全 文 ：HPLC法测定黄珠子草中槲皮素的含量
贵阳中医学院第二附属医院(550003) 谢 珊 麻秀萍* 贾宪生*
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1000-744X(2006)12-1130-02
注:*贵阳中医学院
黄珠子草为大戟科叶下珠属植物黄珠子草(Phy llanthus
Virg atus For st. ), 在贵州省广泛分布 , 具有清热 、解毒 、明目
等功效 ,主要用于治疗泌尿系感染 、痢疾肠炎和黄疸型肝炎
等[ 1] 。药理研究表明叶下珠属植物具有抗乙肝病毒作
用[ 2 ～ 4] ,经试验黄珠子草对四氯化碳诱导大鼠肝损伤具有保
护作用[ 5] 。黄珠子草的化学成分报道含有以槲皮素为甙元
的黄酮类成分[ 6] 。为了更好地开发利用该药用资源 , 本文建
立了测定黄珠子草中槲皮素的 H PLC 方法 , 实验结果证明 ,
其方法简便 、重现性良好。
1 仪器与试药
美国 Agilent-1100高效液相色谱系统(二极管阵列检测器 ,
自动进样器、二元泵、柱温箱, 液相色谱工作站);槲皮素对照品
由中国药品生物制品检定所提供,甲醇为色谱纯,其它试剂均为
分析纯,水为纯净水。
黄珠子草药材产地为贵州省金沙县 ,经本院杨锦刚教授鉴
定为大戟科叶下珠属植物黄珠子草 Phyllanthus Virg atus Fo rst. 。
图 1 A 为槲皮素对照品的色谱图 B 为黄珠子草的色谱图
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 采用 ZORBAX SB C18柱 , 4. 6 mm ×150
mm(Agilent 公司), 甲醇-0. 4%磷酸(50∶50)为流动相 , 流
速:1 ml /min , 柱温:30℃, 检测波长:360 nm。 在上述条件
下 ,样品中槲皮素达到基线分离 , 且样品中其它组分色谱峰
无干扰(见图 1)。
2. 2 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品适量 , 精密称定 ,
加甲醇溶解 ,制成每 1 m l含 0. 0456 mg 槲皮素的对照品溶
液。
2. 3 供试品溶液的制备 精密称取黄珠子草粗粉 2. 0 g , 加
70%乙醇 20 ml , 水浴上回流提取 1 h , 放冷 , 过滤 , 滤渣用
70%乙醇 10 ml分次洗涤 ,合并滤液和洗液 , 回收溶剂至干 ,
残渣用水 10 ml溶解 ,加浓盐酸 1 ml , 使 pH 值为 1 ～ 2 ,水浴
上加热水解 1 h , 放冷 , 转移至分液漏斗中 , 用水饱和的醋酸
乙酯萃取 3次 , 每次 10 ml ,合并醋酸乙酯萃取液 ,用水萃取 1
次 ,弃去水层 , 醋酸乙酯回收溶剂至少量 , 转移至 10 ml容量
瓶中 ,定容 , 作为供试品溶液。
2. 4 线性关系考察 精密称取槲皮素 11. 4051 mg 置 25 ml
容量瓶中 ,加甲醇至刻度 , 分别精密吸取0. 2 , 0. 6 , 1. 0 , 1. 4 ,
1. 8 ml ,置 10 ml容量瓶中 , 用甲醇稀释至刻度 ,摇匀 , 作为系
列对照品溶液 ,取上述对照品溶液 ,分别各进样 5 μl , 以槲皮
素峰面积值与进样量进行回归 ,得回归方程(n=5):
Y=0. 000272x + 0. 00211 r=0. 9999
表明槲皮素进样量在 0. 0456～ 0. 4104μg 范围内线性良
好。
2. 5 精密度试验 取槲皮素对照品溶液 , 按照“色谱条件”
中的方法测定 , 分别重复进样 6 次 , 测得峰面积平均值为
835. 7573 , RSD为 0. 21%, 表明精密度良好。
2. 6 重复性试验 分别取黄珠子草药材粉末 6 份 ,按“供试
品溶液的制备”操作 , 制备 6 份供试品溶液 , 按上述“色谱条
件”测定槲皮素含量 , 平均值为1. 16 mg /g , RSD为 0. 53%,
表明方法重复性良好。
2. 7 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10
h 测定峰面积 ,峰面积平均值为837. 3026 , RSD为 0. 29%, 结
果表明槲皮素在 10 h 内稳定。
2. 8 回收率试验 取已知含量的黄珠子草粉末 6 份 , 每份
1130 Guizhou Medical Journal , 2006 , Vo l. 30 , No. 12
0. 5g ,精密称定 , 分别精密加入槲皮素对照品溶液(0. 558
mg /ml)1. 0 ml , 按“供试品溶液制备方法”操作 , 在上述“色谱
条件”下进样 5 μl , 计算回收率 ,结果见表 1。
表 1 加样回收试验结果 (n=6)
序号 样品中槲皮素的量(mg)
加入槲皮素
的量(mg)
测得槲皮素
的量(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1 0. 5874 0. 558 1. 1410 99. 21
2 0. 5859 0. 558 1. 1350 98. 41
3 0. 5889 0. 558 1. 1325 97. 42 97. 89 0. 64
4 0. 5834 0. 558 1. 1278 97. 56
5 0. 5860 0. 558 1. 1175 95. 25
6 0. 5850 0. 558 1. 1409 99. 46
2. 9 样品测定 按上述方法制备供试液 ,取供试液和对照
品溶液各 5μl , 注入液相色谱仪 ,测定了三个不同来源的黄珠
子草药材槲皮素的含量 ,结果见表 2。
表 2 不同来源黄珠子草中槲皮素的含量 (n=3)
来源 含量(%) 平均含量(%) RSD(%)
兴义 0. 119 0. 119 1. 18
0. 117
0. 120
贞丰 0. 119 0. 120 1. 86
0. 123
0. 120
贵阳 0. 133 0. 134 1. 18
0. 134
0. 136
3 讨 论
3. 1 黄珠子草中除了含有黄酮类成分外 ,还含有多酚类 、鞣
质类等其它成分 ,本研究分别考察了几种不同提取方法:(1)
酸水提取→有机溶剂萃取法;(2)稀醇提取→水解→有机溶
剂萃取法;(3)95%乙醇提取→聚酰胺柱层析法制备供试液 ,
经比较 ,用 70%乙醇提取黄酮类较为完全 , 再水解得到槲皮
素 ,其它成分干扰小。
3. 2 检测波长的选择 在 200 ～ 400 nm 波长范围内测定槲
皮素的吸收曲线 , 在 360 nm 波长处为最大吸收 , 因此采用
360 nm 作为检测波长。
3. 3 流动相的选择 比较了甲醇 -盐酸(0. 1 mol /L)(80∶
20),水 -甲醇- 冰醋酸(55∶45∶1),甲醇-0. 4%磷酸(50∶
50)等流动相 , 以甲醇-0. 4%磷酸(50∶50)系统对待测成分的
分离效果较好。
3. 4 本文建立的采用高效液相色谱法测定黄珠子草中槲皮
素含量的方法 ,可以较好地反映黄珠子草中黄酮类成分的含
量 ,结果准确 , 重复性良好 ,对于黄珠子草的质量控制有一定
的应用意义。
参考文献
1 江苏新医学院.中药大辞典[ M] .上海人民出版社 , 1977. 2 582.
2 仲英 ,左春旭. 叶下珠化学成分及其抗乙肝病毒活性的研究[ J] .
中国中药杂志 , 1998 , 23(6):363.
3 陈征途.三种叶下珠属植物在体外细胞培养中抗 HBV 活性的初
步研究[ J] .广州中医药大学学报 , 1997 , 14(2):102.
4 曹慰祖.叶下珠治疗慢性乙型肝炎病毒携带者的临床观察[ J] . 上
海中医药杂志 , 1996 ,(5):8.
5 谢珊 ,贾宪生.贵州产黄珠子草总黄酮毒性及抗 CCl4 , AAP 中毒
小鼠肝损伤试验[ J] .贵州医药 , 2005 , 29(1):74.
6 谢珊 ,贾宪生 ,杨基森.黄珠子草的化学成分研究[ J] . 贵州医药 ,
2001 , 25(5):469.
消 息
贵州省医学会骨科学分会 2007年学术会议征文通知
贵州省医学会骨科学分会学术会议拟定于 2007年 6 月 6 ～ 14 日召开 ,地点另行通知。 与会者可获贵州省Ⅰ 类继续教育
学分 ,论文汇编成集。现将征文的相关事宜通知如下:一 、征文内容:创伤外科 、脊柱外科 、关节外科 、骨肿瘤 、微创外科等临床
研究以及骨科相关基础研究。二 、来稿要求:(1)未公开发表的文章 , 3 000 字以内全文及 800 字以内摘要各一份 , 请注明作者
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1131 贵州医药 2006 年 12月第 30 卷第 12期