全 文 ：殷 勤，杜尚广，张 青，等． 互叶白千层的快繁技术［J］． 江苏农业科学，2015，43(3) :20 － 24．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 03． 006
互叶白千层的快繁技术
殷 勤，杜尚广，张 青，罗丽萍
(南昌大学生命科学学院，江西南昌 330031)
摘要:为研究出一套完整的互叶白千层快繁技术体系，以互叶白千层幼苗茎段为外植体，分别以诱导率、增殖倍
数、生根率为指标，采用正交试验对芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基、生根培养基进行优化。结果表明，最佳诱导培
养基为 MS + 0． 01%活性炭 + 0． 1 mg /L 6 － BA + 0． 05 mg /L NAA，诱导率为 82． 8%;最佳增殖培养基为MS + 30 g /L蔗
糖 + 0． 25 mg /L 6 － BA，增殖倍数为 31 倍;最佳生根培养基为 1 /2 MS + 30 g /L蔗糖 + 0． 1 mg /L NAA，生根率达 100%，
移栽 30 d后成活率达 80%以上。研究结果为互叶白千层的工厂化育苗提供了技术参考。
关键词:互叶白千层;快速繁殖;正交试验;芽诱导;丛生芽增殖;生根
中图分类号:Q945． 51 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)03 － 0020 － 04
收稿日期:2014 － 06 － 17
基金项目:江西省研究生创新专项资金(编号:YC2012 － S019)。
作者简介:殷 勤(1990—) ，女，云南曲靖人，硕士研究生，研究方向
为植物资源开发与利用。E － mail:yinqin2012@ 163． com。
通信作者:罗丽萍，教授，研究方向为植物资源开发与利用。
E － mail:lluo2@ 126． com。
互叶白千层(Melaleuca alternifolia)为桃金娘科(Myrtace-
ae)白千层属 (Melateuca)常绿小乔木，原产于澳大利亚的新
南威尔士州和新西兰的部分地区［1］，是近年我国成功引进的
高价值经济植物及绿化树种。互叶白千层对污染物有很强的
净化能力［2 － 4］，可用于构建植物浮床［5］。互叶白千层的新鲜
枝叶和树干提取的精油俗称茶树油，可以高效、无毒、无刺激
地杀死人体皮肤表面的真菌和细菌［6 － 9］，并对某些病毒也有
抑制作用［10 － 11］，是一种强效的抗菌剂［12 － 17］、杀虫剂［18 － 20］、芳
香剂［21］、防腐剂［22］，是不可多得的天然保健医药材料，广泛
应用于制药、日化、食品、香料等行业。因此，种植互叶白千层
具有巨大的生态和经济效益。
目前，国内外对互叶白千层的研究主要集中在其精油的
提取、成分分析及作用等方面［23 － 24］，而对利用组织培养技术
进行再生植株的研究较少，目前尚没有完整的快繁技术体系。
依据精油化学成分含量的不同，互叶白千层分为 6 种［25］，其
中仅松油醇 － 4 型优良品种提取的精油成分满足国际标
准［26］。为获得品种优良的互叶白千层，使用种子繁殖多败
育，发芽率很低［27］，且后代易产生变异，难以保持亲本优良性
状;扦插繁殖生根率虽高［28］，但成活率较低［29］。组织培养既
可以保持亲本的优良性状，又可以将获得的优良株系快速推
广应用于生产，有望成为互叶白千层产业化育苗的主要繁殖
手段。
本试验以互叶白千层茎段为材料，进行表面灭菌处理，对
诱导培养基、增殖培养基、生根培养基进行筛选，并对试管苗
驯化移栽，拟建立一套完整的互叶白千层快繁技术体系，为互
叶白千层的优株选育提供理论依据，为其工厂化育苗提供技
术参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
互叶白千层为温室栽培植株，株高 20 cm，由江西抚州市
森源生物科技有限公司提供。
1． 2 仪器
W － CJ － 2FD 洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公
司生产)，LMQJ型立式灭菌锅(山东新华医疗器械股份有
限公司生产) ，JY2002 电子分析天平(精密科学仪器有限
公司生产) ，JA1003N 电子天平(精密科学仪器有限公司
生产)。
1． 3 方法
1． 3． 1 外植体的表面灭菌及预处理 培养 60 d的温室种植
的互叶白千层幼苗，株高 30 cm，在 20 cm处去顶。30 d后，随
机剪取 5 cm 的幼苗茎段，剪去部分叶片，用洗衣粉液浸泡
30 min，流水冲洗 2 h;70%乙醇处理 30 s，无菌水洗 3 次，然后
用 0． 1% HgCl2 处理 3 min，无菌水洗 4 次，待用;去掉茎段顶
部，剪取约 1 cm、含 4 ～ 5 个节点的茎段，接种到诱导培养基
中。为了降低酚类物质氧化褐变引起的生长抑制，在第 3 天
将茎段转接到新的培养基中。
1． 3． 2 诱导培养基的优化 采用 3 因素 4 水平 L16(4
3)正交
试验。各因素水平见表 1。共 16 组固体培养基，每组 8 瓶，
每瓶 5 个茎段;30 d后统计长芽的外植体数、芽数，并计算诱
导率。诱导率的计算公式如下:
诱导率 = 诱导出芽的外植体数 ÷ 接种的外植体数 ×
100%。
表 1 诱导培养基优化的 3 因素 4 水平正交试验表
水平
因素
A:活性炭
(%)
B:6 － BA
(mg /L)
C:NAA
(mg /L)
1 0． 01 0． 1 0． 05
2 0． 03 0． 5 0． 10
3 0． 05 1． 0 0． 15
4 0． 07 1． 5 0． 20
—02— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 3 期
1． 3． 3 增殖培养基的优化 采用 3 因素 4 水平 L16(4
3)正交
试验。各因素水平见表 2。共 16 组液体培养基，每组 16 瓶，
每瓶 5 个诱导出单芽的茎段;60 d后统计丛生芽数，并计算增
殖倍数。增殖倍数的计算公式如下:
增殖倍数 =丛生芽数 ÷接种的外植体数 × 100%。
表 2 增殖培养基优化的 3 因素 4 水平正交试验表
水平
因素
A:蔗糖
(g /L)
B:6 － BA
(mg /L)
C:NAA
(mg /L)
1 25 0． 125 0
2 30 0． 250 0． 05
3 35 0． 500 0． 10
4 40 1． 000 0． 20
1． 3． 4 生根培养基的优化 采用 4 因素 3 水平 L9(3
4)正交
试验。各因素水平见表 3。共 9 组固体培养基，每组 10 瓶，
每瓶 5 个幼枝茎段;30 d后统计生根的外植体数，并计算生根
率。生根率的计算公式如下:
生根率 =生根的外植体数 ÷接种的外植体数 × 100%。
表 3 生根培养基优化的 4 因素 3 水平正交试验表
水平
因素
A:培养基 B:蔗糖
(g /L)
C:NAA
(mg /L)
D:IAA
(mg /L)
1 1 /4MS 15 0 0
2 1 /2MS 20 0． 1 0． 1
3 MS 30 0． 5 0． 5
1． 3． 5 移栽 生根培养 30 d后，将试管苗转移到室外炼苗，
散射光光照培养 10 ～ 20 d，当组培苗抽高生长，木质化程度加
强时，即可移栽。取出试管苗，清洗根部，再用 0． 1%高锰酸
钾溶液消毒 30 s，自来水清洗除去残留的高锰酸钾，然后把试
管苗移栽至含基质(泥炭 ∶ 珍珠岩 = 1 ∶ 1)的花盆里，遮阳网
遮阳，将 1 L的塑料饮料容器底部剪掉，罩在试管苗上，保持
幼苗周围湿润。14 d 后，遮阳网部分移除，容器一侧抬起以
露出植物。再过 7 d后，遮阳网移除，移走容器。移栽 30 d后
统计成活率。
1． 4 培养条件
温度(25 ± 2)℃，光照 12 h /d，光照强度 2 500 ～
3 000 lx。诱导培养基、增殖培养基和生根培养基的基础培养
基均为 MS培养基，通过添加各种不同浓度的激素或蔗糖、MS
成分减半进行优化;固体培养基中加 7． 0 g /L 琼脂，调 pH 值
为 5． 8;液体培养基不加琼脂，不调节 pH 值，实际测得 pH 值
为 5． 2。
2 结果与分析
2． 1 诱导培养基的优化
互叶白千层茎段在诱导培养基上培养 30 d，统计结果见
表 4。极差分析表明，3 个因素对互叶白千层芽诱导的影响大
小依次为:NAA ＞活性炭 6 － BA。随着 NAA 浓度的增加，诱
导率呈下降趋势;当活性炭浓度为 0． 01%、6 － BA 浓度为
0． 1 mg /L、NAA 浓度为 0． 05 mg /L 时，诱导出芽数是 2． 46
个，诱导率是 82． 8%。方差分析表明，3 个因素对诱导率及芽
数无显著影响(表 5、表 6)。
芽诱导主要是已有芽原基在解除顶端优势之后的萌发。
本试验结果表明，不同培养基对外植体的诱导率及芽数无显
著影响，最佳诱导效果的培养基为:MS + 0． 01% 活性炭 +
0． 1 mg /L 6 － BA +0． 05 mg /L NAA。
表 4 互叶白千层芽诱导的正交试验结果
处理
因素
A:活性炭 B:6 － BA C:NAA
诱导率
(%)
芽数
(个)
1 1 1 1 82． 8 2． 46
2 1 2 2 63． 6 2． 24
3 1 3 3 70． 0 2． 10
4 1 4 4 51． 4 2． 50
5 2 1 2 65． 7 2． 04
6 2 2 1 63． 9 2． 30
7 2 3 4 66． 7 1． 77
8 2 4 3 73． 0 2． 19
9 3 1 3 51． 7 2． 00
10 3 2 4 52． 8 1． 58
11 3 3 1 66． 7 2． 50
12 3 4 2 75． 0 2． 33
13 4 1 4 69． 2 2． 19
14 4 2 3 74． 4 2． 66
15 4 3 2 66． 7 2． 10
16 4 4 1 60． 5 1． 74
k1(诱导率) 67． 0 67． 4 68． 5
k2(诱导率) 67． 3 63． 7 67． 8
k3(诱导率) 61． 6 67． 5 67． 3
k4(诱导率) 67． 7 65． 0 60． 0
Ｒ 6． 1 3． 8 8． 5
表 5 互叶白千层芽诱导正交试验的诱导率的方差分析
来源 Ⅲ型平方和 自由度 均方 F值 显著性
模型 329． 201 9 36． 578 0． 270 0． 961
活性炭 101． 177 3 33． 726 0． 249 0． 860
6 － BA 42． 192 3 14． 064 0． 104 0． 955
NAA 185． 832 3 61． 944 0． 457 0． 722
误差 813． 484 6 135． 581
总计 70 588． 110 16
注:“* ”表示差异显著，“＊＊”表示差异极其显著。下同。
表 6 互叶白千层芽诱导正交试验的芽数的方差分析
来源 Ⅲ型平方和 自由度 均方 F值 显著性
模型 0． 310 9 0． 034 0． 202 0． 983
活性炭 0． 148 3 0． 049 0． 290 0． 832
6 － BA 0． 015 3 0． 005 0． 029 0． 993
NAA 0． 147 3 0． 049 0． 287 0． 833
误差 1． 025 6 0． 171
总计 76． 543 16
2． 2 增殖培养基的优化
互叶白千层芽诱导后在液体培养基中增殖培养 60 d，增
殖倍数的统计结果见表 7。极差分析表明，3 个因素对互叶白
千层芽增殖的影响大小依次为:NAA ＞ 6 － BA ＞蔗糖。随着
NAA浓度的增加，增殖倍数呈下降趋势，当 NAA 浓度为 0 时
—12—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 3 期
增殖倍数最高。随着 6 － BA浓度的增加，增殖倍数先增大后
减小，当 6 － BA浓度达 0． 250 mg /L时增殖倍数最高，这可能
是由于低浓度的 6 － BA促进细胞分裂，而高浓度的 6 － BA则
抑制细胞分裂。随着蔗糖浓度的增加，增殖倍数先增大后减
小，当蔗糖浓度达 30 g /L 时，增殖倍数最高。方差分析表明
(表 8)，NAA对增殖倍数影响达显著水平(P ＜ 0． 05)。互叶
白千层芽增殖的最佳培养基组合为:MS + 30 g /L 蔗糖 +
0. 25 mg /L 6 － BA，增殖倍数达 31 倍。
表 7 互叶白千层芽增殖的正交试验结果
处理
因素
A:蔗糖 B:6 － BA C:NAA
增殖倍数
1 1 1 1 16． 25
2 1 2 2 3． 87
3 1 3 3 2． 00
4 1 4 4 2． 00
5 2 1 2 10． 88
6 2 2 1 31． 00
7 2 3 4 2． 25
8 2 4 3 0． 00
9 3 1 3 3． 56
10 3 2 4 3． 65
11 3 3 1 7． 10
12 3 4 2 1． 00
13 4 1 4 1． 74
14 4 2 3 4． 95
15 4 3 2 4． 21
16 4 4 1 4． 13
k1(增殖倍数) 6． 03 8． 11 14． 62
k2(增殖倍数) 11． 03 10． 87 4． 99
k3(增殖倍数) 3． 83 3． 89 2． 63
k4(增殖倍数) 3． 76 1． 78 2． 41
Ｒ 7． 27 9． 09 12． 21
表 8 互叶白千层芽增殖正交试验的方差分析
来源 Ⅲ型平方和 自由度 均方 F值 显著性
模型 738． 884 9 82． 098 2． 989 0． 098
蔗糖 139． 883 3 46． 628 1． 697 0． 266
6 － BA 201． 075 3 67． 025 2． 440 0． 162
NAA 397． 926 3 132． 642 4． 829 0． 049*
误差 164． 810 6 27． 468
总计 1 511． 194 16
List 等采用单因素试验获得的增殖培养基为 MS 固体培
养基 + 1． 0 mg /L BA，培养时间为 63 d，增殖倍数为 5． 5
倍［30］。De Oliveira等同样用单因素试验获得的增殖培养基
为 MS液体培养基 + 0． 25 mg /L BA，培养时间为 56 d，增殖倍
数为 11. 8 倍［31］。樊吉尤等用不同激素组合进行试验，结果
表明较好的激素组合是 0． 8 mg /L 6 － BA + 0． 01 mg /L
2，4 － D，增殖倍数为 14． 88 倍［32］。本研究通过正交试验，获
得了最佳的增殖培养基，增殖倍数达 31 倍，而且丛生芽较粗
壮，呈深绿色(图 1 － C)，结果显著好于已往报道。主要原因
有:(1)互叶白千层通常生长在沼泽中［33］，喜酸性或微酸性土
壤［34 － 35］，本试验使用的液体培养基，pH 值为 5． 2，适合其生
长;(2)以往研究一般在培养基中仅添加 NAA，本试验将其设
定为因素之一，结果表明，NAA 与增殖倍数呈负相关，不加
NAA的第 6 处理的培养基效果最佳;(3)本试验使用的是液
体培养基，养分交换非常充分，营养物质可以更好地被
吸收［31］。
由表 7 可知，第 8 处理的培养基中外植体的增殖倍数为
0，观察发现该组培养基中的外植体无明显生长，逐渐变成褐
色，可能原因是激素配比不利于芽的生长，同时液体培养基中
氧气含量比较低，外植体易发生缺氧坏死。
2． 3 生根培养基的优化
生根培养 30 d后，生根率统计结果见表 9。极差分析表
明，对互叶白千层生根率的影响大小依次是:NAA ＞基本培养
基 = IAA ＞蔗糖。由表 9可知，所有培养基的生根率都在 80%
以上，第 6 处理的生根率和根系发达程度最高。观察可知，该
处理试管苗根系发达，有 3 级根，一级根上生成粗细不同的二
级根，并且在粗二级根上形成三级根，各级根上均有少量根
毛;在以后炼苗时发现，这样的根系更加有利于移栽成活。因
此，最佳生根培养基是含 30 g /L 蔗糖、0． 1 mg /L NAA 和
0 mg /L IAA的 1 /2MS培养基。
2． 4 移栽
幼苗移栽是试管苗从实验室适宜生长环境到复杂外界环
境，并发生从异养到自养的转变过程。因此，移栽前要进行炼
苗，让试管苗更好地适应自然环境。在本试验中，经过炼苗，
幼苗的地上、地下部分均具有较强木质化，移栽成活率达
80%以上;其中，茎部粗壮、叶片浓绿、根系发达的幼苗，移栽
时更易成活。
—22— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 3 期
表 9 互叶白千层生根的正交试验结果
处理
因素
A:培养基 B:蔗糖 C:NAA D:IAA
生根率
(%) 生根状况
1 1 1 1 1 96． 1 根数多，细长
2 1 2 2 2 98． 2 根数多，细短
3 1 3 3 3 81． 8 根数多，细短
4 2 1 3 2 80． 0 根数少，粗壮
5 2 2 1 3 93． 0 根数少，粗壮
6 2 3 2 1 100． 0 根数多，粗壮
7 3 1 2 3 98． 1 根数少，粗壮
8 3 2 3 1 84． 9 根数少，粗壮
9 3 3 1 2 98． 1 根数少，细长
k1 92． 0 91． 4 95． 7 93． 7
k2 91． 0 92． 0 98． 8 92． 1
k3 93． 7 93． 3 82． 2 91． 0
Ｒ 2． 7 1． 9 16． 6 2． 7
3 结论
通过正交试验得出互叶白千层外植体的最佳诱导培养基
为 MS +0． 01%AC + 0． 1 mg /L 6 － BA + 0． 05 mg /L NAA，诱
导率达 82． 8%;最佳增殖培养基为 MS + 30 g /L 蔗糖 +
0． 25 mg /L 6 － BA，增殖倍数达 31 倍;最佳生根培养基为
1 /2 MS + 30 g /L 蔗糖 + 0． 1 mg /L NAA，生根率达 100%;移
栽 30 d 后，成活率达 80%以上。研究结果为互叶白千层的
工厂化育苗提供了科学依据。
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doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 03． 007
基于多个核基因序列的 1 株皮伞属菌株的鉴定
李 芳
(滨州学院化学工程系，山东滨州 256600)
摘要:提取在北京市房山地区野外环境中采集的 1 株野生菌子实体的基因组 DNA，并以此为模板进行 ITS、LSU
和 SSU片段的扩增、测序及比对分析。结果发现，从菌丝体基因组 DNA中扩增获得了 700 bp左右的 ITS片段、850 bp
左右的 LSU片段和 1 800 bp左右的 SSU片段，经序列测定及比对，表明该真菌是 Marasmiellus属菌株。建立了一种野
生真菌快速、准确的鉴定方法。
关键词:皮伞属;分子鉴定;ITS;LSU;SSU
中图分类号:S646． 01 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)03 － 0024 － 02
收稿日期:2014 － 04 － 17
作者简介:李 芳(1981—) ，女，山东滨州人，硕士，讲师，从事分子
生物学研究。E － mail:lifang1981@ 126． com。
我国地域广阔，野生食用菌资源丰富、种类繁多、分布广
泛、蕴藏量大。野生食用菌分类鉴定是涉及资源保护利用及
产业发展的一项基础性研究工作［1］。随着分子生物学技术
的广泛应用，从分子的层面上对野生菌进行快速、有效的鉴
定，为野生菌的鉴定、开发及利用提供了很大的便利［2］。本
研究对北京市房山地区采集的 1 株野生菌进行分子鉴定，并
通过多个核基因序列的测定及比对分析，从而对该野生菌株
的遗传地位进行解析，为该野生菌的开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 试验材料 子实体，采集自北京市房山区东湖港风景
区的野生菌。
1． 1． 2 试剂 基因组 DNA提取试剂盒 Dneasy Plant Mini Kit
和凝胶回收试剂盒 QIAquick Gel Extraction Kit购自德国 QIA-
gen公司;TaKaＲa PCＲ Mix购自大连宝生物公司;琼脂糖购自
Invitrogen公司。
1． 1． 3 仪器 PCＲ 仪(BIO － ＲAD，mycycler)、凝胶成像系统
(BIO － ＲAD)、电泳仪(北京六一 DYY －Ⅲ － 12B)、离心机
(Eppendorf 5418)、移液器(Eppendorf)等。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA 的提取 取少量子实体于 1． 5 mL离心
管中，加入少量液氮，研磨棒研磨至粉末状后，利用 Dneasy
Plant mini Kit试剂盒(QIAgen，货号:69104)说明书进行 DNA
的提取。
1． 2． 2 ITS － PCＲ 扩增 选取 ITS5 (5 － GGAAGTA-
AAAGTCGTAACAAGG － 3)和 ITS4(5 － TCCTCCGCTTATT-
GATATGC －3)为引物［3］，以所提基因组 DNA 为模板进行
PCＲ 扩增。扩增程序为:95 ℃预变性 5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃
1 min，72 ℃ 30 s，30 个循环;72 ℃ 7 min;降至 4 ℃结束。反
应体系为 50 μL。然后进行电泳检测。
1． 2． 3 LSU － PCＲ 扩增 选取 LＲ5(5 － TCCTGAGG-
GAAACTTCG － 3，http:/ /biology． duke． edu / fungi /mycolab /
primers． htm)和 LＲOＲ(5 － ACCCGCTGAACTTAAGC － 3，
http:/ /biology． duke． edu / fungi /mycolab /primers． htm)为引物，
以所提基因组 DNA 为模板进行 PCＲ 扩增。扩增程序为:
95 ℃预变性 5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 60 s，30 个
循环;72 ℃ 10 min;降至 4 ℃结束。反应体系为 50 μL。然后
进行电泳检测。
1． 2． 4 SSU － PCＲ 扩增 选取 NS1(5 － GTAGTCATATGCT-
TGTCTC － 3， http:/ /biology． duke． edu / fungi /mycolab /
primers． htm)和 NS8(5 － TCCGCAGGTTCACCTACGGA － 3，
—42— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 3 期