全 文 :基金项目:国家重点基础研究发展计划(973 计划,编号:2013CB531801) ;黑龙江省研究生创新科研资金项目(编号:YJSCX2012-354HLJ)
通讯作者:匡海学 Tel:(0451)82110803 E-mail:hxkuang@ hotmail. com
狼毒大戟中松香烷型二萜内酯的抗肿瘤活性研究
王蒙 李静 魏晴 王秋红 杨炳友 匡海学 (黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室 黑龙
江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室 哈尔滨 150040)
摘 要 目的:对狼毒大戟中松香烷型二萜内酯类化学成分进行分离和结构鉴定,将得到的单体化合物与 6 种不同的人肿瘤
细胞株相互作用探讨其抗肿瘤活性。方法:通过硅胶、ODS 等柱色谱与 1D、2D-NMR 波谱学测试技术结合,从狼毒大戟中分
离并确定 4 个松香烷型二萜内酯类化合物: jolkinolide A ( 1) 、jolkinolide B ( 2) 、17-hydroxyjolkinolide A ( 3) 、17-hydroxyjolkinol-
ide B ( 4) 。采用噻唑蓝比色法( MTT法) 分别测定其与 6 种人肿瘤细胞株:肝癌 HepG-2、乳腺癌 MCF-7、胃癌 SGC-7901、胃癌
BGC-823、胃癌 MGC-803、宫颈癌 Hela相互作用结果,并计算抑制率与半抑制率( IC50 ) 。结果:化合物 2 对肝癌 HepG-2、乳腺
癌 MCF-7、宫颈癌 Hela细胞的增殖有显著得抑制作用 IC50均 < 25 μmol·L
-1,化合物 4 对乳腺癌 MCF-7 细胞的增殖有显著抑
制作用 IC50 < 30 μmol·L
-1。结论:狼毒大戟中松香烷型二萜内酯类化合物具有显著的抗肿瘤活性。
关键词 狼毒大戟;松香烷型二萜内酯;噻唑蓝比色法;抗肿瘤
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2015)08-1260-03
Antitumor Activity of Abietane Type Diterpene from Euphorbia Fischeriana Steud
Wang Meng,Li Jing,Wei Qing,Wang Qiuhong,Yang Bingyou,Kuang Haixue (Heilongjiang University of Chinese Medicine,Key
Laboratory of Basic and Applied Research in North Medicine,Ministry of Education;Heilongjiang Key Laboratory of Drug Efficacy Ma-
terial Study of Traditional Chinese Medicine and Natural Product,Harbin 150040,China)
ABSTRACT Objective:To isolate abietane type diterpenes from Euphorbia Fischeriana Steud and identify the structures,and inves-
tigate the antitumor activity of the isolated compounds against 6 human cell lines. Methods:The abietane type diterpenes from Euphor-
bia Fischeriana Steud were separated and repeatedly purified using silica gel,ODS and Sephadex LH-20,and determined by HPLC and
1D,2D-NMR spectroscopy. Four compounds were isolated and elucidated as jolkinolide A (1) ,jolkinolide B (2) ,17-hydroxyjolkino-
lide A (3)and 17-hydroxyjolkinolide B (4). The interaction between the compounds and six human tumor cell lines (hepatoma
HepG-2,breast cancer MCF-7,gastric cancer SGC-7901,gastric cancer BGC-823,gastric cancer MGC-803 and cervical cancer Hela)
was explored by an MTT method,and the inhibition rate and IC50 value were calculated. Results:Compound 2 could significantly in-
hibit HepG-2,MCF-7 and Hela cell lines with IC50 value below 25 μmol·L
-1 and compound 4 could inhibit MCF-7 with IC50 value
below 30 μmol·L -1 . Conclusion:Abietane type diterpenes from Euphorbia Fischeriana Steud. have significant antitumor activity.
KEY WORDS Euphorbia fischeriana Steud.;Abietane type diterpenes;MTT;Antitumor activity
狼毒大戟为大戟科大戟属植物狼毒大戟(Eu-
phorbia fischeriana Steud.)的干燥根,具有逐水祛痰,
破积杀虫的功效,中医临床多应用其治疗水肿腹胀,
痰食虫积,癥瘕积聚,结核疥癣[1,2]。现代研究表明
狼毒大戟中的二萜类成分对于恶性肿瘤的临床治疗
具有较好作用且不良反应较小,其二萜类化学成分
骨架以阿替烷型、贝壳杉烷型、巴豆烷型、异海松烷
型、松香烷型为主[3 ~ 5]。本文针对狼毒大戟中松香
烷型二萜类成分进行分离,经结构解析确定 4 个松
香烷型二萜内酯:jolkinolide A (1)、jolkinolide B
(2)、17-hydroxyjolkinolideA(3)、17-hydroxyjolkinolide
B (4) (结构式见图 1) ,进一步通过噻唑蓝比色法
(MTT法)分别测试其与 6 种人肿瘤细胞株:肝癌
HepG-2、乳腺癌 MCF-7、胃癌 SGC-7901、胃癌 BGC-
823、胃癌 MGC-803、宫颈癌 Hela 相互作用的影响,
探讨其可能的作用部位与抗肿瘤活性[6,7]。为研究
狼毒大戟中二萜类成分,特别是松香烷型二萜内酯
类成分的抗肿瘤活性提供科学依据。
图 1 4 种松香烷型二萜内酯的化学结构式
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www. zgys. org 研究论文
1 材料与仪器
1. 1 细胞株
人肿瘤细胞株:肝癌 HepG-2,乳腺癌 MCF-7,胃
癌 SGC-7901,胃癌 BGC-823,胃癌 MGC-803,宫颈癌
Hela,购自中国科学院上海细胞库。
1. 2 受试样品的制备
1. 2. 1 药材的采集与鉴定 药材采自黑龙江省大
庆市林甸县,经黑龙江中医药大学药学院王振月教
授鉴定为大戟科大戟属植物狼毒大戟(Euphorbia
fischeriana Steud.)的干燥根,样品保存于黑龙江中
医药大学中药化学教研室。
1. 2. 2 松香烷型二萜内酯的分离与鉴定 狼毒大
戟的干燥根(3. 0 kg)经 95%乙醇热回流提取 3 次
每次 2 h,减压回收浓缩得提取物(250 g)。水复溶
后用乙酸乙酯进行充分萃取,减压回收浓缩得萃取
物(125 g)。萃取物进行硅胶柱色谱分离,二氯甲
烷-甲醇系统梯度洗脱,TLC 检识追踪合并。富集部
位经 ODS柱色谱分离,甲醇-水系统梯度洗脱,TLC
追踪合并后减压回收丙酮重结晶纯化。所得样品采
用 1D和 2D-NMR波谱学测试技术结合 HR-ESI-MS
质谱分析,经核磁数据文献[8,9]比对后确定化合物
为:jolkinolide A (1) ,32 mg;jolkinolide B (2) ,25
mg; 17-hydroxyjolkinolide A (3) ,19 mg; 17-
hydroxyjolkinolide B (4) ,35 mg。化合物 1-4 经
HPLC分析,纯度均高于 98%,以上实验用药均由黑
龙江中医药大学中药化学实验室制备。
1. 3 试药
胰蛋白酶(Sigma 公司) ;RPMI-1640 培养液
(Hylcone公司) ;二甲亚砜(DMSO,Sigma 公司) ;胎
牛血清(FCS,Gibco公司) ;噻唑蓝(MTT,Amresco 公
司) ;青霉素-链霉素(赛默飞世尔生物化学制品有限
公司) ;氟尿嘧啶(5-fluorouracil,湖北艺康源化工有
限公司)。
1. 4 仪器
电热恒温水浴锅(上海一恒科技仪器有限公
司,HWS-24 型) ;酶标仪(PerkinElmer 公司,VIC-
TOR-X3 型) ;倒置显微镜(ZEISS 公司,Vert-A1
型) ;分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司,RSA-
224S型) ;低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂,
TDL-4 型) ;二氧化碳培养箱(赛默飞世尔生物化学
制品有限公司,Thermo-3111 型) ;超净工作台(北京
东联哈尔仪器制造有限公司,WT-IDN型)。
2 方法与结果
2. 1 细胞的培养
6株肿瘤细胞均用含有 10%胎牛血清、100 u·
ml -1青霉素、100 μg·ml -1链霉素的 RPMI-1640 培养
液于 37℃、5%CO2 培养箱中培养,每 2 d 传代 1 次。
利用胰蛋白酶进行消化,细胞计数板计数,将 100 μl
(约 8 000 个细胞 /孔)肿瘤细胞接种于 96 孔培养板
中,置于 37℃、5%CO2 的恒温培养箱中培养 24 h。
2. 2 受试样品的添加
在细胞完全贴壁后吸弃原培养液,每孔分别加
入 100 μl 不同浓度的受试样品溶液:5,10,20,40,
60 μmol·L -1,另设不加药物的阴性对照组、阳性对
照组(5-fluorouracil)和只加完全培养基而不加细胞
的空白组,每组样品平行设 6 个复孔。
2. 3 染色
各浓度组受试样品作用 48 h 后,避光环境向每
孔加入 5 mg·ml -1的 MTT溶液 20 μl充分混合,置
于 37℃、5%CO2 培养箱中继续培养 4 h。
2. 4 测定
MTT作用完成后,吸弃培养基和 MTT,每孔中加
入 150 μl DMSO溶液,低速振荡 10 min 至紫色结晶
充分溶解。酶标仪在 490 nm 处测量各孔的吸光度
(A)值,记录并计算抑制率和 IC50值。每组实验重复
5次,取平均值作为最终结果。
细胞增殖抑制率 ={[(阴性组平均 A 值 -空白
组平均 A 值)-(实验组平均 A 值 -空白组平均 A
值) ]/(阴性组平均 A值 -空白对照组平均 A值) }×
100%。
2. 5 统计学处理
采用 SPSS11. 0 统计软件,不同组间两两比较采
用 t检验,P < 0. 05为差异有统计学意义。
2. 6 结果
4 个松香烷型二萜内酯化合物:jolkinolide A
(1)、jolkinolideB(2)、17-hydroxyjolkinolideA(3)、
表 1 MTT实验中化合物 1 ~4 作用于 6 种人肿瘤细胞株的 IC50值(n =5)
组别
IC50 /μM
HepG-2 MCF-7 SGC-7901 BGC-823 MGC-803 Hela
化合物 1 80. 12 ± 3. 14 56. 34 ± 3. 21a > 100 > 100 > 100 > 100
化合物 2 24. 43 ± 2. 13b 22. 76 ± 2. 56b 31. 32 ± 2. 42 32. 45 ± 2. 11a 34. 7 ± 2. 09a 23. 12 ± 2. 23b
化合物 3 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100
化合物 4 42. 13 ± 2. 34a 25. 33 ± 2. 32b 44. 34 ± 2. 40a 48. 12 ± 2. 38 43. 89 ± 2. 14a 35. 11 ± 2. 45a
5-Fu 8. 31 ± 0. 35b 5. 42 ± 0. 32b 8. 43 ± 0. 22b 5. 76 ± 0. 11b 12. 30 ± 0. 32b 9. 32 ± 0. 32b
注:与正常组比较,aP < 0. 05,bP < 0. 01。
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中国药师 2015 年第 18 卷第 8 期 China Pharmacist 2015,Vol. 18 No. 8
图 2 MTT实验中化合物 1 ~4
作用于 6 种人肿瘤细胞株的抑制率
17-hydroxyjolkinolide B (4) ,对 6 种人肿瘤细胞株:
肝癌 HepG-2,乳腺癌 MCF-7,胃癌 SGC-7901,胃癌
BGC-823,胃癌 MGC-803,宫颈癌 Hela 的抑制率与
IC50值,结果如表 1、图 2 所示。
肝癌 HepG-2 细胞实验中,化合物 2 对肝癌细
胞的增殖有显著的抑制作用 IC50 < 25 μmol·L
-1,
化合物 4 对肝癌细胞的增殖有一定的抑制作用 IC50
< 50 μmol·L -1,化合物 1、3 均未见明显活性 IC50
> 50 μmol·L -1。
乳腺癌 MCF-7 细胞实验中,化合物 2、4 均对乳
腺癌细胞的增殖有显著的抑制作用 IC50 < 25 μmol·
L -1,化合物 2活性稍强于化合物4。化合物 1对乳腺
癌细胞的增殖有一定的抑制作用 IC50 < 60 μmol·
L -1,化合物 3未见明显活性 IC50 >100 μmol·L
-1。
胃癌 SGC-7901、BGC-823、MGC-803 细胞实验
中,化合物 2 分别对胃癌 BGC-823、MGC-803 细胞的
增殖有一定的抑制作用 IC50 < 35 μmol·L
1,化合物
4 分别对胃癌 SGC-7901、MGC-803 细胞的增殖有一
定的抑制作用 IC50 < 45 μmol·L
-1,化合物 1、3 均
未见明显活性 IC50 > 100 μmol·L
-1。
宫颈癌 Hela 细胞实验中,化合物 2 对宫颈癌
Hela细胞的增殖有显著的抑制作用 IC50 < 25 μmol
·L -1,化合物 4 对宫颈癌 Hela 细胞的增殖有一定
的抑制作用 IC50 < 40 μmol·L
-1,化合物 1、3 均未
见明显活性 IC50 > 100 μmol·L
-1。
3 讨论
肿瘤是目前世界范围内危害人类健康的一大杀
手,西医目前治疗肿瘤多以手术,放、化疗为主,治疗
效果不好且对人体伤害大。中医认为肿瘤的形成原
因是气滞血瘀、热毒内蕴、正气虚弱,根据中医理论运
用中药在临床治疗过程中取得理想效果,可见中医药
对于肿瘤的认识和治疗具有其独特的方法[10]。目前
从有治疗作用的中药里寻找抗肿瘤活性成分类型,用
以指导合成和开发抗肿瘤化合物成为更为直接、有效
的方法。
狼毒大戟被中医临床用以治疗肿瘤已有多年历
史且治疗效果好不良反应小,其所含成分多以二萜类
化合物为主[11 ~ 13]。本文针对其中的松香烷型二萜类
成分进行研究,特别是松香烷型二萜内酯类化合物,
以单体作为研究对象进行实验其结果更为直观准确。
通过 MTT法研究 4种单体化合物对 6 种不同人肿瘤
细胞株的抑制作用,探究其抗肿瘤活性。结果表明化
合物 2对肝癌HepG-2、乳腺癌MCF-7、宫颈癌Hela细
胞的增殖有显著得抑制作用 IC50均 < 25 μmol·L
-1,
化合物 4对乳腺癌 MCF-7 细胞的增殖有显著抑制作
用 IC50 < 30 μmol·L
-1。证实狼毒大戟中所含松香
烷型二萜内酯类化合物具有显著的抗肿瘤活性,同时
明确其可能的抗肿瘤作用部位,为进一步研究中药狼
毒大戟的抗肿瘤作用打下良好基础并提供科学依据。
参 考 文 献
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