全 文 ：[论　　著]
猴耳环水提取物抗流感病毒的实验研究
张中贤1 ,黄剑臻1 ,李沛波2
摘要:目的　研究猴耳环水提取物体内外抗流感病毒的活性。 　方法　体外抗病毒试验采用 CPE 法 , 按 Reed-
Muench方法计算TC50、IC50和 TI ,观察猴耳环水提取物体外对流感病毒引起的细胞病变的影响和在体内采用小鼠经滴
鼻感染流感病毒造成肺炎模型 , 以肺部炎症 、死亡率和生命延长率为指标 , 观察猴耳环水提取物体内抗流感病毒的活
性。 　结果　猴耳环水提取物在体外对流感病毒引起的细胞病变有明显抑制作用 , 其 IC50生药为 3.33mg/ ml , TI 为
7.48;在给生药药剂量为 8～ 20g/ kg时 ,对流感病毒所致的小鼠肺部炎症有明显抑制作用 ,并能明显降低流感病毒感染
小鼠的死亡率和延长其存活时间。 　结论　猴耳环水提取物在体内外均具有明显抗流感病毒的作用。
关键词:猴耳环;水提取物;抗流感病毒
中图分类号:R373.13　　文献标识码:A　　文章编号:1009-9727(2008)1-30-02
Experimental study on anti-viral activity of the water extract from Pitecollobium clypearia Benth.ZHANG Zhong-xi-
an1 , HUANG Jian-zhen1 , LI Pei-bo2(1.Hunan Provincial Second People s Hospital.Changsha 410004 , Hunan , P.R.China;
2.College of Life Sciences , Sun Yat-sen University , Guangzhou 510275 , Guangdong , P.R.China)
Abstract:Objective　To examine the in vitro and in vivo antiviral activity of water extract from Pitecollobium clypearia Benth.
　Methods　The antiviral effect of extract from Pitecollobium clypearia Benth was assessed by determination of the reduction of cyto-
pathic effect(CPE), the 50% toxicity concentration(TC50), 50% inhibitor concentration(IC50), and the therapeutic index(TI)of
the water extract from Pitecollobium clypearia Benth.The results of lung inflammation , mortality rate and the survival rate of mice in-
fected by influenza virus were observed.　Results　The cytopathic effect induced by influenza virus was inhibited remarkedly , with
IC50 of 3.33 mg raw material/ml and TI of 7.48.At the dose of 8 ～ 20g raw material/kg body weight , pneumonia induced by influenza
virus in mice was inhibited significantly by the water extract.The survival rate was increased remarkedly.　Conclusion　The water
extract from Pitecollobium clypearia Benth.Exhibits apparent anti-influenza activity both in vitro and in vivo.
Key words:Pitecollobium clypearia Benth;Water extract;Anti-influenza virus
　　猴耳环(Pitecollobium clypearia Benth.)又名围延树 、蛟龙
木 、落地金钱 、鸡三树 、尿桶公等 , 是豆科植物亮叶围延树的枝
叶 ,分布于浙江 、福建 、广东 、广西 、四川 、云南等省区 ,具有清热
解毒 ,凉血消肿等功效[ 1] 。现代临床上用于上呼吸道感染 、急
性咽喉炎 、急性扁桃体炎 、急性胃肠炎等症。其单方制剂—猴
耳环消炎片作为抗炎及呼吸道疾病用药已得到广泛的应用 , 其
处方为猴耳环嫩枝叶的水提浸膏[ 2] 。目前 ,关于猴耳环的现代
药理研究报道很少 ,仅见 Li YL等发现猴耳环水提物对呼吸道
合胞病毒(RSV)有体外抑制作用 , 且发现其化学成分槲皮素具
有抗呼吸道合胞病毒作用[ 3 , 4] 。但尚未见有关猴耳环对流感
病毒作用的研究报道。因此 ,作者对猴耳环水提取物进行抗流
感病毒作用的体内和体外实验研究 ,现报告如下。
1　材料与方法
1.1　药物及试剂　猴耳环水提取物(采用水煎法自制 , 方法
为:取适量猴耳环 ,粉碎 , 每次用 8 倍量水煎煮 1 h , 共 2 次 , 合
并 2次水煎煮液 , 浓缩 , 滤膜除菌 , 4℃冰箱保存备用);病毒
唑:浙江亚太药业股份有限公司生产 , 批号:060301。
1.2　动物　昆明种小鼠 , 雌雄各半 ,体重 20～ 24g , SPF级 , 由广
东省医学实验动物中心提供 , 动物合格证号:粤监证字
2006A018。
1.3　病毒株及细胞　甲型流感病毒 、流感病毒亚甲型鼠肺适
应株(FM1),购自中国预防医学科学院病毒学研究所;MDCK细
胞株 ,购自中山大学实验动物中心细胞室。
1.4　细胞培养液和维持液　细胞培养液为含 100U/ml的青霉
素 、100μg/ ml的链霉素和 10%胎牛血清的 DMEM 培养液;细胞
维持液除含 2%胎牛血清外 , 其他成分同培养液。
1.5　方法
1.5.1　猴耳环水提取物在体外对 MDCK 培养细胞的毒性试
验[ 5] 　将猴耳环水提取物母液用细胞培养液做等比稀释后 , 加
到已长成单层的MDCK细胞培养板中 , 100μl/孔 , 每个稀释度药
液做 4个复孔 , 同时设正常细胞对照 、病毒对照和病毒唑对照。
将培养板置37℃5%CO2培养箱中培养 4d , 每日于倒置显微镜
下观察细胞病变情况。按 Reed-Muench[ 6]法计算半数细胞毒
性浓度(TC50)。
1.5.2　猴耳环水在体外对流感病毒所致细胞病变的影响(CPE
法)[ 5] 　取已长成单层细胞的培养板 , 倒掉培养液 ,加入相应稀
释度的药液 , 100μl/孔 , 每个稀释度平行做 4 个复孔。置 37℃
5%CO2培养箱中作用1h 后倒掉药液 , 接种100倍 TCID50(半数
30 　　　　　　　　　　　　　　　CHINA TROPICAL MEDICINE Vol.8 No.1 January 2008 　中国热带医学 2008年第 8卷第 1期
作者单位:1.湖南省第二人民医院药剂科 ,湖南 长沙　410004;　2.中山大学生命科学学院 ,广东 广州　510275.
作者简介:张中贤(1973～ ),男 ,湖南湘阴人 ,主管药师 ,主要从事中药制剂与管理工作.
感染量)的病毒液 , 50μl/孔 , 置 37℃ 5% CO2 培养箱中吸附 1h
后倒掉病毒液 ,用细胞维持液冲洗细胞 2 次 ,再加入相应稀释
度的药液 ,同时设病毒对照 、病毒唑对照及正常细胞对照 , 置
37℃5% CO2 培养箱中培养 ,每日于倒置显微镜下观察细胞病
变情况。细胞病变程度(Cytopathic effect , CPE)按以下6 级标准
判断:“ -”为细胞生长正常 , 无病变出现;“ ±”为细胞病变占整
个单层细胞的 0～ 10%;“ +”为细胞病变约占整个单层细胞的
10%～ 25%;“ ++” 为细胞病变约占整个单层细胞的 25 ～
50%;“ +++”为细胞病变约占整个单层细胞的 50%～ 75 %;
“ ++++”为细胞病变约占整个单层细胞的 75 %以上。当病
毒对照组细胞病变为“++++”时记录实验结果 ,经秩和检验
与病毒对照组比较 P <0.05(CPE 为“ ++”以下)判断为有
效。并按 Reed-Muench[ 6]计算半数有效浓度(IC50)和治疗指数
(TI)。TI= TC50/ IC50 。
1.5.3　猴耳环水提取物体内对小鼠流感病毒性肺炎的影响[ 5]
　取昆明种小鼠 60 只 , 随机分成正常对照组 、病毒感染对照
组 、病毒唑组 、猴耳环水提取物低 、中 、高 3 个剂量组 , 共 6 组 ,
每组 10只。除正常对照组外 , 其余各组小鼠用乙醚轻度麻醉 ,
选用流感病毒亚甲型鼠肺适应株 FM1 的 15 个 LD50病毒浓度 ,
滴鼻感染小鼠 ,每只 0.05ml。从感染前 1d 开始按 0.1ml/10g 的
剂量灌胃给药 ,每天 2次 ,连续 5d , 病毒感染对照组以等体积蒸
馏水灌胃。第 6d称取小鼠体重后解剖 ,肉眼观察肺部病变 , 记
录肺部肝样实变的程度 ,摘取全肺称重 , 与体重计算肺指数值 ,
并求出肺指数抑制率。计算公式如下:
肺指数=[肺重(g)/体重(g)] ×100%
肺指数抑制率=(病毒对照组肺指数均值-试验组肺指数
均值)/病毒对照组肺指数均值×100%
1.5.4　猴耳环水提取物对流感病毒致小鼠死亡的影响[ 5] 　取
昆明种小鼠 90只 , 随机分成病毒感染对照组 、病毒唑组 、猴耳
环水提取物低 、中 、高 3个剂量组 ,共 5 组 , 每组 18 只。各组小
鼠用乙醚轻度麻醉后 ,以 2 个 LD50病毒浓度的流感病毒亚甲型
鼠肺适应株 FM1 病毒液滴鼻感染 , 每只 0.05ml。从感染前 1d
开始按 0.1ml/ 10g的剂量灌胃给药 , 每天 2 次 ,连续 5d ,病毒感
染对照组以等体积蒸馏水灌胃。观察并记录感染后小鼠的死
亡数 ,计算死亡率 、保护率 、平均存活天数及生命延长率。计算
公式如下:
死亡保护率=(病毒感染对照组死亡率-试验组死亡率)/
病毒感染对照组死亡率
生命延长率=(试验组平均存活天数-病毒感染对照组平
均存活天数/病毒感染对照组平均存活天数)×100%
1.6　统计学方法　采用 SPSS10.0 软件包进行统计分析 , 肺指
数值 、存活天数的比较采用组间 t 检验;保护率的比较用χ2 检
验。
2　结果
2.1　猴耳环水提取物体外抗流感病毒作用　实验结果表明 ,
较大浓度的猴耳环水提取物对MDCK细胞具一定毒性 , 主要表
现为细胞增殖缓慢 、 颗粒增多 、形态改变 、折光性增强等 , 其
TC50生药为 24.91mg/ml;猴耳环水提取物在体外能抑制流感病
毒所致的细胞病变 , 其 IC50生药为 3.33mg/ml。提示猴耳环水
提取物在体外对流感病毒具有抑制作用 ,其 TI为 7.48。
2.2　猴耳环水提取物对小鼠流感病毒性肺炎的影响　由表 1
可见 ,猴耳环水提物低 、中 、高剂量组小鼠的肺指数值明显低于
病毒感染对照组 ,与病毒感染对照组比较有显著性差异(P <
0.01或 0.05), 提示猴耳环水提取物对流感病毒引起的小鼠肺
部炎症有明显抑制作用。
表 1　猴耳环水提取物对小鼠流感病毒性肺炎的影响
Tab 1　Effects of the water extract from Pitecollobium clypearia Benth.
on lung index in infected mice
组别 给药剂量
动物数(只) 肺指数值(%) 抑制率(%)
正常对照组 - 10 1.02±0.23 -
病毒感染对照组 - 10 1.85±0.31## -
病毒唑组 70mg·kg-1 10 1.21±0.17﹡﹡ 34.59
猴耳环水提物低剂量组　5g生药·kg-1 10 1.55±0.12﹡ 16.21
猴耳环水提物中剂量组　10g生药·kg-1 10 1.36±0.19﹡﹡ 26.49
猴耳环水提物高剂量组　20g生药·kg-1 10 1.28±0.26﹡﹡ 30.81
注:与正常对照组比较 , ##P <0.01;与病毒感染对照组比较 ,﹡P <0.05 , ﹡﹡P <0.01。
2.3　猴耳环水提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用　由
表2 可见 , 在小鼠感染流感病毒后 ,病毒感染对照组 94.4%动
物出现死亡 ,平均存活 8.1d。而低 、中 、高剂量猴耳环水提物能
明显抑制流感病毒感染所致的小鼠死亡(猴耳环水提物低 、中 、
高剂量组死亡率与病毒感染对照组比较 , P <0.01 或 0.05),
且能明显延长小鼠的平均存活天数(猴耳环水提物低 、中 、高剂
量组存活天数与病毒组比较 , P <0.01 或 0.05), 提示中药猴
耳环水提取物对流感病毒致小鼠死亡有明显保护作用。
表 2　猴耳环水提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
Tab 2　Effects of the water extract from Pitecollobium clypearia Benth.on death rate and survival time of mice infected by influenza virus
组别 给药剂量 动物数(只) 死亡数(只) 死亡率(%) 保护率(%) 存活天数(d) 生命延长率(%)
病毒感染对照组 - 18 17 94.4 - 8.1±1.0 -
病毒唑组 70mg·kg-1 18 6 33.3 64.7﹡﹡ 13.8±2.7﹡﹡ 70.4
猴耳环水提物低剂量组 5g 生药·kg-1 18 11 61.1 35.3﹡ 9.4±2.0﹡ 16.0
猴耳环水提物中剂量组 10g生药·kg-1 18 10 55.6 41.1﹡﹡ 11.4±3.1﹡﹡ 40.7
猴耳环水提物高剂量组 20g生药·kg-1 18 8 44.4 53.0﹡﹡ 12.1±2.9﹡﹡ 49.4
注:与病毒感染对照组比较 ,﹡ P <0.05 ,﹡﹡P <0.01。
3　讨论 流行性感冒是由流行性感冒病毒(简称流(下转第 34页)
31中国热带医学 2008年第 8卷第 1期　CHINA TROPICAL MEDICINE Vol.8 No.1 January 2008 　　　　　　　　　　　　　　　
当GFR>8.5ml/min 时(n=32例),两者无相关关系。而当 GFR
<8.5ml/min(n=114例), SCRP与 GFR之间呈负的线性相关关
系(r= -0.863 , P =0.000)。这表明 CRF分期与 CRP具有相
关性 , 随着 CRF 肾功能损害程度的加重 , CRP值升高[ 11] , 同时
表明未透析肾衰患者不仅细胞因子升高 ,而且其升高与肾功能
不全程度呈正相关[ 12] 。
进一步以不同原发病分组以后 ,发现慢性肾小球肾炎组与
总体表现出同样的趋势 ,即该组就整体而言 SCRP与 GFR呈负
的相关关系(r= -0.849 , P =0.000);而当 GFR<8.5ml/min
时 ,两者存在明显的负的相关关系(r= -0.864 , P =0.000);
当GFR>8.5ml/min 时 , 两者无相关关系(r= -0.402 , P =
0.123)。而其他原发病组由于病例数较少均未表现出相关关
系。而且年龄 、体重等因素对 GFR与 SCRP之间的相关关系是
否成立无明显影响。
国际上多采用GFR<10ml/min 为开始透析的标准 , 本文选
择GFR 8.5ml/min 作为界值具有较高的灵敏度 、特异性 , 对制
定科学的开始透析时的肾功能标准具有重要的临床意义。针
对国内医疗保障制度尚不健全 、患者普遍由于费用考虑而推迟
透析开始时间的情况以及国内大多数医疗机构仍然采用血清
肌酐值作为决定透析开始时机的依据的现状 ,我们提倡采用肾
小球滤过率水平作为开始透析的依据并且最迟应该在 GFR<
8.5ml/min之前开始透析治疗。同时我们也注意到 CRP水平与
很多因素有关 ,它虽然不能完全反映 GFR水平 ,但从临床角度
出发 ,探讨其是否可作为一种辅助性的开始透析参考指标具有
一定的价值。
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收稿日期:2007-06-11;修回日期:2007-10-30
(上接第 31页)
感病毒)引起的急性上呼吸道传染病 , 具有传染性高 、传播迅
速 、易发生流行等特点。根据病毒核蛋白和基质蛋白抗原性的
差异 ,流行性感冒病毒分为 A型 、B型和 C 型 , A 型的病原性最
强 ,为人与鸡 、鸭 、猪 、马等动物共患[ 7] ;又根据血凝素(HA)和
神经氨酸酶(NA)的抗原性将其分成不同的亚型(HxNy)[ 8] 。由
于流感病毒的亚型变异速度很快 ,使得化学药物和流感病毒疫
苗难以发挥其最佳治疗和预防效果。目前国内外用于抗流感
病毒的药物有金刚烷胺与甲基金刚烷胺 、病毒唑和干扰素等 ,
由于其耐药性 、毒性等问题而影响了其临床应用。而中药在防
治流感方面具有一定的优势和广阔的发展前景 , 既有单味中
药 、也有经典复方 , 国内外在抗流感植物药的筛选研究方面已
取得了可喜的进步[ 9] 。
以猴耳环嫩枝叶的水提浸膏为原料的猴耳环单方制剂—
猴耳环消炎片 ,作为抗炎及呼吸道疾病治疗药物已得到广泛的
应用 ,但目前尚未见有关猴耳环抗流感病毒作用的研究报道 。
本实验研究表明:猴耳环水提取物在体外对流感病毒引起的细
胞病变有明显抑制作用 , 其 IC50为 3.33mg 生药/ml , TI 为 7.48;
在给药剂量为 8～ 20g生药/ kg时 , 对流感病毒致小鼠肺部炎症
有明显抑制作用 ,并能显著降低流感病毒感染小鼠的死亡率和
延长其存活时间 ,提示猴耳环水提取物在体内外均具有明显抗
流感病毒的作用。以上实验结果为猴耳环及其相关制剂的临
床应用提供了一定的实验依据。
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收稿日期:2007-10-29
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