全 文 ：收稿日期:2006-09-06;　修订日期:2006-12-10
基金项目:广东省肇庆市科技局资助项目(No. 203E501)
作者简介:段志芳(1973-),女(汉族),河南安阳人 ,现任广东省肇庆学院
讲师 ,博士学位 ,主要从事天然产物化学研究与开发工作.
溪黄草多糖含量测定与活性研究
段志芳
(广东省肇庆学院生物学系 ,广东 肇庆　526061)
摘要:目的 研究溪黄草多糖含量及其对羟自由基的清除作用和抑菌作用。 方法 从溪黄草中提取精制多糖 , 测定出溪
黄草多糖对葡萄糖的换算因子 ,用蒽酮-硫酸法比色测定计算多糖的含量;采用 Fenton反应体系为模型 ,研究多糖对羟自
由基的抑制作用;采用滤纸片法研究多糖的体外抑菌作用。结果 溪黄草多糖含量为 4. 18%,重现性 、稳定性和回收率较
好;活性测试结果表明溪黄草多糖对羟自由基有较好的清除作用 , 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有一定的抑菌效果。结
论 溪黄草多糖含量测定方法简单可行 , 具有一定清除自由基和抑菌活性。
关键词:溪黄草;　多糖;　含量测定;　羟自由基;　抑菌作用
中图分类号:TS202　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)04-0802-02
Research on ContentDeterm ination and Activities of Polysaccharide from Rabdosia serra
(M axmi . )Hara
DUAN Zhi-fang
(Department of B iology, Zhaoqing College, Zhaoqing , 526061, China)
Abstract:Objective To study the con tent of polysaccha ride from Rabdosia serra (M ax im. )H ara and its effe ct on hydroxy l free
radica l and anti-bac te rio sta tic e ffec.t Methods Polysaccha ridew as extracted from Rabdosia serra (M axim. )H ara, and its content
w asm easured byw ay o f anthronesulphuric acid. Its inh ibitory effect on hydroxy l free rad ica lw as studied by Fenton reaction sy stem
as a mode.l Its anti-bac te rio sta tic e ffec t wa s a lso studied. R esu lts The re search showed tha t po ly saccha ride conten t o fRabdosia
serra (M ax im. ) H ara reached 4. 18%. It had inhib itory e ffec t on hydroxy l free radica l, staphy lococcus aureus and B. subtili.
Conc lu sion The me thod o f measuring po ly saccharide content is sim ple and re liable. The po ly saccharide has som e activ ities.
Key words:Rabdosia serra (M axim. ) Hara;　Po lysaccha ride;　C on tent de te rm ina tion;　Hydroxy l free radica l;　An ti-bac te-
riosta tic e ffect
　　溪黄草 Rabdosia serra (M ax im. ) H ara为唇形科香茶菜属植
物 ,是一种多年生小草本。具有清热袪湿 、凉血散淤之功效 ,民间
用于治疗急性肝炎 、急性胆囊炎、跌打淤肿等症 [ 1] 。多糖是一类免
疫活性物质, 具有抗菌 、抗病毒 、抗寄生虫、抗肿瘤 、抗辐射 、抗衰老
等作用 [ 2 ～5] 。目前对溪黄草多糖的研究未见报道。本文建立石油
醚去脂-80%乙醇去杂-热水提取-氯仿 、正丁醇去蛋白质-活性炭去
色素-乙醇沉淀的提取工艺 , 从溪黄草中提取多糖, 测得溪黄草多
糖对葡萄糖的换算因子, 用蒽酮-硫酸比色法测定并计算出溪黄草
多糖含量 ,根据实验条件研究了其对羟自由基的清除作用和体外
抑菌作用 ,期望为肇庆山区中药材的综合开发利用提供一些参考。
1　器材
1. 1 　仪器 D J-10A倾倒式粉碎机 、A2004N和 FA2004N电子天
平 、RE-52AA旋转式蒸发器 、HH - 4型数显恒温水浴锅 、低温冰
柜 、脂肪抽出装置 、电热恒温真空干燥箱 、 752 分光光度计 、
UVP robe-2550型紫外可见光光度计 、电热手提压力蒸气消毒器 、
水式热恒温培养箱。
1. 2　 材料 溪黄草购于肇庆中药材市场;大肠杆菌(Escherich ia
coil)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(S tapphy
locacus aureus)、黑曲霉 (Asperg illus niger)、酵母菌(Yeast fungus)
均由肇庆学院生物学系微生物室提供。 (细菌于牛肉膏蛋白胨
培养基上活化(37℃, 24 h);霉菌于查氏培养基上活化 (28℃, 48
h);酵母菌于无菌水中活化(28℃, 4 h)。
1. 3　试剂 蒽酮 、浓硫酸 、硫脲 、水杨酸 、过氧化氢 、硫酸亚铁 、无
水乙醇 、丙醇 、石油醚 、乙醚 、氯仿 、正丁醇等为国产分析纯。
2　方法与结果
2. 1　溪黄草多糖的提取与精制 称取溪黄草粉末 60 g, 置脂肪抽
出装置中 , 加入石油醚 (60 ～ 90℃)250 m l, 回流脱脂。滤渣挥干
溶剂后 ,加入 80%乙醇回流提取 2次(1. 5 h /次)。将滤渣挥干溶
剂后加蒸馏水 400 m l, 回流提取 1 h。取滤液 , 滤渣再加蒸馏水
300 m l提 1次 ,将两次所得滤液合并 , 减压浓缩至一定体积。 加
入氯仿-正丁醇液(4∶1)轻摇 , 静置取多次 ,除去蛋白质。水溶液
中加入适量活性碳 60℃保温 30 m in, 过滤 , 滤液冷却后加入乙
醇 , 使乙醇浓度达 85%, 放置 4℃冰箱中过夜。抽滤 , 沉淀依次用
95%乙醇 、丙醇 、乙醚各洗 3次 , 真空干燥至恒重 , 即得精制溪黄
草多糖 ,密封保存备用。
2. 2　样品中溪黄草多糖含量测定
2. 2. 1　标准溶液的配制 精密称取 105℃干燥至恒重的葡萄糖
标准品 0. 200 0 g, 置 100 m l容量瓶中 ,加蒸馏水溶解并稀释至刻
度;摇匀 , 制成 2. 00 0 m g /m l的标准溶液 , 然后分别移取 0. 2,
0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0 m l标准溶液。置于 10 m l容量瓶中 , 以蒸馏水
定容至刻度 ,摇匀 、配成系列标准溶液。
2. 2. 2　蒽酮-硫酸试液的配制 称取 0. 200 0 g蒽酮和 1. 00 0 g
硫脲 , 加入 100 m l浓硫酸 , 置于棕色瓶中 , 混合摇匀至暗处备用
(现配现用)。
2. 2. 3　标准曲线的绘制 分别准确移取系列标准溶液 1 m l于具
塞试管中(各平行 3份 ),以 1 m l蒸馏水作空白 , 各加入 5 m l蒽酮
试剂(立即摇匀 ,置冰水浴中 ),加完后一起沸水浴 8 m in, 取出流
水冷却 ,室温静置 10 m in, 于 620 nm 处测定吸光值 , 以吸光值
(A)对葡萄糖浓度 (C)作回归处理 , 得回归方程:A =3. 359C -
0. 011 19, r=0. 999 8。
2. 2. 4　换算因子的测定 精密称取 2. 1项下所得精制多糖 10
m g,置 100 m l容量瓶中 , 加蒸馏水溶解并稀释至刻度 , 摇匀。 精
密吸取此液 1. 0 m l置 10 m l容量瓶中 ,加蒸馏水稀释至刻度摇匀
作贮备液。精密吸取贮备液 2. 0 m l,用标准曲线项的方法测吸光
值 , 从回归方程中求出多糖供试液中葡萄糖浓度 , 按下式计算 , 测
得换算因子 F =5. 364。
换算因子 F =w /c×d [w为多糖含量 (m g), c为多糖稀释液
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时珍国医国药 2007年第 18卷第 4期 LISH IZHEN MEDIC INE AND MATERIA M ED ICA RESEARCH 2007VOL. 18 NO. 4　
中葡萄糖浓度 mg m/ l, d为多糖的稀释因素 ]
2. 2. 5　样品溶液的制备 精密称取溪黄草粉末 0. 5 g(过 60目
筛 、平行 3份)置三角瓶中 , 加 80%乙醇 30 m l, 回流提取 1 h,趁
热过滤 , 残渣用热乙醇洗涤(8 m l×3次)。残渣连同滤纸置三角
瓶中 , 加入 40 m l蒸馏水回流提取 1 h, 趁热过滤 , 残渣用热水洗
涤(8 m l×3次 ),洗液并入滤液中 , 置冷后定容于 100 m l容量瓶
中 , 摇匀备用。
2. 2. 6　样品中溪黄草多糖含量测定 精密吸取样品溶液 2. 0 m l
同 2. 2. 3项方法操作 ,测定供试液中葡萄糖含量。按下式计算样
品中多糖的含量:多糖含量(%)=C. D. F W/ ×100 [ C为供试液
中葡萄糖浓度(m g /m l),D 为供试液的稀释因素 , F 为换算因子 ,
W 为供试样品重量(mg)] 。其结果见表 1。
表 1　溪黄草中多糖含量测定结果
样品号 W
m /mg
C
C /mg m l- 1
含量
(%)
平均含量
(%)
RSD
(%)
1 501. 1 0. 078 4 4. 193 7
2 501. 3 0. 078 1 4. 176 1 4. 182 5 1. 7
3 501. 1 0. 078 1 4. 177 7
　　n=3
2. 2. 7　重现性实验 精密称取过 60目筛的溪黄草粉末 0. 5 g 5
份 , 按 2. 2. 5项方法制取 5份样品溶液。精密吸取样品液 2. 0
m l, 同 2. 2. 3项方法测定吸光值 , 计算其多糖含量。结果见表 2。
表 2　溪黄草多糖含量测定重现性实验结果 %
样品号 多糖含量 平均含量 RSD
1 4. 105 4
2 4. 140 7
3 4. 082 1 4. 182 6 2. 26
4 4. 329 4
5 4. 255 5
　　n=5
2. 2. 8　稳定性实验 精密吸取 2. 2. 5项中样品溶液 2. 0 m l于具
塞试管中 , 按 2. 2. 3项方法测定吸光值 , 每隔 1 h测定 1次 ,连续
4次考察其稳定性。结果见表 3。
表 3　溪黄草多糖稳定性实验结果
时间(h) 样品吸光值 RSD(%)
0 0. 249
1 0. 250
2 0. 251 0. 56
3 0. 253
4 0. 252
　　n=5
2. 2. 9　回收率的测定 精密称取溪黄草粉末 0. 5 g 3份 , 各加入
精制多糖 20 m g,按 2. 2. 5项样品溶液的制备和 2. 2. 3项方法测
定吸光值。计算回收率 , 结果见表 4。
表 4　加样回收率测定
样品号 取样量
m /g
加入精制
多糖量 m /g 吸光度
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1 0. 504 4 0. 024 3 0. 591 98. 7
2 0. 503 1 0. 023 6 0. 589 99. 3 99. 4 1. 28
3 0. 505 5 0. 023 2 0. 594 100. 9
　　n =3
2. 3 　溪黄草多糖活性研究
2. 3. 1　溪黄草多糖对羟自由基的清除作用 将 2. 1项下溪黄草
多糖配制成不同浓度的水溶液 ,采用固定反应时间法 ,在相同体积
的反应体系(8. 8 mmo l /L H2O2 1 m l, 9 mm ol /L Fe2+ 1 m l, 9 mm ol /
L水杨酸 -乙醇溶液 1m l)中分别加入一系列不同浓度的多糖液。
并以蒸馏水为参比 ,与试剂空白液比较 ,在 λ=510 nm处测量各浓
度下的吸光度。计算被测物对羟自由基的清除作用。结果见
图 1。
清除率(%)=(A0 -Ax) /A0 ×100
图 1　多糖水溶液对羟自由基的清除作用
2. 3. 2　溪黄草多糖的抑菌作用 采用滤纸片法:将滤纸片灭菌 、
烘干 , 放到不同浓度的溪黄草多糖水溶液中浸泡 2 h。将活化好
的各供试菌种用无菌水分别稀释制成含菌数约 1 000 cfu /m l菌
悬液 , 于固体培养基上制成含菌平皿 , 放置 10 m in, 待菌液稍渗入
培养基后 ,每个平皿呈 “ +”形对称放置 5片圆滤纸片 , 正中间的
滤纸片浸双蒸水作为参照 , 其余 4片浸多糖水溶液 , 每个浓度每
种菌平行做 4个样 , 每个皿做 3次重复。然后把培养皿放到培养
箱培养 。培养结束后测定各供试菌的抑菌圈直径大小。结果见
表 5。
表 5　溪黄草多糖水溶液的抑菌效果
多糖浓度 供试菌种 l /mm金黄色葡萄球菌　枯草杆菌　大肠杆菌　面包酵母　黑曲霉
10. 0% 3. 0 3. 5 3. 3 2. 2 1. 5
5. 0% 2. 6 3. 3 0. 4 1. 7 1. 1
2. 5% 2. 4 2. 6 - 0. 6 -
1. 0% 1. 7 0. 5 - - -
0. 5% 1. 5 - - - -
牛肉膏蛋白胨培养基 pH为 7. 0;麦氏琼脂培养基 、察氏培养
基 pH为自然;表中数据为 3次(每次 4个样)重复平行实验的平
均值。
3　讨论
实验 2. 1项中醇沉下来的白色物质 , 经紫外光谱检测在 260
～ 280 nm处未见到核酸和蛋白质的吸收峰;在 280 nm 处吸光值
低于 0. 03, 说明所提物中基本不含蛋白质杂质。经硫酸-苯酚颜
色反应为棕红色 ,与硫酸 -蒽酮试剂反应呈深绿色 ,证明所提物
质为多糖。实验 2. 2. 5项中首先用 80%乙醇回流以除去醇溶性
的干扰成分防止其成为多糖中的杂质 , 再用水提取多糖成分 , 提
取效果较好。
多糖是中草药的有效成分之一 ,而多糖多无法直接测定 。本
文利用多糖在硫酸的作用下水解成单糖分子 ,并迅速脱水生成糖
醛衍生物 ,然后与蒽酮生成深绿色化合物 , 以比色法测定其含量。
结果表明 ,此方法简便 , 供试液显色稳定 、重现性好。
在羟自由基产生体系中加入多糖溶液时 ,有色产物的生成量
会随着多糖浓度的增大而不断减少 ,即随着多糖浓度的增大清除
率也增大。实验结果表明溪黄草多糖对羟自由基有一定清除作
用 , 且与溪黄草多糖的浓度成正相关性。由于本文所采用的自由
基模型体系所产生的自由基浓度远大于体内该自由基的浓度 , 可
见它是良好的自由基清除剂。
采用滤纸片法研究不同浓度的溪黄草多糖水溶液对金黄色
葡萄球菌 、枯草杆菌 、大肠杆菌 、酵母菌和黑曲霉的抑菌作用 。从
表 5中可以看出该多糖水溶液对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有
一定的作用 , 并且浓度越高抑菌效果越好;5. 0%浓度时对大肠
杆菌有作用 , 2. 5%浓度时对面包酵母有作用 , 5. 0%浓度时对黑
曲霉有作用。
参考文献:
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LISH IZHEN MED IC INE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2007VOL. 18NO. 4 时珍国医国药 2007年第 18卷第 4期