全 文 :收稿日期:2012 - 11 - 12;修回日期:2012 - 12 - 08
基金项目:贵州省中药现代化科技产业研究开发专项[黔科合中药字(2010)5041 号]
作者简介:闫吉美(1971 -) ,女,贵州遵义人,在职硕士研究生,研究方向:植物生理与组织培养。Email:414805045@ qq. com
* 通讯作者:赵德刚。Email:degangzhao@ yahoo. com
头花蓼组培快繁体系的建立*
闫吉美1,2,3,刘世会1,3,龙凤荣4,赵德刚1,3*
(1.贵州大学 生命科学学院,贵州 贵阳 550025;2.遵义师范学院,贵州 遵义 563002;
3. 贵州大学 贵州省农业生物工程重点实验室,贵州 贵阳 550025;
4.贵州弘康药业有限责任公司,贵州 龙里 551200)
摘 要:以头花蓼种子无菌苗顶芽为外植体,MS为基本培养基,通过顶芽直接诱导丛生芽、丛芽增殖、生根、移栽,
以建立头花蓼组培快繁体系。结果表明:头花蓼最佳丛生芽诱导培养基为 MS + 6 - BA2. 0 mg /L + NAA 0. 10
mg /L,增殖倍数 7. 1;最佳芽增殖培养基为 MS + 6 - BA2. 0 mg /L + NAA0. 05 mg /L,增殖倍数为 10。组培苗生根
以1 /2MS + NAA 0. 10 mg /L 最好,生根最快,根数量最多,生根率达 100%。在腐殖土中,幼苗移栽成活率达
100%,植株生长良好。
关键词:头花蓼;种子无菌苗;丛生芽诱导;快速繁殖
中图分类号:S567. 23 + 9 文献标识码:A 文章编号:1008 - 0457(2012)06 - 0477 - 04
传统中草药的获取途径是采集野生中草药,过
量采集、消耗野生中草药及生态环境的日益恶化导
致了野生药用植物资源的匮乏[1]。目前,人们正采
用人工栽培的方法在扩大中草药药源。人工栽培
药用植物,有的生产周期长,有的因繁殖系数小、耗
种量大,发展速度慢,有的因病毒危害导致退化,严
重影响了其产量和品质[1 - 3]。通过植物组织或器
官离体培养快速繁殖药用植物种苗,或者利用组织
培养或细胞培养手段直接生产药物,可加快繁殖速
度、提高繁殖系数、防止品质退化,便于大规模生
产[1,3]。
头花蓼(Polygonum capitatum)是贵州省近十
年来中药现代化重点发展的“六大苗药”和贵州
“十五”期间重点培育发展的“七大中药产业链”中
的品种之一 [4 - 5]。贵州现有多家药厂对其需求量
较大,且逐年上升,已导致野生资源逐渐枯竭。头
花蓼主要依靠细小的种子育苗繁殖,已开展了头花
蓼种子发芽[6 - 9]、种子育苗[10 - 11]、种植[12 - 14]的相
关研究。头花蓼一年只能繁育一次,成活率受环境
气候等因子影响较大。采用组织培养方法可以快
速繁殖头花蓼种苗,对生态保护、资源利用及产业
化生产等都具有重要的意义。目前有关头花蓼组
织培养的研究,仅见毛堂芬等[15]以头花蓼带节茎
段为外植体进行组培快速繁殖,龙祥友等[16]以头
花蓼茎尖为外植体进行组培快速繁殖,其取材均受
一定时间、季节的限制。本试验以头花蓼种子无菌
萌发苗获取顶芽为外殖体,通过顶芽直接诱导丛生
芽,以建立组织培养快速繁殖体系。其取材可四季
进行,且不受时间、季节限制,目前尚未见相关研究
报道。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试种子由贵州弘康药业有限公司提供,来自
贵州兴义白碗窑,经贵州大学廖海民教授鉴定为头
花蓼种子,保存于贵州大学农业生物工程重点实验
室。
1. 2 方法
1. 2. 1 外殖体的获取 取头花蓼种子用 8%次氯
酸钠 + 30%双氧水熏蒸 24h,在超净工作台上用
75%(v /v)酒精浸泡 30 S,无菌水充分漂洗 5 次,然
后用 0. 1%(w /v)升汞溶液浸泡 4 ~ 5 min,无菌水
充分漂洗 5 次,接种于无激素 MS 培养基上,培养
15 d后转接 1 次,30 d 时切取种子无菌苗顶芽(保
山 地农业生物学报 31(6):477 ~ 480,2012
Journal of Mountain Agriculture and Biology
DOI:10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2012.06.018
留 1 ~ 2 片幼叶) ,作为研究用外殖体。
1. 2. 2 丛生芽诱导 将头花蓼无菌苗顶芽接种于
添加了 6 - BA2. 0mg /L 和不同浓度 NAA(0. 01、
0. 05、0. 10、0. 50 mg /L)的 4 种丛生芽诱导培养基
上。35 d后观察植株生长情况,统计丛生芽增殖培
数。
1. 2. 3 继代增殖 将诱导萌发的丛生芽分株,单
芽转接于添加了 6 - BA2. 0 mg /L 和 NAA(0. 05、
0. 10 mg /L)的 2 种继代增殖培养基上培养。每隔
30 d继代增殖 1 次,并观察植株生长情况,统计继
代增殖倍数。
1. 2. 4 生根 将继代增殖培养长成的约 1. 0 ~
1. 5 cm 高的植株接种在不添加或添加 NAA 0. 1
mg /L的 1 /2MS和 MS的 4 种生根培养基上。培养
15 d后观察植株生根情况和茎长势,统计生根率。
1. 2. 5 炼苗与移栽 当大部分苗根长达 2 ~ 3 cm
以上时,微敞开瓶口在培养室内炼苗 2 ~ 3 d,再敞
开瓶口在室温下炼苗 2 ~ 3 d,期间在培养瓶中加一
薄层水,使培养基保持软化。缓流水冲洗下取出幼
苗,小心洗净苗根部的残留培养基,用 0. 1%的多
菌灵溶液浸泡消毒 3 ~ 5 min,然后再用清水洗净,栽
种到预先用 0. 1%的多菌灵溶液消毒处理过的腐殖
土中,腐殖土用杯底剪 2 ~ 3 个口的塑料饮水杯分
装,每杯栽种 1株,隔天浇水 1次,保证湿度,室内培
养,15 d后观察植株生长状况,统计植株成活率。
1. 3 培养条件
以 MS为基本培养基,30 g /L 蔗糖、4 g /L 植物
凝胶和 1 mL的 0. 2 mg /mL 甘氨酸,分别附加不同
种类及浓度的激素,调 pH值至 5. 8,按植物组织培
养常规方法灭菌。
培养温度为(25 ± 2)℃,光照时间 16 h /d,光照
强度为 1 500 ~ 2 000 lx。
2 结果与分析
2. 1 NAA对顶芽直接诱导丛生芽的影响
头花蓼种子经消毒接种到 MS 培养基上培养
30 d后,从种子无菌苗上切取无菌顶芽(保留 1 ~ 2
片幼叶)并接种在丛芽诱导 MS 培养基上培养(图
1 - A ~ C)上,能正常生长,无污染,可完全用于本
试验。顶芽接种培养,10 d 后可见芽体开始膨大,
顶芽开始萌动,逐渐长出丛生芽;芽体底部逐渐长
出绿色愈伤,20 d 后少量愈伤逐渐长出小芽,NAA
浓度趆低,该现象趆容易发生。
丛生芽的诱导与培养基中 NAA 浓度关系密
切。从表 1 可以看出,在一定 6 - BA 浓度(2. 0
mg /L)条件下,NAA0. 01 ~ 0. 50 mg /L 范围内,随
NAA 浓度的升高,丛生芽的增殖倍数呈现逐渐下
降的趋势;当 NAA0. 01 mg /L 时,丛生芽的增殖倍
数最高,达 8. 40,但幼芽小、弱、不易分株;当 NAA
升至 0. 10 mg /L时,丛生芽增殖倍数降至 7. 1,幼芽
大、壮,易分株;当 NAA升至 0. 50 mg /L时,丛生芽
的增殖倍数最低,仅 6. 70 倍,且幼芽较小、少数幼芽
玻璃化(图 1 - D)。在诱芽过程中,NAA浓度趆低,
丛生芽的增殖倍数趆高,但幼芽也趆小而弱,趆不易
分株,小芽需经培养长大后才能转接进行丛芽增殖,
使诱芽时间加长。综合考虑,MS + 6 - BA2. 0 mg /L
+ NAA 0. 10 mg /L为丛生芽诱导的适宜培养基。
表 1 NAA对丛生芽诱导的影响
Tab. 1 The effect of NAA concentration
on induction of adventitious buds
激素组合
(mg/ L)
6 -BA NAA
接种外
殖体数
(株)
再生不
定芽数
(株)
增殖倍
数(倍)
植株生
长情况
2. 0 0. 01 20 168 8. 40 愈伤生芽较多,芽
小、弱、不易分株
2. 0 0. 05 20 138 6. 90 芽较大、较壮、易
分株
2. 0 0. 10 20 142 7. 10 芽大、壮,易分株
2. 0 0. 50 20 134 6. 70 芽较小、可分株;
少数芽玻璃化
2. 2 NAA对芽继代增殖的影响
单芽接种在丛生芽诱导芽较大、较壮、芽增殖
倍数较好的 3 种培养基,即添加了 6 - BA2. 0
mg /L + NAA 0. 05 mg /L、6 - BA2. 0 mg /L + 0. 10
mg /L的 MS 培养基上进行培养,10 d 后可见芽体
开始膨大,芽开始萌动,逐渐长出丛生芽;芽体底部
长出绿色愈伤,20 d 后有的愈伤逐渐长出小芽,该
现象 NAA低浓度比 NAA高浓度容易发生。
丛生芽的增殖与培养基中的 NAA浓度关系密
切。从表 2 可以看出,当培养基中含有 6 - BA2. 0
mg /L,而 NAA浓度较低(0. 05 mg /L)时,芽继代增
殖倍数高,30 d 可达 10. 00,芽较大、较粗壮,可分
株,NAA浓度较高(0. 10 mg /L)时,芽继代增殖倍
数较低,30 d 为 8. 65,芽大、粗壮、易分株(图 1 -
E)。在扩繁过程中,当培养基中的 NAA 浓度较低
(0. 05 mg /L)时,芽继代增殖倍数最高,芽多较大、
较粗壮,可分株,有利于快速繁殖,且育苗成本降
低。因此,芽继代增殖的适宜培养基是 MS + 6 -
874 山地农业生物学报 2012 年
BA2. 0 mg /L + NAA0. 05 mg /L。
表 2 NAA对芽继代增殖的影响
Tab. 2 The effect of NAA concentration
on multiplication of buds
激素组合(mg /L)
6 - BA NAA
接种外
殖体数
(株)
再生不
定芽数
(株)
增殖
倍数
(倍)
植株
生长
情况
2. 0 0. 05 20 200 10. 00 芽较大、较粗壮、
可分株
2. 0 0. 10 20 173 8. 65 芽大、粗壮、易分株
2. 3 不同生根培养基对组培苗生根的影响
头花蓼组培苗生根较容易。各种生根培养基
上,无根组培苗基部在接种 6 d 后可见白色根点,
15 d生根率均达 100%,但生根快慢、根生长情况、
苗长势均存在明显差异。从表 3 可以看出,当培养
基中含有 NAA(0. 1 mg /L)时,组培苗在 1 /2MS 培
养基上比在 MS培养基上生根快,根量多,根粗长,
但茎矮而粗壮;当培养基中不含 NAA(0. 1 mg /L)
时,组培苗在 MS培养基上比在 1 /2MS培养基上生
根快,根量多,根细长,茎高而纤细。(图 1 - F)。
在生根培养中,NAA(0. 1 mg /L)有利于头花蓼组培
苗生根,使生根快,根变粗变短且分枝增多,并有利
于苗壮而矮化;MS培养基比 1 /2MS 提供组培苗营
养更丰富,使根更细长,更高而纤细,柔嫩。因此,
头花蓼组培苗生根选择生根培养基 1 /2MS +
NAA0. 1 mg /L较好。
表 3 不同培养基对组培苗生根的影响
Tab. 3 Effects of different media on root
formation of in vitro shoots
基本
培养基
NAA
(mg /L)
接种数
(株)
生根率
(%)
根生长
情况
茎生长
情况
MS 0 50 100 多、细、最长 茎高 2. 0 ~ 7. 5 cm,
最高、纤细
MS 0. 10 50 100 多、粗、长 茎高 2. 5 ~ 5. 5 cm,
较高、较壮
1 /2MS 0 50 100 少、细、长 茎高 1. 5 ~ 4. 5 cm,
最矮、纤细
1 /2MS 0. 10 50 100 最多、粗、长 茎高 2. 0 ~ 4. 0 cm,
较高、较壮
2. 4 炼苗与移栽
挑选生根效果好的小苗室内炼苗 2 ~ 3 d,室温
下炼苗 2 ~ 3 d,然后把小苗根部的培养基小心洗净
并移栽到疏松透气的腐殖土中。移栽后浇足定根
水,室内培养,15 d 移栽苗成活率达 100%,植株生
长良好(图 1 - G)。
注:A. 15 d种子无菌苗;B. 30 d种子无菌苗;C.接种顶芽. D. 丛生芽诱导;E. 丛生芽增殖;F. 生根;G. 移栽
图 1 组培快繁体系
Fig. 1 High efficient micropropagation of Polygonum capitatum
3 讨论
毛堂芬等[15]以头花蓼的带节茎段作为接种材
料,通过芽生芽的方式研究了 NAA 0. 1 条件下 6 -
BA 0. 0 ~ 6. 0 mg / L 浓度范围内芽增殖,结果表明
6 - BA 4. 0 mg / L 时芽的增殖倍数最高,达 4. 20。
龙祥友等[16]以头花蓼顶芽作为接种材料,通过芽
生芽的方式研究了 6 - BA0. 5 ~ 2. 0 mg / L + NAA
0. 1 ~ 0. 5 mg / L条件下的芽增殖,增殖倍数为 5 ~
6 倍。本试验研究了 6 - BA2. 0 mg /L + NAA
974第 6 期 闫吉美,等:头花蓼组培快繁体系的建立
0. 01 ~ 0. 50 mg /L 条件下头花蓼种子无菌苗顶芽
直接诱导丛生芽、丛生芽增殖的影响。结果表明,
6 - BA2. 0 mg /L + NAA 0. 10 mg /L 条件下,幼芽
大,易分株,芽增殖倍数为 7. 1。6 - BA2. 0 mg /L +
NAA 0. 05 mg /L 时,幼芽多、较大,可分株,芽增殖
倍数为 10;1 /2MS + NAA0. 1 mg /L时,组培苗生根
最快,根数量最多,根粗壮、长,茎矮壮,是头花蓼组
培快繁最佳体系。本试验比前两者研究的增殖倍
数要高,这可能与不同的激素配比、不同的种子来
源及试验条件有关。
本试验以头花蓼种子无菌苗顶芽作为接种材
料,通过一步法再生获得丛生芽进行快速繁殖,有
利于保持原植物的优良遗传特性及有效成分,且
取材不受时间、季节的限制,为该药用植物的繁殖
提供了新的途径。而是否可以直接以愈伤诱芽进
行快繁,其他因子对组培快繁的效果有待作进一
步的研究。
参 考 文 献:
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Establishment of the High Efficient Micropropagation System of Polygonum capitatum*
YAN Ji-mei1,2,3,LIU Shi-hui1,3,LONG Feng-rong4,ZHAO De-gang1,3* (1. College of Life Sciences ,Guizhou
University,Guiyang,Guizhou Province 550025;2. Zunyi Normal College,Zunyi,Guizhou 563002;3.
Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering,Guizhou University,Guiyang,Guizhou Province
550025;4. Hong Kang Pharmaceutical Co.,LTD,Longli,Guizhou 551200,China)
Abstract:The micropropagation system of Polygonum capitatum had been established using apical tips of a-
septic seeding and MS basic medium in the present study. The results showed that the optimal shoot-inducing
medium was MS + 2. 0 mg /L 6-BA + 0. 10 mg /L NAA,and the proliferation coefficient was as high as 7. 27.
The optimal shoots multiplication coefficient (10)was observed from MS + 2. 0 mg /L 6-BA + 0. 05 mg /L
NAA. The best effect for root formation was obtained from the 1 /2MS supplemented with 0. 10 mg /L NAA,
from which shortest rooting time and the largest number of root were investigated,and the survival rate in
transplantation was 100% .
Key words:Polygonum capitatum;Aseptic seedling;Multiple-shoot induction;Micropropagation
084 山地农业生物学报 2012 年