颗
粒细胞数均低于癫痫模型组和狼毒中、低剂量组
(P ＜ 0． 05);狼毒高剂量组与苯妥英钠组之间 BrdU
阳性颗粒细胞数差异无统计学意义(P ＞ 0． 05) ，见
表 2。
表 2 各组不同时间点 BrdU阳性细胞数目比较(个，珋x ± s)
组别 n 24 h 2 w
对照组 15 14． 12 ± 1． 56 13． 72 ± 3． 19
癫痫模型组 15 23． 12 ± 4． 76* 21． 46 ± 3． 04*
狼毒高剂量组 15 16． 32 ± 3． 12# 18． 31 ± 1． 32#
苯妥英钠组 15 15． 92 ± 6． 23 16． 98 ± 9． 67
F值 9． 67 10． 16
P值 ＜ 0． 05 ＜ 0． 05
注:* 癫痫模型组与对照组相比较，P ＜ 0． 05;#狼毒高剂
量组与癫痫模型组比较，P ＜ 0． 05。
2． 3 神经元的表达:NＲ1 亚基在海马 CA1 脑区蛋白
水平的表达显示，实验组与对照组差异无统计学意
义(P ＞ 0． 05);狼毒干预组和苯妥英钠组与癫痫模
型组间差异无统计学意义(P ＞ 0． 05)。
3 讨论
癫痫是一种发作性的短暂的大脑功能失调，其
病理生理基础是中枢神经元的异常放电。癫痫在发
病机制中除了与神经递质和细胞凋亡有关之外［6］，
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还与离子通道、神经胶质细胞、氧自由基等多种因素
有关，尤其是与海马神经发生关系的研究已得到了
肯定。目前海马的认知功能被普遍认可［7 － 8］，有研
究者用癫痫动物模型验证了认知功能的异常，研究
已证实痉挛发作可使成体海马神经发生增强［9］。因
此，癫痫对海马神经发生的影响及早期干预的研究
显得尤为重要。
目前，临床上药物治疗癫痫一般选用苯巴比妥、
苯妥英钠等，长期应用有一定的毒副作用。中药抗
癫痫作用经过临床检验有效，民间用药发现瑞香狼
毒在治疗癫痫方面效果显著，目前实验室对中药物
质基础、抗癫痫的生物标志物等机制研究还不深
入［10］。刘玉玺［11］等首次发现瑞香狼毒具有抗癫痫
活性，其 6 种粗提物对多种动物惊厥模型均有不同
程度的抗惊厥作用，其中丙酮提取物抗癫痫作用更
强，毒副作用更小，能有效对抗最大电休克惊厥发
作，延长惊厥发作潜伏期，提高惊厥阈。在本实验中
Morris水迷宫结果显示，狼毒高剂量组和苯妥英钠组
平均潜伏时间明显短于癫痫模型组和狼毒中、低剂
量组，而狼毒中、低剂量组与癫痫模型组之间以及狼
毒高剂量组与苯妥英钠组的潜伏时间差异无统计学
意义，说明高剂量狼毒能够对大鼠的学习记忆能力
产生影响与苯妥英钠阳性对照组非常接近，由此可
见高剂量组的狼毒能够改善大鼠的认知功能。在各
组的颗粒细胞下层均可见到形态不规则、聚集在一
起或散在分布的 BrdU 阳性细胞。癫痫模型组 BrdU
阳性颗粒细胞数目明显多于对照组，狼毒高剂量组
和苯妥英钠组的 BrdU 阳性颗粒细胞数要少于癫痫
模型组和狼毒中、低剂量组。在海马的神经回路中，
颗粒细胞层是海马中最早获得知觉情报的部分［12］，
提示，癫痫发作后瑞香狼毒能够预防或缓解颗粒细
胞层海马神经发生的异常改变，从而影响信息的传
递，进而使癫痫发作所引起的学习、记忆等认知功能
障碍发生改变，印证了民间用瑞香狼毒治疗癫痫。
因狼毒高剂量组的效果优于中、低剂量组，长期
大剂量应用的毒副作用还需研究。狼毒干预组与癫
痫模型组在海马齿状回 CA1 区蛋白表达未见显著差
异，其原因与机制还需进一步探讨。
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［收稿日期］2016 － 01 － 06 ［责任编辑］马兴忠
来稿中统计学处理的有关要求
统计研究设计应说明统计研究设计的名称和主要做法，如调查设计(分为前瞻性、回顾性或横断面调查
研究) ;实验设计应交代具体的设计类型，如自身配对设计、成组设计、交叉设计、析因设计、正交设计等;临床
试验设计应交代属于第几期临床试验，采用了何种盲法措施等。主要围绕 4 个基本原则(随机、对照、重复、
均衡)概要说明，尤其要交代如何控制重要非试验因素的干扰和影响。
·201· 宁夏医学杂志 2016 年 2 月第 38 卷第 2 期 Ningxia Med J，Feb． 2016，Vol 38，No． 2