全 文 ：·论著 · 文章编号:1007-8738(2008)09-0861-03
草木犀石油醚提取物对 NF-κB和血红素氧合酶 1表达的影响
庞　然 1 , 张淑玲 1＊, 赵　雷 1 , 刘双林 2 , 董继华3 , 陶君彦 4 (华中科技大学同济医学院:1协和医院感染科 , 2同济医院
泌尿外科 , 3协和医院中心实验室 , 湖北 武汉 430022;4生命科学与技术学院 , 湖北 武汉 430072)
收稿日期:2007-11-12;　接受日期:2008-01-16
基金项目:湖北省科技攻关计划资助项目(2007AA301B34-3)
作者简介:庞　然(1982-), 女 , 湖北天门人 , 博士生
Tel:027-63342061;E-mail:pangran05@ 163.com＊Correspondingauthor
Efectofpetroleum etherextractfrom
MelilotussuaveolensLedebontheexpres-
sionofNF-κBandHemeoxygenase1
PANGRan1 , ZHANGShu-ling1＊, ZHAOLei1 , LIU
Shuang-lin2 , DONGJi-hua3 , TAOJun-yan4
1DepartmentofInfectiousDiseases, UnionHospital;2Department
ofUrology, TongjiHospital;3CentralLaboratory, UnionHospital,
TongjiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceand
Technology, Wuhan430022;4ColegeofLifeScienceandTech-
nology, HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wuhan
430072, China
[ Abstract] 　AIM:Tostudytheanti-inflammatoryefect
ofpetroleumetherextractfromMelilotussuaveolensLedeb.
METHODS:Inflammatorycelmodelwasconstructedby
LPSactingontheRAW264.7 celline.Theexpressionand
distributionofNF-κBweredetectedusingimmunocytochem-
icalmethod.TheexpressionofmRNAandproteinofHeme
oxygenase1(HO-1)weredetectedbyreal-timePCRand
Westernblot.RESULTS:Theimmunocytochemicalanalysis
showedthatthecytoplasmstainedtobrownpresentedNF-
κBinactivationaftertheinterventionofpetroleumetherex-
tractwhilethecelnucleusstainedtobrownpresentedNF-
κBactivationaftertheonlyinterventionofLPS.Theexpres-
sionofHO-1 mRNAwassignificantlyenhancedbytheex-
tractinadose-dependentmanner, andtheexpressionof
HO-1 proteinwasmarkedlyenhancedtoo.CONCLUSION:
The petroleum etherextractfrom Melilotussuaveolens
Ledebcanresistinflammationbyinhibitingtheactivationof
proinflammatoryfactorNF-κBandenhancingtheexpression
ofanti-inflammatoryfactorHO-1.
[ Keywords] MelilotussuaveolensLedeb;petroleumether;
RAW264.7celline;NF-κB;HO-1
[摘 要 ] 　目的:探讨草木犀的石油醚提取物在炎症中的作
用。方法:通过 LPS干预 RAW264.7细胞系建立炎症细胞模
型 , 免疫细胞化学法检验 NF-κB的表达及分布变化 , 实时荧
光定量 RT-PCR法检测血红素氧合酶 1(HO-1)的基因表达 ,
Westernblot法测定 HO-1的蛋白表达量。结果:免疫细胞化
学法结果显示药物干预时胞质被染为棕色 , NF-κB多分布在
胞质未被激活;仅有 LPS干预时 , 胞核被染为棕色 , NF-κB集
中分布在细胞核表达增强。 药物提取物干预后 HO-1的 mR-
NA表达水平明显升高 , 且呈剂量依赖型关系;Westernblot结
果显示药物干预后 HO-1的蛋白表达水平也明显升高。结论:
草木犀的石油醚提取物通过抑制 NF-κB的激活 , 同时促进
HO-1的释放而发挥一定的抗炎作用。
[关键词 ] 草木犀;石油醚;RAW 264.7细胞系;NF-κB;血
红素氧合酶 1
[中图分类号 ] R392;R503　　　[文献标识码 ] A
　　草木犀 , 豆科(Leguminosae)草木犀属(Melilotus)
1年生或 2年生草本植物 , 是临床用于抗炎的一种中
草药。然而 , 草木犀产生抗炎作用的分子生物学机制
还不明确。本实验中拟通过 LPS刺激 RAW 264.7小
鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型[ 1] , 并采用免疫细胞
化学法 、实时荧光定量 RT-PCR法﹑ Westernblot法对
草木犀提取物在炎症中的作用进行的研究。
1　材料和方法
1.1　材料　RPMI1640、 TRIzol购自 Gibico公司;LPS(Esche-
richiacoliO111:B4)和 MTT购自 Sigma公司;HO-1羊抗鼠多
克隆抗体购自 R＆DSystems公司;兔抗鼠多克隆抗体 NF-κB
p65 IgG抗体购自 SantaCruz公司;M-MLV逆转录酶 、 dNTP
购自 Promega公司;SYBRGreen购自 Biotium公司;Oligo
(dT18)及引物由 Invitrogen公司合成。草木犀于 2006年 8月
在陕西陇县采集 , 经陈科力教授(湖北中医学院)鉴定后保存
于湖北中医学院药学部的植物样本库中。 小鼠巨噬细胞系
RAW 264.7购自中国典型培养物保藏中心。
1.2　方法
1.2.1　草木犀石油醚提取物的制备　取 50 g风干的草木犀
磨成粉末 , 用 700 mL/L乙醇于 85℃提取 3次(1次 500 mL,
每次 1.5h), 真空过滤浓缩提取液 , 用去离子水稀释至 1g/mL
(药材∶水)浓度。取 5 mL浓缩液至 100 mL的分液漏斗中, 连
续石油醚提取直至其干重达 0.425 g。用 RPMI1640培养液将
其稀释成 3种浓度 10 mg/L、 5 mg/L和 1 mg/L备用。
1.2.2　细胞培养　小鼠巨噬细胞系 RAW264.7使用 RP-
MI1640培养液(加入 100 U/mL青霉素 , 100 mg/L链霉素和
861ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2008, 24(9)
DOI :10.13423/j.cnki.cjcmi.004806
100mL/L胎牛血清), 50 mL/LCO2培养箱中 37℃培养。
1.2.3　细胞模型的建立和干涉　LPS处理前 24 h将细胞接
种于 6、 24或 96孔板上 , 24 h后细胞贴壁后弃上清 , 加入含
LPS10g/L的培养液和不同浓度的提取物 , 作用不同时间后
收集细胞 , 分别使用免疫细胞化学法 , 实时荧光定量 RT-PCR
法 , Westernblot法检测。
1.2.4　实验分组　实验共分 4组。 (1)阳性对照组:地塞米
松(DM)0.5 g/L作阳性对照;(2)阴性对照组:黄芪多糖
(APS)100mg/L作为阴性对照;(3)空白对照组:只用 10g/L
的 LPS处理而不加药物干预;(4)正常对照组:不用 LPS处理
也不加药物干预。
1.2.5　药物细胞毒性的检测　用 MTT法 , 在终止细胞培养
前 4 h加入 20 μLMTT溶液(浓度 5 g/L, pH7.4), 终止细胞
培养后每孔加入 150 μLDMSO, Spectramax250全自动定量绘
图酶标仪测定 A490值。细胞病变效应(cytopathiceffect, CPE)
检测 , 细胞在提取液中培养 24 h后在显微镜下观察细胞形态
以检测细胞病变。
1.2.6　NF-κB的检测　利用免疫细胞化学法(SP)检测 NF-
κB的表达及分布变化。将盖玻片置于培养板中 , 并将细胞接
种于培养板 , 待细胞爬片后 , 药物干预细胞 2 h。 PBS洗涤 ,
4℃丙酮固定 10 min;30 mL/L过氧化氢甲醇溶液孵育 20 min
以封闭内源性过氧化物酶;10 mL/LTritonX-100 37℃ 5 min,
PBS洗涤;加入山羊血清室温孵育 20min;然后加入兔抗鼠多
克隆抗体 NF-κBp65 IgG抗体(1∶200), 4℃冰箱过夜 , PBS洗
涤;加入二抗(生物素化羊抗兔 IgG, 1∶400), 37℃ 30min, PBS
洗涤;加入HRP结合链霉亲合素(1∶400), 37℃ 30min, PBS洗
涤;DAB/H2O2显色 , 苏木素衬染 , 常规脱水 、透明 、封片。
1.2.7　血红素加氧酶 1 mRNA水平的检测　实时荧光定量
RT-PCR法检测 HO-1的基因表达。细胞干预 18 h后提取
RNA检测 HO-1的基因表达量。细胞总 RNA提取采用 TRIzol
试剂提取法 , 具体方法参照说明书。将 RNA保存在 -80℃备
用。采用 ABI-7700序列检测仪。引物序列:Mus-HO-1:For-
ward: 5′-CACAGATGGCGTCACTTCGTC-3′, Reverse: 5′-GT-
GAGGACCCACTGGAGGAG-3′。 Mus-β -actin:Forward:5′-GC-
TACAGCTTCACCACCACAG -3′, Reverse:5′- GGTCTTTACG-
GATGTCAACGTC-3′。 RNA经逆转录反应合成 cDNA, RT及
PCR反应体系按试剂盒说明书进行。实验结果采用 ABI-7700
自带软件对数据自动分析后 , 用所给 Ct值应用公式 Folds=
2-ΔΔCt进行基因表达差异分析 [ 2] 。
1.2.8　HO-1蛋白水平的检测　Westernblot法检测细胞中药
物干预前后 HO-1的蛋白表达量的变化。细胞干预 24 h后 ,
冷 PBS洗涤 , 加入细胞裂解液 , 冰上孵育 15 min, 细胞刮刮
下并收集裂解液 , 10 000 r/min4℃ 10 min, 取上清保存于
-20℃。用 BCA法测定蛋白质浓度 , 取相同量蛋白质用于
100 g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;转移至硝基纤维素膜
50 g/L脱脂奶粉溶液 37 ℃封闭 1 h;羊抗鼠 HO-1多克隆抗体
(1∶200), 4℃孵育过夜 , 洗膜;应用辣根过氧化物酶标记的二
抗(1∶200)室温孵育 1 h, 再加入化学发光显色剂显色 , X光片
曝光显影 , 凝胶成像分析系统扫描 , pro3.0软件半定量分析。
1.2.9　统计学分析　应用 SPSS12.0统计分析软件包 , 采取
单因素方差分析对实验数据进行处理 , 以 P<0.05为有统计
学意义。
2　结果
2.1　药物对细胞的毒性 　MTT实验结果显示 3种浓度
(10 mg/L、 5mg/L和 1 mg/L)药物干预细胞 24 h后对细胞活
性没有明显影响。 CPE结果亦如此(图 1)。
图 1　CPE结果
Fig1　TheresultsofCPE(×100)
A:NormalRAW 264.7 cells;B:Thecelsafterinterventionof10mg/L
petroleumetherextract.
2.2　药物对 NF-κB的抑制效果　免疫细胞化学法结果显示:
药物干预时 , 胞质被染成棕色(图 2A～C), DM干预时 , 胞质
被染成棕色(图 2D), 表示 NF-κB多分布在胞质未被激活;
APS干预时, 胞核被染成棕色(图 2E), 仅有 LPS干预时 , 胞核
被染成棕色(图 2F), 表示 NF-κB集中分布在细胞核表达增强 ,
说明 APS、 LPS能诱导其向细胞核转位 , 使 NF-κB活化。
图 2　免疫细胞化学法观察不同组 NF-κB的位置
Fig2　EffectsofpetroleumetherextractonNF-κBtranslocation
(×200)
A, B, C:RAW264.7celsweretreatedwith10mg/L, 5mg/L, 1mg/L
petroleumetherextractplusLPS;D:RAW264.7celsweretreatedwith
DMplusLPS;E:RAW264.7 celsweretreatedwithAPSplusLPS;
F:RAW264.7celsweretreatedwithLPS;G:Normalgroup.
862 ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCelMolImmunol)2008, 24(9)
2.3　药物干预前后 HO-1的 mRNA水平　药物提取物干预
后 HO-1水平明显升高 , 并且药物浓度越高 , HO-1水平越高 ,
呈现一个剂量依赖型关系(图 3)。
图 3　不同组 HO-1的 mRNA水平
Fig3　TheexpressionofHO-1 mRNA
bP<0.01vsLPSalone.
2.4　药物干预前后 HO-1的蛋白水平　Westernblot结果显
示药物干预后 HO-1的蛋白水平明显升高(图 4), 之间的差异
有统计学意义(P<0.01)。
图 4　不同组 HO-1的蛋白水平
Fig4　TheexpressionofHO-1 protein
3　讨论
巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的
作用 , 它通过激活机体的免疫系统 , 释放细胞因子 、
具有生物活性的脂类介质及活性氧等一系列炎症介
质参与炎症反应 [ 3] 。根据其对炎症反应的促进或抑
制效应的不同 , 这些炎症介质大致上可分为两类:促
炎介质和抗炎介质 , 两者的比例关系及动态变化是
决定炎症转归的关键因素 [ 4] 。当细胞面临有毒性的
化学物质或病原体侵袭的时候 , 机体的免疫系统会
释放出 NF-κB。 NF-κB是调控众多炎症基因表达的
关键转录因子 , 其通常以非活性状态存在于细胞质
中 , 当细胞受到 TNF、弗波脂等刺激时 , NF-κB得以
活化并从细胞质易位到细胞核 , 启动多种炎症基因
表达 , 使大量的炎性细胞浸润于炎症部位[ 5] 。 NF-κB
发生核转位是一些免疫和炎症反应的重要步骤 , 应
用 NF-κB抑制剂以减少炎症介质的产生成为治疗炎
症的新思路 。炎症反应过程中 , 在炎症介质产生的
同时抗炎因子 HO-1也被分泌和活化 。HO-1是催化
血红素降解的限速酶 , 从而生成胆绿素 、游离铁和
CO。研究表明 , 它们不仅能清除机体的活性氧 , 还
能抑制多种促炎介质的产生 , 促进多种抗炎介质的
表达 , 并且拮抗一些炎症介质的细胞毒效应 [ 6] 。
本课题组的前期研究已证实 , 草木犀石油醚提
取物能通过抑制促炎介质和细胞因子 TNF-α、 IL-1、
IL-6、 NO的产生发挥抗炎作用。而这些促炎介质和
细胞因子都受 NF-κB的调控 , 这就提示草木犀石油
醚提取物可能通过抑制 NF-κB信号通路而抑制 LPS
所致巨噬细胞高水平表 TNF-α、 IL-1β等发挥抗炎作
用。本实验显示 LPS刺激细胞后 NF-κB得以活化并
向核内转位 , 而药物干预后 NF-κB以非活性状态存
在于胞质中未被激活 , 进一步证实了草木犀石油醚
提取物能通过抑制 NF-κB活化发挥抗炎作用。同
时 , 草木犀石油醚提取物也对抗炎介质产生一定的
影响 。实验显示草木犀石油醚提取物能促进 HO-1
的表达和释放 , 且该作用呈剂量依赖性。以上结果
表明 , 草木犀石油醚提取物能通过抑制 NF-κB活化 ,
同时 , 促进 HO-1的基因表达和释放而发挥抗炎作
用。本实验选用 DM和 APS分别作为阳性和阴性对
照。 DM是传统的抗炎药物;APS是临床上用于增强
免疫的免疫调节剂 , 能够增强促炎因子的释放 [ 7] 。
结果显示 , 一定浓度的 DM可以显著降低 NF-κB活
化 , 而 APS则没有这方面的作用 , 这与文献报道的
结果基本一致 [ 8] 。
我们从分子水平探讨了草木犀石油醚提取物的
体外抗炎活性及其可能的分子机制 。通过本研究发
现 , 草木犀石油醚提取物能抑制促炎介质的表达 , 并
促进抗炎介质的表达 , 使得促炎 /抗炎介质的比例偏
向抗炎一方 , 从而产生广泛的抗炎作用。
参考文献:
[ 1] KimKM, KwonYG, ChungHT, etal.Methanolextractofcordyceps
pruinosainhibitsinvitroandinvivoinflammatorymediatorsbysup-
pressingNF-κBactivation[ J].ToxicolApplPharmacol, 2003, 190
(1):1-8.
[ 2] 王　昊, 谭升顺 , 王新阳 , 等.RNA干扰对恶性黑素瘤 LiBr细胞
livin基因表达的影响 [ J].细胞与分子免疫学杂志 , 2007, 23
(8):741-744.
[ 3] HortelanoS, CastriloA, AlvarezAM, etal.Contributionofcyclo-
pentenoneprostaglandinstotheresolutionofinflammationthroughthe
potentiationofapoptosisinactivatedmacrophages[ J] .JImmunol,
2000, 165(11):6525-6531.
[ 4] LawrenceT, WiloughbyDA, GilroyDW.Anti-inflammatorylipidme-
diatorsandinsightsintotheresolutionofinflammation[ J] .NatRev
Immunol, 2002, 2(10):787-795.
[ 5] LawrenceT, BebienM, LiuGY.IKKαlimitsmacrophageNF-κBac-
tivationandcontributestotheresolutionofinflammation[ J] .Nature,
2005, 434(7037):1138-1143.
[ 6] CooperKL, LiuKJ, HudsonLG.Contributionsofreactiveoxygenspe-
ciesandmitogen-activatedproteinkinasesignalinginarsenite-stimula-
tedhemeoxygenase-1production[ J].ToxicolApplPharmacol, 2007,
218(2):119-127.
[ 7] ShaoBM, XuW, DaiH, etal.Astudyontheimmunereceptorsfor
polysaccharidesfromtherootsofAstragalusmembranaceus, aChinese
medicinalherb[ J] .BiochemBiophysResCommun, 2004, 320(4):
1103-1111.
[ 8] JoussenAM, PoulakiV, MitsiadesN, etal.Nonsteroidalanti-inflam-
matorydrugspreventearlydiabeticretinopathyviaTNF-αsuppresion
[J] .FASEBJ, 2002, 16(3):438- 440.
863ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2008, 24(9)