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羊耳菊水提取物体外抑菌活性研究



全 文 :图 1 对照品及供试品高效液相色谱图
2.3  线性关系实验 分别精密称取水苏糖对照品 , 加水配制浓
度分别为 0.20, 0.40, 0.80, 1.60, 3.2 mg/ml的溶液 , 按色谱条件
分别进样 10 μl, 测得峰面积 , 以对照品浓度为横坐标 , 以峰面积
为纵坐标 , 得线性回归方程为:Y=100 409X-3 340.9, r=
0.999 5。结果表明水苏糖在 0.20 ~ 3.20 mg/ml时 , 浓度与峰面
积呈良好线性关系。
2.4  精密度和稳定性实验 取同一供试品溶液 , 按上述色谱条
件 , 重复进样 6 次 , 10 μl/次 , 测定水苏糖峰面积 , 其 RSD为
1.2%,表明此法的精密度良好。
取同一供试品溶液 , 并分别于 0, 3, 6, 9, 12, 24h, 按上述色谱
条件 , 进样 10 μl, 测定水苏糖含量 , RSD为 1.9%, 表明水苏糖在
24 h内稳定。
2.5 加样回收率实验 取供试品 6批 , 分别加入水苏糖对照品 1
或 2 mg,按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液 , 进样 , 计算
回收率 , 见表 1, 平均回收率为 99.91%, RSD为 1.20%。
2.6 样品的测定 取批号为 20080301, 20080302, 20080303,
20080304, 20080401, 20080402, 20070101, 20070102, 20070103的
ROS,按上述方法测定水苏糖含量 , 结果其水苏糖含量均在 9.0 ~
12.0 mg/ml之间。
表 1 回收率实验结果
供试品中水苏
糖含量 m/mg
水苏糖加
入量m/mg
水苏糖测
得量m/mg
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
10.781 5 1 11.773 9 99.24
11.084 1 1 12.078 2 99.41
11.079 3 1 12.070 1 99.08 99.91 1.20
11.011 8 2 13.039 8 101.4
11.020 1 2 13.057 3 101.86
10.978 8 2 12.967 9 98.45
3  讨论
水苏糖在 192 nm处有吸收 ,但由于在此波长下干扰大 ,灵敏
度差 , 因此选用了示差折光检测器 , 虽然灵敏度低受温度影响大 ,
但由于样品水苏糖的含量高 ,故灵敏度低的不足得到补偿。
作者也尝试了利用 C18柱及 NH2柱 ,对流动相进行了筛选 ,
但样品均未能进行基线分离。在选用专用分离糖的 RezexRPM
-MonosaccharidePb+ +8%色谱柱后分析效果良好。
参考文献:
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收稿日期:2009-01-24; 修订日期:2009-07-30
基金项目:湖南省教育厅科研项目(No.06C637)
作者简介:刘胜贵(1965-),男(汉族),湖南宁乡人 ,现任怀化学院教授 ,硕士学位 ,主要从事民族药用植物活性成分研究工作.
羊耳菊水提取物体外抑菌活性研究
刘胜贵 1, 2 ,李 军1 ,陈富成 1 ,刘 霞1 ,邓 乐 2
(1.湖南师范大学生命科学学院 ,湖南 长沙 410081; 2.怀化学院 ,湖南 怀化 418008)
摘要:目的 探讨羊耳菊不同器官水提取物的体外抑菌活性。方法 以金黄色葡萄球菌 、铜绿假单胞菌 、白色念珠菌等 10
种微生物为试验菌株 , 采用药敏纸片扩散法 、试管二倍稀释法 ,对羊耳菊水提取物进行抑菌试验。结果 羊耳菊全株各器
官都具有较强的抑菌作用 , 其中根对 10种供试菌种都有抑制作用 , 抑制范围最广;茎对 9种供试菌种有抑制作用 , 叶对 8
种供试菌种有抑制作用 。羊耳菊各器官对金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌的抑制作用最强。羊耳菊根 、茎 、叶对金黄色
葡萄球菌的 MIC值分别为 15.63, 62.5, 62.5 mg/ml, 而其抑菌圈直径分别为 14.3, 13.8, 13.5mm;羊耳菊根 ,茎 , 叶对铜绿
假单胞菌的 MIC值分别为 15.63, 31.25, 62.5 mg/ml,其抑菌圈直径分别为 15.8, 15.5, 14.0 mm。结论 羊耳菊水提取物
体外试验证实了该民间药物具有抗菌活性 ,也表明了羊耳菊是一种有开发潜力的新抗菌药物资源。
关键词:羊耳菊; 水提取物; 抑菌作用; 二倍稀释法; 药敏纸片扩散法
中图分类号:R284  文献标识码:A  文章编号:1008-0805(2009)12-3072-02
StudiesontheAntimicrobialActivitiesofAqueousfromInulacappaDCinvitro
LIUSheng-gui1, 2 ,LIJun1 ,CHENFu-cheng1 , LIUXia1 , DENGLe2
(1.ColegeofLifeSciences, HunanNormalUniversity, Changsha, 410081, China;2.DepartmentofLifeSci-
ences, HuaihuaUniversity, Huaihua, 418008, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheantibacterialactivitiesofaqueousextractsfromthediferentorgansofInulacappaDC.Meth-
odsByusingadisk-difusionandserialtwo-folddilutionsmethod, minimalinhibitoryconcentration(MIC)andinhibitorycir-
cleweredeterminedintheplantextractsagainst10 medicallyimportantbacterialstrains.ResultsTherootsofInulaCappashowed
astrongerandbroaderspectrumofantibacterialactivity.TherootsofInulaCappashowedastrongerandbroaderspectrumofanti-
bacterialactivity.Thestemsandtheleavesinhibited9, 8 of10 strainsrespectively.TheMICsoftheroot, stemandleafofInula
CappaagainstStaphylococcusaureuswere15.63, 62.5, 62.5 mg/ml, andthediametersoftheinhibitionzoneare14.3, 13.8, 13.
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5 mm;andtheMICsoftheroot, stemandleavesagainstPseudomonasaeruginosaare15.63, 31.25, 62.5 mg/ml, andthediame-
tersoftheinhibitionzonewere15.8, 15.5, 14.0 mm.TheaqueousextractsofthethreeorgansofInulaCappaDChadtheweakest
activitiesagainstEscherichiacoli, ProteusvulgarisandSalmonelaparatyphos.ConclusionThisinvitrostudycorroboratedthean-
timicrobialactivityoftheselectedplantsusedinfolkloricmedicineandalsoshowedthatInulaCappaDC.canbepotentialsources
ofnewantimicrobialagents.
Keywords:InulacappaDC;  Aqueousextracts;  Antimicrobialactivities;  Serialtwo-foldmethod;  Disk-difusionmethod
  植物是药品生产的重要源泉 ,我国民间使用的药用植物引起
了越来越多民族植物学家的重视 ,关于天然植物提取物抗菌活性
的研究已经取得了许多成果 [ 1, 2] 。 羊耳菊 InulacappaDC., 系菊
科旋覆花属植物 , 亚灌木 ,在我国南方分布较为广泛 ,主要生长在
亚热带和热带的低山和亚高山的湿润或干燥的丘陵地 、荒地 、灌
丛或草地 , 在酸性土 、砂土和粘土上都常见 , 海拔 500 ~ 3 200
m[ 3] 。羊耳菊味苦微辛 , 性平无毒 , 全草或根花供药用 [ 4] 。经过
调查了解 , 湖南通道县侗族民间常用其治疗疟疾 、痢疾 、风湿关节
疼痛 、泄泻 、产后感冒 、肝炎 、痔疮和疥癣 ,中兽医也常用来治疗牛
的痢疾。目前 , 国内 、外尚没有关于羊耳菊抑菌作用的研究报道。
本文研究表明 , 羊耳菊根 、茎 、叶各部分水提取物对病原菌有较强
的抑制作用 , 为羊耳菊的药用开发提供了科学依据。
1 材料
1.1 试验样品 羊耳菊全株 , 于 2006-12采自湖南通道侗族自
治县 , 经湖南师范大学生命科学学院刘克明教授鉴定 ,标本收藏
于怀化学院植物标本室。
1.2 供试菌种 大肠埃希氏杆菌(EscherichiacoliCVCC249),金
黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCCTCCAB91053), 白色念珠
菌(Candidaalbicans), 铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa),
普通变形杆菌(ProteteusvulgarisCCTCCAB91103),鼠伤寒沙门氏
菌(Salmonelatyphi), 鸡沙门氏杆菌(Salmonellagalinarium), 枯
草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),粪肠球菌(Enterococcusfaecalis),甲
型副伤寒沙门氏菌(Salmonelaparatyphosa),以上菌种均由怀化
学院微生物学实验室提供。
1.3 培养基 LB(Luria-Bertani)液体基:蛋白胨 10g, NaCl10g,
酵母粉 5 g, 用 1mol/LNaOH调节 pH 7.0, 蒸馏水定容至 1 000
ml。 LB固体培养基:在 LB液体培养基中加 1.6%的琼脂粉。
2 方法
2.1 水提取物制备 羊耳菊水提取物制备方法按照文献 [ 5]进行
改进。将羊耳菊的根 、茎 、叶洗净 ,于 60 ℃恒温箱中烘干至恒重 ,
用组织粉碎机粉碎后 20目过筛。分别称取 30g根、茎 、叶粉末 , 加
入 5倍体积的蒸馏水浸提 24 h, 每隔 2 ~ 3 h搅拌混匀 1次。浸提
后过滤两次, 上清液于 8 000 r/min离心 15 min,去除沉淀 , 并将药
液浓缩至 30ml,相当于含生药 1 g/ml,灭菌后 4 ℃保存备用。
2.2 菌悬液制备 将供试菌种分别接种在 LB培养基上 , 37℃活
化培养 24h,挑取活化后的菌落与无菌生理盐水中混合 , 并用生
理盐水调至 0.5McFarland单位的标准接种物 [ 6] ,即为 1 ~ 2×108
CFU/ml的菌悬液浓度。再用无菌生理盐水按 10倍稀释法将标
准接种物配成 106 CFU/ml的菌悬液。
2.3 羊耳菊抗微生物活性试验 将滤纸打成直径为 6 mm的圆
形滤纸片 ,灭菌 、烘干后放入羊耳菊根 、茎 、叶的水提取物中充分
浸泡 , 取出后低温干燥 , 制成药敏纸片。吸取 0.1 ml浓度为 106
CFU/ml的菌悬液于 LB平板中央 , 用玻璃涂棒将菌液均匀涂布
于平板上。含菌平板倒置干燥约 30 min后 , 用镊子取药敏纸片
均匀贴在平板上 , 每个平板贴 3个药敏纸片。 20 min后 , 放入
37℃恒温培养箱中倒置培养 24 h[ 7 , 8] 。测量抑菌圈直径 , 以上实
验重复 3次。
2.4 最低抑菌浓度(MIC)测定 在无菌条件下 , 将无菌试管分
成 3大组 80支 , 80支试管再分成 10小组 , 每组 8支试管。第 1
支试管加入 1 ml2倍浓度的 LB液体培养基 , 其余各支试管加入
1 mlLB液体培养基 , 再向第 1支试管中加入 1 ml药液后按二倍
稀释法 , 使各管中的药液浓度分别为 0.5, 0.25, 0.125, 0.062 5,
0.031 25, 0.015 60, 0.007 8, 0.003 9 g/ml。将培养物置于 37℃
恒温培养箱中培养 24 h。观察培养物生长情况 , 测定 MIC值 [ 9] 。
以上实验重复 3次。
3 结果
3.1 羊耳菊各器官抗微生物作用 以三次重复试验的平均值计
算植物提取物抑菌圈直径(包含药敏纸片部分)。结果见表 1。
表 1 羊耳菊各器官对供试菌种的抑制作用 mm
菌种 羊耳菊不同器官抑菌圈直径根 茎 叶
大肠埃希氏杆菌 - - -
金黄色葡萄球菌 14.3 13.8 13.5
白色念珠菌 10.5 11.0 10.8
铜绿假单胞菌 15.8 15.5 14.0
普通变形杆菌 8.3 8.3 8.0
鼠伤寒沙门氏杆菌 8.5 8.5 8.0
鸡沙门氏杆菌 6.2 6.3 6.3
枯草芽孢杆菌 10.3 10.2 9.7
粪肠杆菌 8.7 8.5 8.5
甲型副伤寒沙门氏菌 6.2 6.3 6.3
  “ -”:无抑菌圈
除大肠杆菌外 ,羊耳菊各器官提取物对所有试验菌都显示了
抗菌活性。根 、茎 、叶提取物对铜绿假单胞菌抑菌作用最强 ,抑菌
圈直径分别为 15.8, 15.5, 14.0mm;其次是金黄色葡萄球菌和枯
草芽孢杆菌 , 对真菌白色念珠菌有较强的抑菌活性;但对大肠杆
菌无抑制活性 , 对鼠伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏杆菌抑菌
活性较弱。
3.2 羊耳菊各器官的最低抑菌浓度(MIC)羊耳菊根 、茎 、叶对
试验菌的抑制作用见表 2 ~ 4。
表 2 羊耳菊根对供试菌种的抑制作用
菌种
不同羊耳菊根浓度实验结果
500
mg·ml-1
250
mg·ml-1
125
mg· ml-1
62.50
mg· ml-1
31.25
mg· ml-1
15.60
mg· ml-1
7.80
mg· ml-1
3.90
mg· ml-1
大肠埃希氏杆菌 - + ++ +++ +++ +++ +++ +++
金黄色葡萄球菌 - - - - - - + ++
白色念珠菌 - - - - + ++ +++ +++
铜绿假单胞菌 - - - - - - + ++
普通变形杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
鼠伤寒沙门氏杆菌 - - - - + ++ +++ +++
鸡沙门氏杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
枯草芽孢杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
粪肠杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
甲型副伤寒沙门氏菌 - - - + ++ +++ +++ +++
  “ -”:无菌生长 , “ +”:少数几个菌落生长 , “ ++”:菌落生长稀疏 , “ +++”:
菌落生长致密
表 3 羊耳菊茎对供试菌种的抑制作用
菌种
不同羊耳菊根浓度实验结果
500
mg·ml-1
250
mg·ml-1
125
mg· ml-1
62.50
mg· ml-1
31.25
mg· ml-1
15.60
mg· ml-1
7.80
mg· ml-1
3.90
mg· ml-1
大肠埃希氏杆菌 + ++ ++++++ +++ +++ +++ +++
金黄色葡萄球菌 - - - - + ++ +++ +++
白色念珠菌 - - - - + ++ +++ +++
铜绿假单胞菌 - - - - - + ++ +++
普通变形杆菌 - - + ++ +++ +++ +++ +++
鼠伤寒沙门氏杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
鸡沙门氏杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
枯草芽孢杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
粪肠杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
甲型副伤寒沙门氏菌 - - + ++ ++ +++ +++ +++
  “ -”:无菌生长 , “ +”:少数几个菌落生长 , “ ++”:菌落生长稀疏 , “ +++”:
菌落生长致密
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.12 时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期
表 4 羊耳菊叶对供试菌种的抑制作用
菌种
不同羊耳菊根浓度实验结果
500
mg· ml-1
250
mg· ml-1
125
mg· ml-1
62.50
mg·ml-1
31.25
mg· ml-1
15.60
mg· ml-1
7.80
mg· ml-1
3.90
mg·ml-1
大肠埃希氏杆菌 + ++ ++++++ +++ +++ +++ +++金黄色葡萄球菌 - - - - + ++ +++ +++
白色念珠菌 - - - + ++ ++ +++ +++
铜绿假单胞菌 - - - - + ++ ++ +++
普通变形杆菌 - + ++ ++ +++ +++ +++ +++
鼠伤寒沙门氏杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++
鸡沙门氏杆菌 - - + ++ ++ +++ +++ +++
枯草芽孢杆菌 - - - + ++ +++ +++ +++粪肠杆菌 - - + ++ +++ +++ +++ +++
甲型副伤寒沙门氏菌 - + ++ ++ +++ +++ +++ +++
  “ -”:无菌生长 , “ +”:少数几个菌落生长 , “ ++”:菌落生长稀疏 , “ +++”:
菌落生长致密
羊耳菊根对 10种供试菌种都有抑制作用 ,抑制范围最广;羊
耳菊茎对 9种供试菌种有抑制作用;羊耳菊叶只对 8种供试菌种
有抑制作用 , 抑制范围略窄。总体来看 , 羊耳菊的抑菌谱比较广 ,
而比较各器官的抑菌作用效果依次为为:根 >茎 >叶。
从 10种供试菌种来看 ,羊耳菊根、茎、叶提取物对铜绿假单胞
菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最强 ,其次是鼠伤寒杆菌 、枯草芽
孢杆菌 、粪肠球菌和鸡沙门氏菌 , 羊耳菊根 、茎 、叶对铜绿假单胞菌
的 MIC值分别为:15.63, 31.25, 62.5mg/ml;羊耳菊根、茎 、叶对金
黄色葡萄球菌的 MIC值分别为:15.63, 62.5, 62.5 mg/ml。羊耳菊
的各器官水提取物对真菌白色念珠菌也有较强的抑制活性 ,但对
大埃希氏杆菌 、甲型副伤寒沙门氏杆菌的抑制作用较弱。
4 讨论
由于抗生素的滥用 ,耐药性细菌引起的传染性疾病越来越来
严重 , 寻找新的抗菌药物已成为药物研究的热点。从少数民族本
土传统中草药中筛选新的抗菌药物是药物研究与开发的有效途
径 , 并已取得了进展 [ 2] 。 本实验使用的羊耳菊是湖南侗族人民
常用药物 , 主要用于治疗痢疾 、泄泻 、肝炎 、痔疮和疥癣 , 但国内 、
外文献均未对其抑菌作用研究报道。通过实验研究 ,进一步证实
了其民间用羊耳菊治疗细菌性感染的科学依据 ,并为开发新的抗
菌药物奠定了科学基础。
由于水分子极性高 ,是糖类 、糖蛋白、花青素 、酚类化合物 、生物
碱等许多植物次生代谢物的良好溶剂, 这些化合物可能是抗微生物
的活性物质 [ 10] 。羊耳菊根 、茎、叶水提取物具有良好的抗微生物作
用 ,也说明民间使用羊耳菊煎煮汁治疗感染性疾病的科学性。
本项研究使用药敏纸片扩散法和试管二倍稀释法分别测定
了微生物抗菌活性 ,显示了两种试验结果相关性。药敏纸片扩散
法结果取决于抗菌有效成分的溶解性和在琼脂培养基内的扩散
性 , 是一种半定量的研究方法 , 是初步筛选抗菌植物有效途径。
试管二倍稀释法则是一种精确测定抗菌活性的方法。
本实验研究结果表明 , 羊耳菊对金黄色葡萄球菌 、铜绿假单
胞菌 、白色念珠菌的抑制效果较强 , 但对大肠杆菌 、变形杆菌 、沙
门氏杆菌的抑菌效果稍弱。这说明羊耳菊在治疗由金黄色葡萄
球菌引起的肠炎 、铜绿假单胞菌引起的肺炎和白色念珠菌引起的
皮肤病等方面有较好的应用价值 , 但对由大肠杆菌 、沙门氏菌引
起的腹泻和肠道疾病则不适宜。
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收稿日期:2008-12-15; 修订日期:2009-07-31
基金项目:云南省社会发展科技计划项目(No.2007C083M)
作者简介:王元忠(1981-),男(傈僳族),云南兰坪人,现为中国农业科学院研究生院在读硕士研究生 ,主要从事植物化学及资源真菌开发与利用研究工作.
*通讯作者简介:李 涛(1976-),男(汉族),云南罗平人 ,现任玉溪师范学院资源环境学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事药用真菌教学与研究工作.
绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性
和有效成分定量分析研究
王元忠1, 2 ,刘鸿高3 ,张金渝 1 ,李 涛4*
(1.云南省农业科学院药用植物研究所 ,云南昆明 650223; 2.中国农业科学院研究生院 ,北京 100081;
3.云南农业大学 ,云南 昆明 650201; 4.玉溪师范学院资源环境学院 ,云南 玉溪 653100)
摘要:目的 建立绒柄牛肝菌的反相高效液相色谱定性和定量分析方法。方法 反相高效液相色谱(RP-HPLC)Planetsil
C18分析柱(150mm×4.6mm, 5 μm),流动相为甲醇 -水(15∶85),流速为 1.0ml· min-1 ,检测波长为 261nm, 柱温为室
温。对绒柄牛肝菌有效部位(甲醇提取部位)进行指纹图谱定性分析 , 对绒柄牛肝菌中的有效成分腺苷进行定量测定。
结果 在色谱条件下 , 11份不同绒柄牛肝菌中甲醇有效部位的 RP-HPLC指纹图谱中可检出 11个相对稳定的色谱峰 , 其
中确定出 9个共有峰作为定性鉴别的指标峰;绒柄牛肝菌中腺苷的含量为 0.146% ~ 0.493%。结论 绒柄牛肝菌有效部
位 RP-HPLC指纹图谱定性和有效成分定量分析方法具有较强的针对性和准确性 ,可用于绒柄牛肝菌及药用真菌的质
量控制。
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.12